肺炎链球菌的检测与分型技术
肺炎链球菌检测-菌落形态鉴定 Colony Morphology Test
中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所呼吸道传染病室
肺炎链球菌相关实验技术操作手册
菌落形态鉴定
（Colony Morphology Test ）
试验开始前，请准备：
哥伦比亚血琼脂平板于室温下平衡至少20min。
试验步骤：
1.将疑似标本以三区划线方式接种于哥伦比亚血琼脂平板上。
℃2条件下培养18-20h。
2.35 5%CO
3.挑取疑似菌落，典型菌落形态：脐窝状，灰白色，半透明，草绿色溶菌环。
常见肺炎链球菌菌落形态：草绿色溶血环，灰白色、表面光滑、扁平的可疑菌落；或草绿色溶血环，中央塌陷、边缘隆起、呈脐窝状的可疑菌落；或草绿色溶血环，表面光滑、湿润有粘液的可疑菌落。
4.挑取单个疑似肺炎链球菌菌落，接种于哥伦比亚血琼脂平板上，35℃条件下
培养18-20h。
5.进行其他肺炎链球菌特异性鉴定。
将菌落形态观察结果及时添加至
Streptococcus pneumoniae isolates data bank。
本手册仅供实验室内部使用 2011年第1
版。
肺炎链球菌研究现况及血清分型
04 肺炎链球菌的预防和控制
疫苗接种的重要性
疫苗接种是预防肺炎链球菌感染的最 有效手段，通过接种疫苗可以显著降 低肺炎链球菌的发病率和死亡率。
疫苗接种的策略因地区而异，但通常 建议对高风险人群进行接种，如儿童、 老年人、身体虚弱者以及免疫系统受 损者。
目前已有多种肺炎链球菌疫苗，包括 多糖疫苗和结合疫苗，这些疫苗可以 针对不同血清型的肺炎链球菌提供保 护。
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探索肺炎链球菌的毒力因子
01
深入研究肺炎链球菌的毒力因子及其作用机制，为开发新型药
物和疫苗提供理论支持。
解析肺炎链球菌与宿主细胞的相互作用
02
研究肺炎链球菌如何与宿主细胞相互作用，导致感染和疾病的
发生，揭示其致病机制。
探索肺炎链球菌的耐药机制
03
研究肺炎链球菌对抗生素的耐药机制，为抗生素药物的研发提
详细描述
荚膜多糖是肺炎链球菌的主要抗原，不同血清型具有不同的 荚膜多糖抗原，通过检测荚膜多糖抗原可以区分不同血清型 。目前已经发现了超过90种不同的荚膜多糖抗原，对应不同 的血清型。
分子分型方法
总结词
分子分型方法是一种基于肺炎链球菌基因组序列差异的分型方法，具有高分辨率和高重复性。
详细描述
分子分型方法通过比较肺炎链球菌基因组的序列差异，如单核苷酸多态性、插入序列、重复序列等，来确定不同 菌株之间的差异。这种方法能够更精确地区分不同菌株，对于流行病学调查和疾病控制具有重要意义。
抵抗力
抵抗力较强，对一般消毒 剂敏感，对青霉素等抗生 素敏感。
肺炎链球菌的致病性
致病物质
荚膜、自溶酶、神经氨酸 酶、表面蛋白等。
感染途径
主要通过呼吸道飞沫传播， 也可通过接触污染物体表 面或污染水源传播。
肺炎链球菌活菌数含量的测定操作规程
肺炎链球菌活菌数含量的测定操作规程1.引言肺炎链球菌是一种常见的呼吸道病原微生物，对于疾病的防控具有重要意义。
测定肺炎链球菌的活菌数含量是判断疾病传播性和临床治疗效果的重要指标。
本文档旨在规范肺炎链球菌活菌数含量的测定操作，确保测定结果的准确性和可靠性。
2.实验所需材料肺炎链球菌培养基冰箱分装管微量移液管、移液器和吸头显微镜细菌计数板和计数室3.实验步骤1.取一小瓶肺炎链球菌培养基放置于冰箱中冷藏，保持4℃。
2.取适量肺炎链球菌培养基，分装于无菌分装管中，避免反复冻融，可存放在-20℃的冰箱内长期保存。
3.取一支肺炎链球菌分离菌株，用无菌吸头取适量细菌液，接种于肺炎链球菌培养基中。
4.将接种好的培养基放置于恒温摇床中，在37℃恒温箱中培养24小时。
5.取培养好的细菌液，用无菌吸头吸取适量的细菌悬液，放置在显微镜片上。
6.用显微镜观察细菌悬液中的活菌，计数并记录。
7.将细菌计数板放置在计数室中，将观察到的活菌在计数板上记录。
4.实验注意事项所用材料必须无菌，以防止其他微生物的污染。
活菌的计数应在24小时内完成。
活菌数的检测应重复3次并取平均值。
实验环境应保持洁净，避免灰尘和其他污染物对实验结果造成干扰。
5.结果记录与分析根据实验步骤所得的数据，计算平均活菌数含量，并记录在实验数据表中。
通过对不同样本的活菌数进行比较和分析，可以了解肺炎链球菌的传播程度和感染风险。
6.结论本操作规程提供了一种测定肺炎链球菌活菌数含量的标准化方法，经过验证具备准确性和可靠性。
科学使用本操作规程可以为疾病的早期预防和传播控制提供重要的实验数据支持。
注意：本操作规程仅供参考，具体实施过程请根据实验条件和要求进行调整。
肺炎链球菌鉴定流程
肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌（肺炎链球菌属）是导致人类社区获得性肺炎（CAP）最常见的病原体之一。
准确鉴定肺炎链球菌对于指导适当的抗菌治疗和监测抗菌剂耐药性的出现至关重要。
该鉴定过程涉及多个步骤，包括：革兰氏染色：革兰氏染色是鉴定肺炎链球菌的第一步，因为它是一种革兰氏阳性球菌，通常成链状排列。
形态学检查：通过显微镜检查革兰氏阳性标本，可以观察到肺炎链球菌的典型的链球菌形态。
链条的长度和排列模式可能因菌株而异。
荚膜染色：肺炎链球菌具有多糖荚膜，可通过荚膜染色技术（例如，奎肯斯泰特染色）显现出来。
荚膜的存在是肺炎链球菌鉴定的关键特征。
血清学检测：血清学检测，如奎肯斯泰特试验，可用于确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
肺炎链球菌的荚膜由不同的血清型组成，每种血清型与不同的抗原性决定簇（PSA）相关。
生物化学测试：多种生物化学测试可用于确认肺炎链球菌的鉴别，包括：溶血反应：肺炎链球菌通常在绵羊红细胞琼脂平板上显示β溶血反应。
胆盐耐受性：肺炎链球菌可耐受高浓度的胆汁盐，这是区分其与其他链球菌的重要特征。
尿素酶活性：肺炎链球菌通常产生尿素酶，可水解尿素。
分子诊断：分子诊断方法，如聚合酶链反应（PCR），可用于快速鉴定肺炎链球菌，尤其是在培养困难的情况下。
PCR检测靶向肺炎链球菌基因，如lytA或cpsA。
抗菌剂敏感性测试：进行抗菌剂敏感性测试对于指导针对肺炎链球菌的适当治疗至关重要。
通常使用琼脂稀释法或扩散法来确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
鉴定肺炎链球菌的流程通常涉及以下步骤：1. 革兰氏染色：确定标本中是否存在革兰氏阳性球菌。
2. 形态学检查：观察革兰氏阳性球菌的链球菌形态。
3. 荚膜染色：显示肺炎链球菌荚膜的存在。
4. 血清学检测：确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
5. 生物化学测试：进行溶血反应、胆盐耐受性和尿素酶活性测试以确认鉴别。
6. 分子诊断：如有必要，进行PCR检测以快速鉴定肺炎链球菌。
7. 抗菌剂敏感性测试：确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
肺炎链球菌分型技术-多位点序列分型
多位点序列分型 （Multi Locus Sequence Typing）
试验开始前，请准备： 冰浴。扩增体系配制及样品添加过程需在冰浴上操作。 将冷冻保存的试剂取出， 室温放置融化后冰浴上备用； Taq 酶直接放置在冰浴上。 1.5%琼脂糖凝胶（含 DNA 染料 4µl/100ml） 。 试验步骤： 1. 待测样品的 DNA 制备； 冷冻保存的 DNA 室温下自然融化后， 冰浴放置备用。 2. 扩增体系配置（50µl/reaction） ：
编写人:limachao@
肺炎链球菌相关实验技术操作手册
4. 扩增产物验证：将扩增产物于 1.5%琼脂糖凝胶（含 DNA 染料 4µl/100ml） ， 100V，电泳 40min；片段长度 600-800bp。 5. 产物纯化后，连同相应的测序引物送交测序公司测序（每个样品配 5µl 上、 下游测序引物，引物浓度 10µM） 。 6. 得 到 序 列 信 息 后 ， 递 交 到 相 关 网 站 进 行 序 列 比 对 ， 确 定 ST ， /sql/singlelocus.asp ； 将 分 型 结 果 及 时 添 加 至 Streptococcus pneumoniae isolates data bank。
Reference */misc/info.asp
编写人:limachao@
成分名称 10Xbuffer（含 MgCl2） dNTP（10mM） Primer F（20µM） Primer R（20µM） Taq（5U/µl） DNA H2O 体积（µl）3. 扩增条件：
步骤 预变性 循环-1 循环-2 循环-3 温度 94℃ 94℃ 56℃ 72℃ 30 个循环 延伸 保存 72℃ 4℃ 5min 时间 3min 30s 30s 30s
肺炎链球菌研究现况及血清分型
WHO. Weekly Epidemiol Rec 2008;83:1–16
2000年，全球5岁以下儿童肺炎链球菌感染疾病负担估计
1.
1450万肺炎球菌感染病例 ，发病率为2331/10万。 – – 肺炎病例1380万（95.6%），占到所有肺炎病例（16000万）的 8.6%。 脑膜炎病例（10.3万）0.7%，发病率估计为17/10万。
WHO对全球尚未普种/或即将有疫苗可预防疾病的分类
极高度优先 肺炎链球菌性疾病 疟疾* 霍乱 登革热* 乙型脑炎 高度优先 人乳头瘤病毒感染 中度优先 甲型肝炎 戊型肝炎* 流行性脑脊髓膜炎（B）* 腮腺炎
流行性脑脊髓膜炎（ACW135Y） 风疹
狂犬病 轮状病毒感染 季节性流行性感冒
伤寒 黄热病
水痘
5%
中国, 12%
3% 3% 3% 5% 4% 2%
印度
2%
中国 尼日利亚
巴基斯坦
孟加拉
印度尼西亚
埃塞俄比亚
印度, 27%
34%
刚果
肯尼亚
菲律宾
其他
2000年全球5岁以下儿童肺炎球菌感染死亡病例数
国家（死亡病例数）
1. India (142 000) 2. Nigeria(86 000) 3. Ethiopia (57 000) 4. Congo (51 000) 5. Afghanistan (31 000) 6. China (30 000) 7. Pakistan (27 000) 8. Bangladesh (21 000) 9. Angola (20 000) 10.Uganda (19 000)
–
NPNM病例（53.8万） 3.7%
2. 82.6万死亡，5岁以下儿童死亡病例的11% （不包括HIV阳性儿童)。
肺炎链球菌检验
3
生物标记物发现
质谱技术可以发现与肺炎链球菌感染相关的生物 标记物，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
生物信息学在肺炎链球菌检验中的应用
数据整合与分析
01
生物信息学可以对来自不同实验平台的数据进行整合和分析，
挖掘肺炎链球菌感染相关的生物标志物和药物靶点。
药物设计
02
基于生物信息学方法，可以预测和设计针对肺炎链球菌的新型
兼性厌氧菌
肺炎链球菌为兼性厌氧菌，在 有氧或无氧环境下均能生长。
营养要求高
肺炎链球菌对营养要求较高， 需要丰富的铁、维生素B等才
能正常生长。
肺炎链球菌的致病性
01
02
03
致病物质
肺炎链球菌主要通过产生 毒素和酶致病，如荚膜多 糖、溶血素等。
感染途径
感染主要通过呼吸道飞沫 传播，也可通过接触污染 物品传播。
设备和专业操作。
药敏试验
总结词
药敏试验用于检测肺炎链球菌对抗菌药物的敏感性和耐药性，指导临床合理用药。
详细描述
药敏试验通过在培养基上接种肺炎链球菌，并添加不同抗菌药物，观察细菌的生长情况，从而判断细菌对抗菌药 物的敏感性和耐药性。药敏试验对于临床医生选择合适的抗菌药物具有重要意义，能够指导临床合理用药，提高 治疗效果并减少耐药性的产生。
疾病类型
感染后可引起大叶肺炎、 脑膜炎、中耳炎等多种疾 病。
肺炎链球菌的流行病学
季节性流行
肺炎链球菌感染有明显的 季节性，冬季和春季是高 发季节。
人群易感性
儿童、老年人、身体虚弱 者及免疫功能低下者易感。
地区分布
全球范围内均有肺炎链球 菌感染的报道，但发病率 和病死率存在地区差异。
02
肺炎链球菌检测讲解
国外感染情况
在美国，每年侵袭性SP感染的发生率为72103/10万儿童，而欧洲为10-24/10万儿童/年。 每年约有600多万例中耳炎由SP引起，占急性 中耳炎30-50％；在发展中国家，每年约有 500万5岁以下儿童死于SP引起的肺炎，10-50 万儿童死于SP引起的脑膜炎。（2005年）
2 配制PBS溶液，并分装小试管，每管约 0.5mL，用亚甲蓝粉配制0.1％的亚甲蓝试剂。
SP血清学分型步骤：
3 用接种环挑取经次代培养后的肺炎链球菌菌 落，放入小试管中，制成菌悬液约0.5麦氏单 位浓度。
4 用接种环挑取约10μL菌悬液放入载玻片上， 再挑取同量的诊断血清（10μl）放入载玻片上， 并与菌悬液搅拌混匀。
本地区耐药情况
对红霉素、四环素、复方新诺明、 克林霉素和氯霉素的多重耐药情况较为 严重，多重耐药发生率为75%，高于北 京、上海、杭州地区。
SP培养呼吸道标本的运输和保存
尽快送检，要求2h内送到；
肺炎链球菌延迟送检极有可能死亡，而且不适合4℃ 保存；
标本处理前检测是否合格。
痰标本合格的标准：
痰标本 鳞状上皮细胞 白血球 细菌种类
合格
<=10/低倍 >=10
1-3种
不合格 >=25/低倍 <=10
>3种
培养特性
初次分离需要CO2，采用CO2培养箱较好； 18-24h形成细小、圆形、湿润、自溶的菌落，
保存 挑选新鲜培养物置于保存管中，-76℃ 保存。
复活 取出保存管自然平衡至室温，接种适合 平板。
SP血清学分型：
肺炎链球菌的血清分型可以为肺炎链球菌疫苗 研究提供可靠依据，也是一种流行病学调查手 段。
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肺炎链球菌定植与扩散
鼻窦
脑膜
鼻
鼓膜
血管 肺
肺 骨骼
至少有60%的健康学龄前儿童、30%的健康学龄儿童
与成人在鼻咽部携带有肺炎球菌
无症状携带者
鼻腔
鼻咽部： 移殖部位
气溶胶
吸入
气管
肺炎球菌 疾病患者
扩散
Musher DM. In Mandell G, Bennett JE, Dolin R editors. Principles and practice of infectious disease. 4th ed. New York, USA: Churchill Livingstone, Inc.; 1995. p.1811-26
.
急性中耳炎: 容易被忽略的感染
肺炎球菌会导致 •31-33%的急性中耳炎 •40%治疗失败 •长期或复发中耳炎: 50%的病例分离的细菌里，80%对青霉素耐药
Gehanno P et al.. PIDJ 2001; 20:570-3. Maillet F. 1998 à2000 BEH n°42/2002:207-8. Gehanno P et al.. PIDJ 1998; 17:885-90 Husson MO et al.. Pathol Biol 2001. 49: 789-93.
Source: WHO
全人群
印 度
尼 日 利 亚
埃
刚
塞
果
俄
比
亚
阿
中
富
国
汗
巴 基 斯
安 哥 拉
孟 加 拉
乌 干 达
坦
预防疾病死亡数(WHO, 2003年6月)
5岁以内 5岁以上 合计
肺炎球菌疾病 轮状病毒 流脑AC Hib 黄热病 乙型肝炎 百日咳 破伤风 脊灰 麻疹 白喉
肺炎链球菌 的检测与分型技术
中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所 呼吸道传染病室 李马超
肺炎链球菌简介
(Streptococcus pneumoniae; Pneumococcus)
一般称为肺炎双球菌或球菌
Gram+ 双球菌或链球菌，α溶血（草绿色溶血 环）
荚膜包覆的肺炎链球菌具有致病力 荚膜多糖体 该菌株致病的主要因子 可以保护菌株免于被巨噬细胞等吞食 具有抗原性 各具免疫反应特异性 目前可知超过90种
1886年Fraenkel认为应将该菌归类为肺炎球菌
同年Weischelbaum建议命名为Diplococcus pneumoniae
但是直到1920年才正式被承认
而目前的命名Streptococcus pneumoniae是在
1974被确定，主要是经过rRNA基因序列分析而 得名。
著名的转化试验 1928年 Griffith
肺炎链球菌研究的关注重点
29
41F PCV13: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F, 3, 6A, 19A
31
42
PPV23: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F, 3, 19A, 2, 8,
32A
43
12F, 15B, 17F, 20, 22F, 33F, 9N, 10A, llA
32F
44
33A
45
33B
46
33C
47A
33D
47F
33F
48
34
6D?
35A
11E?
35B
35C
35F
36
37
38
39
肺炎链球菌的发现
1881年美国George Sternberg与法国Louis Pasteur首次各別从唾液中发现微尖型的双球菌 Pasteur将患有狂犬病病死儿童的唾液植入兔子， 而Sternberg将自己唾液植入兔子，二者结果皆 可在兔子血液中分离出双球菌。
20
7A
12F
21
7B
13
22A
7C
14
22F
7F
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8
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23B
9A
15C
23F
9L
15F
24A
9N
16A
24B
9V
16F
24F
10A
17A
25A
10B
17F
25F
10C
18A
27
28A
40
PCV7: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F
28F
41
PHiD10: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F
侵袭性肺炎球菌疾病及其相关死亡 CDC急性细菌性疾病监测* （2006年）
数
率（1/10万）
数 率（/10万）
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
<1
1
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
2-4
5-17
18-34 35-49 50-64 > 65
年龄组, 岁
458例死亡。死亡率 >65岁: 7.55/100 000 < 1岁: 0.71 / 100 000
沒有感染者 帶菌者 发病者
肺炎链球菌疾病负担
突破血脑屏障 肺炎球菌菌血症
脑膜炎 脑脊液渗漏
鼻窦炎
突破呼吸道粘 膜纤毛防御系 统
中耳炎 鼻咽部移殖
腹膜炎 关节炎等
突破吞噬细胞防御系统
肺炎
Salyers AA, Whitt DD. In: Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. 2nd ed. Washington, USA: ASM Press; 1994. p. 322-31
1/10万
国家
Adapted from McIntosh 2007. Epidemiology and Infection (2007), 135:644-656
肺炎球菌疾病死亡率最高的10个国家 多数位于亚洲和非洲
占全球死亡的%
18.0% 16.0% 14.0% 12.0% 10.0%
8.0% 6.0% 4.0% 2.0% 0.0%
*覆盖2800万 (占美国人口9%)
欧洲1985 – 2006年<2岁儿童侵袭性肺炎球菌疾 病发病（发表的研究）
IPD* M e ningitis 164
144
侵袭性肺炎球菌疾病
124
104
脑膜炎
84
64
*每10万 < 2 岁儿童的年发病数
44
24
4
西班牙 比利时 法国
芬兰
英国
丹麦
瑞士
瑞典
挪威
德国 奥地利 意大利
Streptococcus pneumoniae Capsule major virulence factor
91 different capsule types (serotypes).
1
10F
18B
2
11A
18C
3
11B
18F
4
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19A
5
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19F
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