生物发光检测法分解
atp检测原理
atp检测原理ATP（adenosine triphosphate）是一种细胞能量的代谢物质，在生物体内广泛存在，并广泛应用于快速检测微生物和有机物残留的方法中。
ATP检测原理是基于生物发光技术的一种快速生物检测方法，主要用于检测和评估样品中的微生物污染程度和卫生状况。
一、ATP检测的基本原理ATP检测原理是依据微生物分解ATP过程中产生的光反应进行的。
ATP分解产生的光是一种有规律的化学反应，可以通过光反应仪器测量和记录。
这种检测方法具有灵敏度高、实时性强、结果准确等特点。
二、ATP检测的步骤和过程ATP检测主要包括样品采集、提取、发光反应和结果判定几个步骤。
1. 样品采集：首先，需要从被测物表面、水样、土壤或其他样品中采集一定量的样品，保证样品的代表性。
2. 提取：样品采集后，将样品与盖上发光酶的提取液充分混合并接触一定时间，使ATP分子和发光酶发生反应。
提取液中的酶能够分解样品中的细胞壁和膜，释放出其中的ATP。
3. 发光反应：将提取液中经过提取的ATP样品与发光剂混合，在一定的反应条件下，ATP和发光剂反应产生光。
光的强度与样品中ATP浓度成正比，通过发光计测量光的强度，可以得出样品中ATP含量。
4. 结果判定：根据测量结果和预先设定的阈值，判断样品中的ATP 含量是否超过了规定的标准限值。
如果超过了阈值，说明样品中存在微生物污染。
三、ATP检测的应用领域ATP检测方法在许多领域都得到广泛应用，包括食品安全、水质监测、环境卫生等。
1. 食品安全：ATP检测可以用于食品卫生检测，通过检测食品表面的ATP含量，判断食品是否卫生合格。
2. 水质监测：ATP检测可以用于水质监测，通过检测水样中的ATP 含量，评估水质是否符合标准。
3. 环境卫生：ATP检测也可以用于环境卫生监测，通过检测污染区域的表面或空气中的ATP含量，评估卫生状况和污染程度。
四、ATP检测的优势和局限性ATP检测方法具有许多优势，如操作简便、快速、高灵敏度和实时性强等。
生物学发光检测法(ATP)解析
权威机构研究了1000个以上的样品，这种只需十几秒就能完
成检测的快速检测法所得实验结果90%以上与24-48小时标 准细菌培养法/平皿法所得结果一致 使细菌检查的工作量大幅度减轻，实现卫生监控的简捷化、 效率化，但只能用于细菌的定量分析，定性分析可用常规方 法进行培养检测。 应用于HACCP的关键环节监测，方便有效。
[INSERT AND DETECT]
将检测管放入ATP荧光检 测仪中，盖上盖子，倒 计 时开始并检测。
ATP检测反应原理
D-虫荧光素 荧光素酶 O2+Mg2+
氧化荧光素 PPi+AMP
AT P
荧 光 光 度 计 测 量
光（RLU ）
植物 微生物
细胞 数量
现场ATP检测的意义
ATP检测技术实验结果准确可靠，值得信赖。美国多个专业
当时，除个别省级卫生监督单位装备，主要在一些外资、
合资企业用于自检 2002年我国卫生部颁发了食品加工企业的HACCP实施 指南，鼓励食品加工企业引入ATP检测技术 2005年3月卫生部新出台《卫生监督机构建设指导意 见》，要求省、市、地配置
什么是ATP
ATP——三磷酸腺苷 【adenosine triphosphate， C10H16N5P3O13】存在于所有 生物体中，在细胞内主要作用 是提供能量 通过检测ATP ，可以间接地 证明生物体的存在
生物学发光检测法（ATP）
• 原理：ATP荧光检测仪基于萤火虫发光原理，利 用“荧光素酶—荧光素体系”快速检测三磷酸腺 苷（ATP）。由于所有生物活细胞中含有恒量的 ATP，细菌细胞裂解时会释放出ATP，ATP自细 菌细胞释放出来后，使用荧光虫素和荧光虫素酶 可使之释放出能量，这些能量产生莹光，光的强 度就代表ATP的量。ATP含量可以清晰地表明样 品中微生物与其他生物残余的多少，用于判断卫 生状况
基于荧光素酶生物发光检测方法的研究及其应用进展
基于荧光素酶生物发光检测方法的研究及其应用进展摘要：荧光素酶生物发光检测方法是一种通过触发酶与底物相互作用而产生荧光信号的技术。
这种方法具有高灵敏度、高选择性、简单易用等优点，被广泛应用于生物学研究和临床诊断领域。
本文将介绍荧光素酶生物发光检测方法的原理、发展历程以及在科学研究和医学诊断中的应用进展。
一、引言生物发光技术自20世纪80年代开始被广泛应用于生物学研究和临床诊断领域。
荧光素酶生物发光检测方法是其中一种常见的技术。
该方法利用荧光素酶与荧光底物相互作用，产生强荧光信号，从而实现对特定生物过程或分子相互作用的检测。
本文将介绍该方法的原理、发展历程以及在科学研究和医学诊断中的应用进展。
二、荧光素酶生物发光检测方法的原理荧光素酶生物发光检测方法的原理是基于荧光素酶底物的特性。
荧光素酶是一种能够催化荧光素底物氧化反应的酶。
当荧光素底物与荧光素酶相互作用时，荧光素底物被氧化，产生能量激发态的分子，随后通过非辐射传递耗散能量，从而发射出可见光谱的荧光信号。
三、荧光素酶生物发光检测方法的发展历程荧光素酶生物发光检测方法的发展历程可以追溯到20世纪80年代。
最早，荧光素酶主要应用于基因表达研究中，用于检测报告基因的表达水平。
后来，随着生物发光技术的迅速发展，荧光素酶生物发光检测方法逐渐应用于蛋白质相互作用、酶活性检测、药物筛选等领域。
四、荧光素酶生物发光检测方法在科学研究中的应用进展近年来，荧光素酶生物发光检测方法在科学研究中得到了广泛应用。
首先，该方法被用于蛋白质相互作用的研究。
通过将荧光素酶标记在目标蛋白上，可以实时监测蛋白质相互作用的动态过程。
其次，该方法被用于基因表达调控的研究。
利用荧光素酶作为报告基因，可以快速准确地测量目标基因的表达水平。
此外，该方法还被应用于细胞信号转导的研究、蛋白质酶解的研究等。
五、荧光素酶生物发光检测方法在医学诊断中的应用进展荧光素酶生物发光检测方法在医学诊断中的应用也日益增多。
临床检验中的发光免疫分析讲解课件
对甲低的诊断价值依次为：FT4=TSH＞TT4＞FT3＞TT3
但FT3 、 FT4灵敏度要求高，且易受干扰 发光法提高了灵敏度，使得其临床应用普遍性超过TT4和TT3
第一代（放免）
第二代
第三代
两步法 操作时间长
灵敏度差 准确性差
类似物法 操作时间短 灵敏度较好 准确性较好
反向竞争法 （标记抗体） 操作时间短 灵敏度更好 准确性更好
发光强度（X）
单光子计数式发光检测仪
单光子计数器
样品运动/定位装置 原位注射泵
计数/贮存器 打 印 机
程控高压
计
算
控制器
机
程控自动门锁及检测装置 发光仪执行模块
发光仪控制模块
光生物学技术的应用范围
军事侦测 公安稽查 卫生检疫 药物筛查 医学诊断 环境检测 航天遥感 生命科学
……
第三代 TSH检测试剂盒
第四代 TSH检测试剂盒
以TSH(促甲状腺素)为例
目前商品化发光免疫分析产品的几个特点
大多采用全自动工作方式，部分采用微孔板半自动方式 多采用磁性或非磁性微粒包被，以增加表面积，使反应时间缩短 使用内建标准曲线加校正的办法产生工作曲线 部分产品采用流动池测定方式(适合于闪光型发光或电化学发光)
发光时间在数十分钟以上，如： HRP-Luminol系统 AP-AMPPD系统 黄嘌呤氧化酶系统
无须原位进样、 以速率法测量。
闪光与辉光及其测量方式的差别
闪光尖峰 发光信号
积分法测量
辉光坪区
原位进样
速率法测量
时间
商业化产品中常见的化学发光系统（一）
鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统
O
H2O2+
ATP检测方法范文
ATP检测方法范文ATP（Adenosine Triphosphate，腺苷三磷酸）是一种能量分子，在生物体内广泛存在，并代表着生物体的活动水平。
ATP的检测方法主要包括生物发光法、生物酶法和生物传感器法等。
一、生物发光法：生物发光是利用生物体内氧化还原酶系统以及氧化酶或酶反应，在氧气存在的条件下将底物发光。
ATP检测方法中，常用的底物为辅酶或荧光基团（luciferin），通过与ATP反应，生成可发光的物质。
1.生物发光法的原理：ATP酶或荧光基团与氧化剂中的氧产生氧化反应，生成Ox2-（Ox-Dioxetan），然后从氧化剂分子中获取能量，进而引发可见光或发射荧光。
2.生物发光法的操作步骤：（1）制备反应液：包括辅酶AB、荧光素、酶、酶抑制剂等。
（2）加入底物：将待检测的样品加入反应液中。
（3）测量发光值：使用光度计或荧光分光光度计测量样品在特定波长下的发光值，并与标准曲线或标准品对照得到ATP的浓度。
二、生物酶法：生物酶法是通过一些酶与ATP底物发生显色或变色反应，进而进行浓度测定的方法。
1.生物酶法的原理：ATP酶与底物发生反应，生成染色产物，如酚酞或过氧化物。
2.生物酶法的操作步骤：（1）制备反应液：包括酶、底物、辅助试剂等。
（2）加入底物：将待检测的样品加入反应液中。
（3）显色反应：根据底物与酶的反应特性，观察样品的颜色变化，并与标准品对照，得到ATP的浓度。
三、生物传感器法：生物传感器法是一种利用生物分子识别特异性和生物反应性等特点，与传感器相结合实现对ATP检测的方法。
1.生物传感器法的原理：通过将ATP与传感器的生物组分（如酶、抗体、单链DNA）结合，使传感器发生变化，如电位变化、荧光变化等。
2.生物传感器法的操作步骤：（1）构建传感器：将ATP与传感器的生物组分结合，构建传感器。
（2）传感器测定：测定传感器的电位、荧光等变化，与标准品对照，得到ATP的浓度。
综上所述，ATP的检测方法主要包括生物发光法、生物酶法和生物传感器法。
食品微生物快速检测常用方法-ATP生物发光法测菌落总数.
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目录页
一
ATP生物发光法检测原理
二
ATP生物发光法检测过程
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食品营养与检光法检测原理
一
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ATP存在于包括微生物在内的一切活细胞内，ATP生 物发光法是利用ATP与荧光素酶系统接触时的发光现象 建立起来一种检测方法。 各生长期的微生物均有较恒定水平的ATP含量，微生 物死亡后，ATP将很快被分解掉。因此，提取细菌的 ATP，利用生物发光法测出ATP含量后，即可推算出样 品中的含菌量，ATP浓度与活细胞数密切相关。
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谢 谢
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ATP 生 物 发 光 法 测 菌 落 总 数
操作步骤 指示菌ATP的提取：TCA法和加热煮沸法 ATP的检测： 先用标准ATP试剂作一条标准曲线。测 量得到样品的相对发光值。 测定样品发光值,与标准曲线对比，得到 样品中的ATP含量, ATP含量可以转化为微生 物的浓度。
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试剂
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过渡页
ATP生物发光法检测过程
一
1.设备和试剂
2.操作步骤
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ATP 生 物 发 光 法 测 菌 落 总 数
• 设备和试剂 ATP荧光仪：包括样品过滤膜、ATP一生物荧 光反应器、荧光增强及数据处理系统。 试剂：荧光素-荧光酶试剂 、ATP提取液 、标 准ATP试剂
临床微生物 发光法
临床微生物发光法
生物发光是由于生命活体、生物体本身所产生的一类特殊的化学发光现象，促进生物体本身发光需要利用激发能，这种激发能来自于生物体内酶的崔化反应。
生物发光法是一种快速的微生物检验法，由于生物发光法具有操作简更、灵敏度高、能够随时进行检测等一系列优点，所以其在微生物的检验中应用的非常广泛。
微生物的检验涉及到的方面非常广泛，特别是在食品加工的过程中对食品的质量进行严格的监控。
如果对食品中的细菌检验采用常规的方法检验，就必须采用琼脂平板菌数计数法，但是这种检验方法需要2-3天的时间才能出结果，所以这种检验结果对食品检验有很大的滞后性，由于很多食品必须在生产的当天进行出售，所以采用常规的琼脂平板菌计数法显然不能满足实际的检验需要，因此对于生物菌的快速测定需要有即时性的微生物检测方法进行快速、准确的检测。
所以有需求就有市场，生物发光法以其快速、准确的测定优势得到了国内外的广泛关注，目前在微生物检验中得到了广泛的应用。
生物发光法是属于化学发光范畴的，是由于生命活性生物体产生的发光现象[B]，发光需要生物体内的激发能，激发能来自于生物体内的荧光素酶的催化作用，生物发光主要有两种类型：萤火虫生物发光和细菌生物发光等，萤火虫生物体发光又需要有ATP参与，所以萤火虫生物发光又被称为ATP依赖性生物发光。
生物学发光检测法(ATP)
目
CONTENCT
录
• 引言 • ATP发光检测法的基本原理 • ATP发光检测法在生物学研究中的
应用 • ATP发光检测法的实验方法与技术 • ATP发光检测法的数据分析与解读 • ATP发光检测法的发展趋势与挑战
01
引言
目的和背景
研究目的
通过生物学发光检测法（ATP）快速、准确地检测和评估生物样本中 的活性细胞数量及其代谢状态。
ATP纯化
通过离心、过滤或层析等方法 去除提取液中的杂质和干扰物 质，以获得纯净的ATP溶液。
ATP定量
利用标准曲线法或比色法等方 法对提取的ATP进行定量，以 确定其浓度。
发光反应条件优化与信号检测
发光反应条件
优化反应体系中各组分的浓度和比例， 如荧光素、荧光素酶和ATP等，以获 得最佳的发光效果。
• 高通量筛选
适用于高通量药物筛选和细胞毒性评价，提高研究效率。
• 临床应用
可用于评估肿瘤细胞对药物的敏感性、预测疾病预后等， 为个性化医疗提供依据。
• 环境监测
可用于检测水体、土壤等环境中的微生物活性，评估环境 质量及生态毒性。
02
ATP发光检测法的基本原理
ATP与生物发光的关系
ATP（腺苷三磷酸）是生物体内能量传递的重要分子， 广泛存在于所有活细胞中。
生物发光现象与ATP水平密切相关，ATP浓度越高， 发光强度越大。
通过测量生物体内的发光强度，可以间接反映ATP含 量，从而评估细胞的活性、微生物污染程度等。
ATP发光检测法的反应机制
ATP与荧光素酶（Luciferase） 反应，生成氧化荧光素 （Oxyluciferin）并释放能量。
释放的能量激发荧光素 （Luciferin），使其从基态跃 迁到激发态。
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反应影响因素考察以及标曲图绘制
影响因素 pH、温度、BSA浓度 标准曲线的绘制 移取100 μL ATP 标准溶液加入微孔板, 再 加入100 μL 虫萤光素-萤光素酶底物溶液, 微孔板振荡器上混匀1 min后立即室温检测。 以ATP 浓度和发光强度分别取对数进行线 性拟和。
反应影响因素考察以及标曲图绘制
受游离ATP和体细胞的影响 无法鉴定细菌种属 试剂昂贵 酶促反应影响条件多 某些时候灵敏度不够
ATP生物发光法在食品领域的应用
食品快速筛选和检测（微生物的快速检测） 肉品新鲜度，乳制品中的乳酸菌，啤酒中 菌落总数，脱水蔬菜的细菌学测定，粉状 食品和调味食品的细菌学测定。 食品生产设备与环境 色素、致癌物 农药残留
pH对发光反应的影响 温度对发光反应的影响
BSA浓度对发光反应的影响
ATP生物发光反应标准曲线
样品ATP的提取
用生理盐水稀释酸奶和经过搅拌机绞碎的 火腿及蛋糕样品。三磷酸腺苷双磷酸酶用 于清除样品中所含游离ATP。 将前处理好的样品与pH 7.4 的缓冲溶液等 体积混合, 沸水浴中加热3 min 提取ATP, 12000 r/min 离心1 min，取上层清液待测。
ATP生物发光法原理
D-荧光素+ATP+O2
总思路：荧光
荧光素酶 Mg2+
Oxy-荧光素+AMP+PPi+H2O+荧光
微生物数量
ATP
第一步：荧光
ATP
其他底物过量，荧光强度与ATP含量成正比。 第二步：ATP 微生物数量
ATP仅存在于活的生物体中，且每个细胞的ATP含量大致相 同，因此可通过ATP的含量确定活的微生物的含量。
ATP生物发光法检测步骤
取样 样品ATP的提取 添加荧光素-荧光素酶 测定生物发光值 计算出ATP的浓度和活菌数量
关键点
ATP的提取 游离的ATP的去除 提取剂的选择 提取条件的优化 反应条件的优化 D-荧光素浓度、萤火虫荧光素酶浓度、反 应pH、温度
便携式荧光光度仪
荧光分光光度仪
ATP生物发光技术举例
样品ATP提取方法的优化
三种ATP提取方法比较 实验了3 种提取食品 中细菌ATP 的方法。 分别为双蒸水、磷酸 盐缓冲溶液加热提取 和三氯乙酸( 0. 03% TCA) 室温化学裂解 方法。3 种方法提取 结果见右图
a- 双蒸水体系煮沸; b- 磷酸盐缓冲体系 煮沸; c- 三氯乙酸裂解
测定样品生物发光值
未来发展趋势
随着科学技术的飞速发展，相信ATP 生物 发光法会变得更加成熟，其相应的仪器设 备等也会越来越先进，满足食品、医疗、 环境等行业的实际需求，为我们人类造福。
实验目的：
探索提取以及反应的最佳条件 分别用ATP生物发光法和菌落计数法测定 五种样品（青岛啤酒、三鹿君乐宝酸奶、 三鹿君乐宝高该酸奶、双汇王中王火腿和 康师傅妙芙欧式蛋糕）中的细菌含量，并 比较这两种方法的相关性。
实验主要仪器与试剂
仪器 搅拌机、离心机、微孔板、微孔振荡器、 微孔板发光分析仪 试剂 ATP、萤光素、萤光素酶、三磷酸腺苷双 磷酸酶、小牛血清白蛋白（BSA）、三氯 乙酸、缓冲溶液、双氧水
同时参照GBPT 4789. 2- 2003 ， 采用传统方法培养 样品中细菌, 进行 菌落计数，其结果 与ATP生物发光法 方法检出ATP浓度 相比较。
生物发光法检测结果与 传统方法培养结果相关比较
ATP生物发光技术优点
检测灵敏 操作简便 结果快速 准确率较高 测定范围广
ATP生物发光技术缺点来自ATP生物发光技术历史发展
ATP 生物发光法检测ATP 含量最初在1949 年被阐述。 ATP生物发光技术产生于20世纪70年代 1963 年McElroy最先引入荧光素酶-ATP 检测法，发现反应的结果是把化学能转化 为光能。
ATP生物发光技术历史发展
1983 年，Moyer等最早提出细胞内源性 ATP 含量可以反映细胞的活性和活细胞的 数量。同年Gronroos等也证实该技术是一 种可靠、灵敏度高的确定细胞活性度的检 测方法。 20 世纪80 年代，英国人首先研制出ATP 检测仪，并逐步发展到欧洲、美国和日本。 20世纪末，ATP 检测仪及技术被引进我国。
ATP生物发光技术
食品加工与安全研1301 胡程
萤火虫
栉水母
发光海虫
腰鞭毛虫
发光蘑菇
初识生物发光
生物发光是指生物自身发光细胞构成发光 器而发光。生物发光属于化学发光的范畴， 化学能转化为光能的效率几乎为100%。 发光机制：细胞合成的化合物质，在特定 酶的作用下，使化学能转化为光能。 近年来，多种生物发光技术已经广泛应用 到科学的各个领域，其中ATP生物发光技 术是应用比较成熟的一种技术。
其他领域的应用
医学领域 药物敏感性试验，新药筛选和药物评价。 细胞学领域 细胞免疫活性检测。 环境工程领域 污染物浓度变化。
未来优化方向
可以尝试将ATP 生物发光法与DNA 分子识 别结合起来，可以鉴定菌种。 建立最优的游离ATP 去除体系。 找到最佳的微生物ATP 提取方法。 确立ATP 酶促反应的最佳条件。
移取100 μL 样品提取液加入微孔板, 再加 入100 μL 虫萤光素-萤光素酶底物溶液, 微 孔板振荡器上混匀1 min后立即室温检测得 出发光值。
计算出ATP的浓度和活菌数量
对照由标准ATP试剂测量所得发光值和 ATP的浓度标准曲线，根据发光值得到 ATP的浓度，最后转化为微生物的浓度。
与传统方法的比较