第十二讲植物遗传转化
植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)
一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。
另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。
它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。
其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。
农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。
T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。
1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。
Ti质粒大约在160～240kB之间。
其中T-DNA大约在15kb-30kb。
Vir基因区在36kb 左右。
除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。
植物遗传转化技术
binary vector
• 包括mini-Ti质粒（T-DNA边界，缺失Vir区）和 helper Ti质粒（含有Vir区缺失T-DNA边界，相当 于co-integrated vector 的disarmed Ti质粒） mini-Ti质粒：pBin19，pCAMBIA系列 helper Ti质粒：EHA105，LBA4404（pAL4404）
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Co-integration plasmid
• 一元载体系统A plasmid based on pBR322 used to clone gene of interest
• A Ti-based vector: pGV3850 (LB, RB, most of T-DNA replaced by pBR322)
Left border
Right border
12-24 kbp
vir genes
Opine
ori
catabolism
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3. 创伤诱导分子
• 是一类可溶性的小分子酚类化合物 • 乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）、羟
基乙酰丁香酮（acetosyringone，OH-AS） • A.t: recognition and chemotaxis （趋化性）
• Left and right border (LB\RB):TDNA左右两侧各有一段25bp的重复 序列，在T-DNA的整合中起重要作用
• Ori区(origin of replication)：该区段 基因调控Ti质粒的自我复制，故称之 为复制起始区。
T-DNA region
Auxin Cytokinin Opine
• T-DNA和vir基因参与，T-DNA上的基因与 T-DNA的转移及整合有关，因为它不编码 T-DNA转移的产物。
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术植物遗传转化与基因编辑技术在生物学中的应用植物遗传转化与基因编辑技术是生物学领域中的重要研究方向，它们可以用于改良植物品种、提高农作物产量和抵抗力、开发新型植物药物等。
一、植物遗传转化技术的原理和方法植物遗传转化是指将外源基因或DNA片段导入植物细胞，并使其稳定地遗传给后代。
常见的植物遗传转化方法包括农杆菌介导的遗传转化、基因枪法和凯南法等。
1. 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化是最常用的植物遗传转化方法之一。
该方法利用土壤中广泛存在的植物病原性农杆菌将外源基因导入目标植物细胞。
首先，将外源基因插入农杆菌质粒的T-DNA区域，然后将农杆菌通过注射或浸泡等方式导入植物细胞。
在遗传转化后，利用选择标记基因或报告基因进行筛选和检测。
2. 基因枪法基因枪法是将DNA载体以高速射击的方式直接导入植物细胞。
将外源基因负载在金粒等微粒表面，然后使用高压氦气或火药等加速器将其射入植物细胞。
在转化后，通过培养基中的选择性筛选剂来筛选转化的细胞。
3. 凯南法凯南法是一种基于物理和化学手段的遗传转化方法。
通过利用聚乙烯醇（PEG）或电击等方法，使DNA能够与植物细胞质融合，然后通过培养和筛选等步骤来获得转化的植物细胞。
二、基因编辑技术在植物遗传改良中的应用基因编辑技术是指通过精确地修改植物基因组中的特定位置，实现遗传改良的方法。
常见的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等。
1. CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种高效、快速和精确的基因编辑技术。
它利用CRISPR RNA（crRNA）和转录单元RNA（tracrRNA）组成的复合物与Cas9蛋白结合，以形成靶向特定基因序列的复合物。
在植物中，CRISPR-Cas9系统被广泛应用于基因敲除、基因敲入和基因修饰等方面。
通过将CRISPR-Cas9系统导入植物细胞，可以实现对植物基因组的精确编辑。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是指通过外源DNA的导入，使植物细胞或组织发生基因改变，从而获得具有特定性状的转基因植物。
这一技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用。
下面将介绍植物遗传转化的基本步骤。
步骤一：选择外源DNA在植物遗传转化中，首先需要选择外源DNA，也就是我们要导入到植物细胞中的目标基因。
这个目标基因可以来自于其他物种，也可以是人工合成的。
目标基因的选择取决于我们希望在转基因植物中表达的特定性状。
步骤二：构建转化载体将目标基因导入植物细胞需要使用载体。
载体是一种专门设计用于植物遗传转化的DNA分子。
通常，载体由多个组成部分组成，包括启动子、终止子、选择标记和目标基因。
这些组成部分的功能是确保目标基因能够在植物细胞中正确表达。
步骤三：转化载体导入植物细胞一旦构建好转化载体，接下来就需要将其导入到植物细胞中。
目前，有多种方法可以实现这一步骤，包括农杆菌介导转化、基因枪法和电穿孔法等。
这些方法都可以有效地将外源DNA导入植物细胞，使其成为转基因细胞。
步骤四：筛选转基因细胞一旦植物细胞被导入外源DNA，我们需要对其进行筛选，以确定哪些细胞成功地获得了目标基因。
为了实现这一步骤，常常会在转化载体中加入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
只有携带了目标基因的细胞才能存活下来，而其他细胞则会被筛选掉。
步骤五：培养和再生转基因植物筛选出的转基因细胞可以通过培养和再生来获得完整的转基因植物。
这一过程通常需要在培养基上进行，通过提供适当的营养物质和激素来促进细胞分裂和分化。
经过一段时间的培养，转基因细胞可以发展成为转基因植物。
步骤六：鉴定转基因植物需要对获得的转基因植物进行鉴定，以确认其是否成功地获得了目标基因。
这一步骤通常需要使用分子生物学技术，如PCR和Southern blot等，来检测目标基因的存在和表达。
只有经过鉴定的转基因植物才能用于进一步的研究或应用。
总结：植物遗传转化是一项复杂的技术，需要经历多个步骤才能成功。
植物遗传转化
花椰菜遗传转化方法如图： 发根农杆菌介导 根瘤农杆菌介导
（三）林木遗传转化的技术
目前以掌握了杨树、白桦、桉树、落叶松、核 桃、苹果、沙田柚等树种外源基因转化技术。主要 转化方式是农杆菌介导法。增强植物抗病、耐高温、 耐旱等方面。
（四）药用植物遗传转化的技术
主要采用农杆菌介导法，其他方法成功的例子 极少。
第十七章：植物遗传转化
Section 1: 植物遗传转化的方法
Section 2: 转化植株的检测 Section 3: 几种植株遗传转化的 技术
植物遗传转化 （plan genetic transformation): 应用重组DNA技术、细胞组织培养 技术或种质 系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片 段插入到受体植物基因组中并通过减数分裂获 得新植株的技术。
•
（2）方法：人们将目的基因插入到经过 改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中， 近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物 (尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
（3）转化步骤可简单概括为以下方面：
Section 2: 转化植株的检测
以报告基因检测为例：
报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶
的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被 鉴定的基因。目前主要的报告基因如下：
Section 3: 几种植株遗传转化的技术
（一）大田作物遗传转化的技术
①油菜的遗传转化技术 农杆菌介导转化法：根据不同的基因型选择适的培养基。
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大 多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重 组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/ 分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定 （这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见 第五步） 几种方法进行检验（根据要求选取不同方 法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物 体进行个体生物学水平鉴定。
第10章 植物遗传转化
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了 共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
2，基因枪法转化的特点： 不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞 作为靶材料。 操作简便。
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第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.3，两种形式的共同特点：
1）外植体材料来源广泛； 2）适用的植物物种范围广； 3）再生植株群体变异大。
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第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
2，不经过愈伤组织的受体系统 也称直接分化受体系统，指直接对外植体 材料进行遗传转化操作，然后经过培养直接在 外植体上形成不定芽的情况。 这种系统的特点是 1）获得再生植株的所 需时间短，操作简单；2）遗传变异少；3）外 源基因稳定性高；4）嵌合体比例偏高；5）受 植物物种的限制比较大。
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第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性 5，生殖细胞受体系统
以花粉粒或卵细胞为受体细胞进行直接的 转化的技术系统，也叫种质系统。 5.1，花粉管通道法； 5.2，花粉粒浸泡法； 5.3，花粉粒基因枪转化法； 5.4，子房微注射法。
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第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
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第二节
转化的受体系统
一、转化受体的条件
5，农杆菌敏感性 对于农杆菌介导的基因转化来说，需要受 体材料对农杆菌敏感，因为只有对农杆菌敏感 的材料才能够接受农杆菌的转化。一般认为， 大多数双子叶植物对农杆菌敏感而单子叶植物 不敏感。 农杆菌有不同的菌株，同一材料对不同菌 株的敏感程度可能存在不同；目前，还可以采 用化学试剂（乙酰丁香酮）来弥补敏感性的不 足。
植物遗传转化
植物遗传转化植物遗传转化是指将一种基因从一种宿主植物移植到另一种植物中的过程。
这可以通过多种技术实现，包括蛋白质工程、病毒载体和质粒介导的遗传转化。
植物遗传转化的技术可以用来改变植物的性状，例如产量，耐旱性，抗病性，耐寒性，营养价值，等等。
它还允许转化植物中的基因，以改善其耐药性、耐酸碱性或其他性状。
植物遗传转化技术有着悠久的历史，最早可以追溯到使用放射性同位素来驯化植物的实验，其目标是改变植物的遗传特性，从而增加其产量。
今天，植物遗传转化的技术发展迅速，使得利用质粒介导的遗传转化技术来转移植物的基因变得越来越容易。
还有许多其他的方法，包括蛋白质工程，以及其他以病毒载体为媒介的形式，都在不断的发展和应用中。
植物遗传转化的应用在种植领域非常广泛。
这种技术可以用来增加植物抗病性，使得植物不容易受到病虫害、荒漠化或气候变化的侵袭；改善植物对营养元素的利用，改善植物的生长和发育；消除农业投入品，比如农药和化肥，使植物可以在较低的投入下获得较高的收入；改变植物的性状，比如口感、果实大小、颜色等，使得植物更受消费者欢迎；以及改变植物的耐寒性，以适应不同的气候条件，减少和消除对农作物收获量的不利影响。
随着植物遗传转化技术的发展，植物遗传转化在农业中的应用越来越广泛，许多农作物也在不断发展改造中。
植物遗传转化的技术已成为农业科学研究的重要组成部分，在当今的社会中得到了越来越多的应用，它不仅可以改善植物的效率，而且可以降低农作物的生产成本，最终提升农作物的抗病性、耐寒性、耐旱性和营养价值等性状，为世界人民提供健康、安全和有营养的生活所需。
如今，植物遗传转化技术已经成为人类运用自然环境生物资源的重要工具，但它仍然存在一定的风险。
因此，在开发和使用植物遗传转化技术之前，应当首先对技术进行全面的评估，确保它不会对自然生态、人类健康或其他有关部门造成不利影响。
同时，在开发和使用植物遗传转化技术的过程中，应当遵守有关法律法规，以确保植物遗传转化技术的安全、可靠和环保。
植物遗传转化及其农业应用
植物遗传转化及其农业应用植物遗传转化是指将外源基因或DNA序列稳定地导入植物细胞或组织，并使其遗传表现进行改变的技术。
随着这项技术不断发展和完善，越来越多的植物种类被进行遗传转化，其应用也越来越广泛。
在农业生产领域，植物遗传转化技术被广泛应用，如提高农作物的生产力、耐旱、耐盐等性状，研发新品种等，对于推进农业现代化起到了重要作用。
一、植物遗传转化技术及其分类植物遗传转化技术可分为两类：直接转化和间接转化。
直接转化是指将外源DNA直接导入植物细胞或组织，利用种种手段促使外源DNA整合入植物基因组，从而改变其遗传表现。
直接转化分为生理、物理和化学三种方法。
生理方法是将植物组织培养在含有激素和其他化合物的培养基上，使其形成愈伤组织和再生植株，再利用农杆菌或冷杆菌等载体导入外源DNA。
物理方法是利用生物粒子枪，通过高速粒子冲击将DNA导入植物细胞或组织中。
化学方法是利用钙离子或聚乙烯醇等高分子材料电转化植物细胞或组织。
间接转化是指将外源基因先导入细菌或酵母等微生物细胞中，再利用这些细胞的载体介导导入植物细胞或组织中，使其发生遗传改变。
间接转化主要的手段是农杆菌介导转化。
农杆菌T-DNA 的导入具有高效、选择性和可重复性等优点，因此也是植物遗传转化中最常用的技术。
二、植物遗传转化在农业生产中的应用1. 提高农作物产量和品质通过基因工程技术对农作物进行遗传改良，可以提高作物产量和品质。
例如，利用玉米中的赤霉烯合成酶基因调控葡萄果实的脱落酸合成，可以延长果实的寿命和保留其营养成分，提高果实的品质；利用独苗菜中的β-半乳糖苷酶基因使西瓜果肉中木瓜素和木瓜苷的含量降低，从而提高西瓜的口感和品质。
2. 研发新品种通过植物遗传转化技术，可以引入新的基因或遗传材料，从而研发新的品种。
例如，将水稻中的鱼腥草酸合成酶基因导入玉米中，产生了抵抗昆虫的转基因玉米；将独苗菜中的组氨酸脱羧酶基因引入番茄中，产生了抗沙漠化的转基因番茄。
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4）基本程序
尽管基因枪的种类很多，但遗传转化的基本步骤是一致 的： 受体材料的准备及预处理：（未成熟胚、成熟胚、小愈 伤组织、悬浮细胞、原生质体等平铺于培养皿中心，直 径在3cm范围内） DNA微弹的准备：金属微颗粒与外源DNA的混合 受体材料的轰击 轰击后外植体的培养、植株再生及转基因植株的分子检 测
转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的 是将DNA片段转入一个生物体，从而使该生物体表现某种性 状
转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现
转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分 子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目 的，实现对生物体的改造
遗传转化中极为重要
3）基因枪工作原理
基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱 动三类
金属微颗粒（0.6-1.6 mm直径的钨或金颗粒），包被外源DNA 载体，加速后携带外源DNA进入植物受体细胞
压缩气体驱动的基因枪是目前的主流： 基因枪是利用不同厚度的聚酰亚胺薄膜制成可裂圆片，来调 控氦气压力，当氦气压力达到可裂圆片的临界压力时，可裂 圆片爆裂并释放出一阵强劲的冲击波，使微粒子弹载体携带 微粒子弹向下高速运动，轰击靶细胞或组织。
是指将植物的离体材料包括茎尖（芽）、分生组织、胚胎、 花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法 处理后在超低温（-196℃液氮）条件下进行保存的方法。
材料的准备—预处理—加入冷冻保护剂—降温冷冻—种质液 氮保存—快速化冻（34-40 oC）、洗涤、再培养
4）超低温保存的方法有哪些？
常规超低温保存 玻璃化法超低温保存 包埋脱水法超低温保存 干燥冷冻法超低温保存
5）如何提高冷冻后细胞和组织的存活率？
材料的选择 冷冻前的预处理 超低温保存方法的选择 材料的冷冻降温方法 冷冻及洗涤 再培养 抗冻蛋白
本讲主要内容
植物遗传转化的概念 方法 转基因植株的鉴定 转基因植物的安全性评价
5）转化方法（例）
6）优缺点分析
优点：
无宿主限制：无论是单子叶植物和双子叶植物都可以应用 受体类型广泛：原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、
根、以及种子的胚、分生组织、愈伤组织、花粉细胞、子房等 几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击 可控度高：商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速 度和射入浓度，命中特定层次的细胞 操作简便迅速
第十二讲 植物遗传转化
2012年秋季
上节课内容回顾
1）种质资源及种质保存的定义？
种质资源（Germplasm Resource）：又称遗传资源，习惯上 也叫品种资源。它包括栽培、野生及人工创造的粮食作物、 经济作物、园艺作物的品种或品系
种质保存（Germplasm Conservation）：是指利用天然或人工 创造的适宜环境，保存种质资源，使个体中所含有的遗传物 质保持其完整性，有高的活力，能通过繁殖将其遗传特性传 递下去
一 植物遗传转化的概念
植物遗传转化（Plant genetic transformation）:是指将 外源基因转移到植物体内并稳定整合、表达并遗传， 从而使受体植物体现转移基因的特征的过程。又称为 基因转化（gene transformation）
转基因植物（Transgenic plant）:通过遗传转化手 段，获得目的基因(包括外源和内源基因两类) 并能 在后代中稳定遗传的植物
缺点：
转化后瞬时表达高，但稳定遗传的少 转化频率低 成本高 出现非转化体及嵌合体的几率高 往往多拷贝进入，导致受体本身遗传变异大 轰击过程中可能造成外源基因的断裂
农杆菌介导法
病毒介导法
植株原位真空渗入法
（一）直接基因转移技术
1 基因枪法
概念 发展历史 原理 基本程序 转化方法 优缺点
1）基因枪法的概念
基因枪（Gene gun）:将携带基因的金属微粒高速射入 细胞和细胞器的装置
该方法又称为粒子轰击法(particle bombardment)，高速 粒子喷射技术(High-velocity particle microprojection)或 基因枪轰击技术(gene gun bombardment)
2）什么是种质离体保存？有哪些方法？
对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材 料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要 时可重新恢复其生长，并再生植株的方法
有限制生长保存（低温、高渗透压、抑制剂、低氧分压、干 燥等保存法）及超低温保存
3）什么是超低温保存？主要程序有哪些？
2）基因枪法的发展历史
最早由Cornell大学的Sanford等于1983年发明，由火药引爆 1987年，Vlein等应用此技术将烟草花叶病毒RNA吸附到钨粒
表面，轰击洋葱表皮细胞，经检测发现病毒RNA能进行复制 1988年，McCabe等将外源DNA包被的钨粒对大豆茎尖分生组
织轰击，后代检验出了外源基因的表达 现在已经发展出了高压放电基因枪及压缩气体驱动基因枪等 迄今，该方法应用极为广泛，特别是在禾本科等单子叶植物的
样品比较（左为普通棉花， 右为兔毛转基因棉花）
抗除草剂大豆
遗传转化获得再生植株的基本程序
目的基因的克隆 重组载体的构建：在体外进行DNA重组，将外源DNA
连接到能自我复制又带有选择标记的载体上 将重组载体转移入受体细胞 筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆 再生植株的获得
植物遗传转化的意义
植物遗传转化技术的应用：
基础研究
植物性状改良
植物抗虫基因工程 抗病基因工程 植物抗逆基因工程 植物品质改良的基因工程 植物叶绿体基因工程
生物工程
植物生物反应器
二 植物遗传Байду номын сангаас化的方法
直接基因转移技术 生物介导基因转移技术
基因枪法 电击转化法 PEG转化法 花粉管通道法 显微注射法 激光微束穿孔法