分子克隆之载体构建完整步骤
载体构建实验方法及步骤
载体构建实验方法及步骤载体构建（vectorconstruction）是分子生物学研究常用的手段之一。
依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其它修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
实验步骤1.载体选择：根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。
以Nrf2基因序列：1794bp 为例；2.引物设计：引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接。
Nrf2pC1EcoR-F：CGGAATTCCGCCACCATGATGGACTTGGAGT TGCCACCNrf2pC1BamH-R：CGGGATCCCTAGTTTTTCTTTGTATCTGGCT TCTTGC3.PCR扩增：以小鼠光感受器细胞cDNA为模板，PCR扩增目的基因，在引物两端分别引入EcoRI和BamHI的酶切位点，1%琼脂糖凝胶回收目的基因DNA条带（1794bp）。
4.载体和目标片段的限制性酶切：质粒载体Plvx-DsRed-monomer-C1和目的基因PCR产物的Ec oRI和BamHI双酶切，酶切反应在37℃水浴反应2h；1%琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒Plvx-DsRed-monomer-C1酶切大片段和目的基因酶切片段。
5.连接转化：质粒Plvx-DsRed-monomer-C1 EcoRI+BamHI酶切回收大片段与目的基因连接，连接反应在16℃反应12小时。
取10ul连接产物与100ul DH5a感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激90s，立即置冰上放置5min,加入预热至室温的700ul LB培养基，37℃恒温摇床培养50min，吸取 200ul的菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含100ug /ml Ampicillin抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。
6.挑取克隆提质粒验证：挑取5个单菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB 培养液中，300rpm，37℃恒温摇床培养过夜，对过夜的菌液进行扩增，选择阳性菌液，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，再进行测序验证。
分子克隆的五个步骤
分子克隆的五个步骤1 选择载体：在分子克隆的过程中，首先需要选择一种合适的载体来实现这一过程。
载体是要被克隆的DNA片段，生物体中的某种大分子结构，可以为克隆提供容器。
一般来说，载体选择最好是含有可重复使用的重组信息，如使用多种重组酶克隆更为容易和可靠，能在实验室之间转移。
该步骤需要考虑选择对于试验类型最合理、在实验中表现最佳的载体，与之相符的必要条件是有可操作和稳定的复制介质，以及品质可靠、价格相对划算的供应商。
2 将载体与要克隆的DNA片段连接：接下来需要将载体与要克隆的DNA片段连接。
这样一来，DNA片段就会受到载体中的重组酶以及其余细菌特有的信息影响，从而生存，复制，得以分离，克隆出多个相同的DNA断片。
连接DNA片段和载体的技术有各种方法，最常见的方法为用复制酶切割载体的方法，这种技术利用重组酶将DNA片段片段插入载体结构中，实现载体与DNA片段的融合。
3 转化：经过第二步的操作，则可以将融合的载体片段转入细菌，进行转化，实现将载体片段覆盖到细菌细胞中，形成细菌外源DNA的转基因，从而使细菌体系内发生变化，从而开始转化过程。
4 筛选：经过第三步的转化，载体就可以移植到细菌体内，从而形成转基因细菌，这时候就可以采用测试细胞以及一些标记物质来进行筛选，将转基因细菌与其他细菌相区分开来，根据一些指定条件进行筛选，从而得到被克隆的特异性DNA片段，实现分子克隆的目的。
5 收集：经过第四步的筛选，就可以将特异性的DNA断片收集起来，被收集的DNA断裂片段就是分子克隆的结果，可以得到被克隆的特异性DNA 断片，将其用于进一步的研究。
最后，分子克隆是一种复杂的实验过程，需要经过以上5个步骤，才能实现分子克隆的目的，如正确选择载体、把该DNA片段片段插入载体结构、将融合的载体片段转入细菌、用测试细胞以及一些标记物质对转基因细菌进行筛选，从而得到被克隆DNA片段，最终收集被克隆的DNA断片，这样就可以实现分子克隆的目的，得出满意的实验结果。
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
克隆载体表达载体构建详细版
一、稀释引物1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul下引物0.8ulMix 10ulDNA（日本晴）1ulDD水7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA 2ul上引物2ul下引物2ul5*buffer 10uldNTPs 5ulDD水28ulPfu（最后加）1ul四胶回收流程1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul下引物0.4ulMix 5ul回收产物1ulDD水 3.2ul六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ulBlunt cloning 0.5ul混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃之后转化1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术的概念与原理二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因2.构建基因表达载体3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与表达三、分子克隆技术在科研和生产中的应用四、分子克隆技术的发展趋势正文：一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是指在体外将各种来源的遗传物质——DNA 片段，与适当的载体DNA 相结合，然后导入受体细胞，使这些DNA 片段在受体细胞内复制、表达的操作技术。
分子克隆技术的原理主要基于重组DNA 技术，通过切割、连接、导入等步骤，实现外源基因与载体DNA 的重组，从而形成一个新的基因表达载体，最终达到在受体细胞中表达目的基因的目的。
二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因提取目的基因是分子克隆技术的第一步，通常采用PCR 扩增或化学合成的方法获取目的基因。
PCR 扩增是一种常见的方法，通过设计特定的引物，从基因组DNA 中扩增出目的基因。
化学合成则是根据目的基因的序列，通过化学合成方法直接合成目的基因。
2.构建基因表达载体构建基因表达载体是分子克隆技术的核心步骤，主要包括以下几个方面：（1）选择合适的载体：常用的载体有大肠杆菌的质粒等，根据实验目的和受体细胞的类型选择合适的载体。
（2）切割载体：使用限制性内切酶切割载体，暴露出载体的粘性末端，便于与目的基因连接。
（3）连接目的基因：将提取到的目的基因与切割后的载体DNA 片段通过DNA 连接酶连接，形成重组载体。
（4）转化受体细胞：将重组载体导入受体细胞，使目的基因在受体细胞内表达。
3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是分子克隆技术的关键步骤，根据受体细胞的类型选择不同的导入方法。
常用的方法有转化、转染、显微注射等。
4.目的基因的检测与表达在将目的基因导入受体细胞后，需要对目的基因进行检测和表达。
检测方法包括PCR、Western blot、南方杂交等，表达方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、酶联免疫吸附试验等。
构建克隆载体步骤
构建克隆载体步骤构建克隆载体主要有以下步骤：一、基本动作要领1. 目的基因的获取- 首先，如果是从基因组DNA中获取目的基因，咱们就得先提取基因组DNA。
就像摘果子得先找到果树一样，这里提取基因组DNA的方法有很多，像酚- 氯仿抽提法就比较经典。
提取的时候，一定要保证样本的新鲜度。
我之前就做错过，用了放置很久的样本，结果提取出来的DNA 质量特别差。
如果是从mRNA经反转录得到cDNA再获取目的基因的话，就要注意mRNA的质量了。
要使用质量好的逆转录酶，这就好比建房子得用好的砖头，mRNA就是建基因这座“房子”的砖头。
2. 载体的选择- 载体就像是一辆“车”，用来搭载我们的目的基因。
常见的载体有质粒、噬菌体、病毒等。
如果是简单的在细菌里克隆，一般就选质粒载体。
要根据自己的实验需求来选，比如要有合适的筛选标记，像抗药性基因之类的，这样才能方便后续筛选出带有重组载体的细胞。
3. 目的基因和载体的酶切- 这是很关键的一步，要选择合适的限制性内切酶。
就像开锁得用对钥匙一样，酶切位点必须是载体和目的基因上都有的，而且要在合适的反应体系里进行。
酶切反应的缓冲液、温度、反应时间都得严格控制。
我试过好多次，温度稍微不对，酶切就不完全。
反应体系里的底物浓度也要合适，别加太多或者太少的DNA，就像做菜加盐一样，得适量。
- 给大家简单画个示意图来理解一下。
就好比长条形的目的基因和环状的载体，用内切酶在特定的位置“咔嚓”一刀，这样就产生了可以连接的黏性末端或者平末端。
二、个人小技巧1. 在酶切之前，可以先做个小的预实验。
就像试水温一样，看看用什么浓度的酶、多长的反应时间是最合适的。
对了这里可以把目的基因和载体分别做预酶切，这样如果有问题就可以很快定位是哪一个的问题。
2. 在选择内切酶的时候，尽量选择产生不同黏性末端的酶，这样在连接的时候特异性会更好。
这就好比把两个不同形状的拼图碎片拼在一起，不容易拼错。
三、容易忽视的细节1. 酶切完后一定要进行凝胶电泳来检验酶切产物是否正确。
分子克隆主要步骤
分子克隆主要步骤分子克隆是一种常用的分子生物学技术，用于复制DNA分子。
下面是分子克隆的主要步骤：1.DNA提取：首先需要从一个已知的DNA源（例如细菌、动物组织等）中提取所需的DNA。
这可以通过使用不同的提取方法（如酚/氯仿提取、自动提取仪等）来实现。
2.限制性内切酶切割：将目标DNA切割成片段。
此步骤可以通过使用限制性内切酶来实现，这些酶可以识别特定的DNA序列，并在这些序列中切割DNA，形成切割产物。
3.DNA修饰：如果需要，在第2步切割的DNA片段末端添加修饰，以便后续步骤的操作。
例如，可以在DNA片段的末端添加磷酸基团（通过激酶酶和ATP）或羟基（通过糖转移酶和dTTP）。
4.连接DNA片段：将目标DNA片段与载体DNA（通常是质粒）连接起来。
这可以通过使用DNA连接酶，如DNA连接酶I或T4DNA连接酶，将DNA片段与载体DNA的末端连接。
5.转化：将连接好的DNA导入到宿主细胞中。
这可以通过转化（常见的转化宿主细胞包括大肠杆菌和酵母）来实现。
转化可以通过热冲击法、电转化或使用化学方法来进行。
6.筛选：在经过转化的细胞中筛选出带有目标DNA的细胞。
这可以通过将转化后的细胞接种到含有适当选择标记的培养基上来实现。
只有带有目标DNA的细胞才能生长并形成克隆。
7.复制：选取带有目标DNA的细胞进行培养，并使其进行大量复制。
这可以通过将细胞培养在含有适当培养基和条件的培养皿中来实现。
8.提取：从大量复制的细胞中提取含有目标DNA的质粒。
这可以通过使用质粒提取试剂盒来实现，其中包含了一系列的化学试剂和步骤，用于纯化和提取目标DNA。
9.鉴定：验证提取的DNA是否为目标DNA。
这可以通过进行限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法来实现。
分子克隆是一种重要的实验技术，可用于构建重组DNA分子、研究基因功能、制备蛋白质等。
虽然上述步骤描述了分子克隆的基本过程，但具体操作可能会因实验目的和需求而略有不同。
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分子克隆之载体构建完整步骤
一、目的片段的扩增和酶切
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(逆转录所得cDNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液及水。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。
准备：
A.模板DNA：质粒DNA，逆转录cDNA或挑菌落
B.引物配制：
a)存储液100uM：公司合成的引物干粉，13000rpm离心2min，加入管壁
nmol数x10ul的ddH2O振荡充分溶解。
b)工作液10uM：上下游引物存储液各10ul加80ul ddH2O混匀配制100ul
工作液。
终浓度200-400nM。
1. PCR反应体系(50ul)
Taq酶体系：Thermo
10x buffer （无Mg2+）5ul
MgCl2（25mM）5ul
dNTP （10mM）1ul
上下游引物工作液1ul
模板cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ul
Taq DNA聚合酶0.5ul
ddH2O 补充至50 ul
注：1. 其他体系如菌落PCR反应20ul按比例调整即可。
2. 其他公司Taq酶或2x buffer mix已包含Taq酶、dNTPs时作相应调整。
PCR仪设置反应条件：
95℃ 5min 预变性
循环x30-35：
变性95℃ 30s
退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-3~5℃）
延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：Taq酶效率约1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸
4-10℃ 保温
高保真Pfu酶体系（优选）：Thermo
10x buffer 5ul
dNTP （10mM）1ul
上下游引物工作液1ul
模板DNA或cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ul
pfu DNA聚合酶1ul
ddH2O 补充至50 ul
PCR仪设置反应条件：
95℃ 5min 预变性
循环x30：
变性95℃ 30s
退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-5℃，特殊酶如NEB公司Phusion高保真酶需要高退火温度，参考官网）
延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：pfu酶合成效率约600-1kb/min）
72℃ 7 min 补充延伸
4℃ 保温
2. 琼脂糖凝胶电泳验证
取5ul样品+1ul DNA Loading buffer（6x）混匀上样，150V恒压电泳30min，凝胶成像仪紫外观察保存电泳图片。
（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+ 1%琼脂糖, 加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60℃以下加入1/10000 Gelred染色液混匀倒板。
注：琼脂糖凝胶电泳检测如果有杂带侧需要割胶回收目的片段。
3. PCR产物纯化: （目前多数公司的PCR体系可兼容后续酶切反应，无需纯化）
根据PCR产物纯化试剂盒上流程回收PCR产物,最后用50 ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.
4. 酶切（50ul体系）
PCR产物:
PCR纯化产物43ul
10xBuffer 5ul
E1 1ul
E2 1ul 酶切反应条件：37℃反应过夜或者37℃反应2+h（Thermo 的Fastdigest系列快切酶，37℃反应30min-1h）。
PCR产物酶切纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物, 最后用30-50ul ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.
琼脂糖凝胶电泳检测：取2-5ul样品+1ul DNA Loading buffer混匀上样，150V 恒压电泳20-30min，保存电泳图片，确保回收到目的片段。
PCR产物酶切的简化步骤：
（1）取2-5ul PCR产物电泳验证是否有目的条带，若有，其余PCR产物直接进行酶切后切胶回收；若条带单一也可酶切后采用PCR产物纯化试剂盒回收。
（2）直接将全部PCR产物电泳，目标片段切胶回收；回收的PCR产物直接酶切：17ul 产物+2ul 酶切10x buffer+0.5ul E1+0.5ul E2，37℃反应过夜或者37℃反应2+h （或Thermo快切酶1h），80℃ 5min灭活可直接用于连接。
（确保酶切体系兼容后续连接反应体系）
二．载体制备
1. 质粒DNA的制备：用柱式质粒DNA小量试剂盒抽提我们所要的载体质粒。
2. 载体酶切（50ul）
质粒DNA 2-5ug
10xBuffer 5ul
E1 1ul
E2 1ul
ddH2O 补足至50ul
反应条件：一般pGEX-4T 37℃水浴3-4h，pET系列37℃水浴过夜（或Thermo 快切酶2h）。
3. 琼脂糖凝胶电泳及胶回收：取5ul酶切载体+1ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，同时等量未酶切的质粒做对照，保存电泳图片（切开后的线性载体应该是单一条带，比未酶切的环状载体跑得慢，后者通常可见线性、环状、超螺旋三条带）；切胶回收酶切载体，最后用30-50ul ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.
三、外源DNA片段插入质粒载体
1. 外源DNA片段与质粒载体的连接（10ul体系）
DNA片段 6.5ul/7.0ul/7.5ul
载体2ul/1.5ul/1ul
T4 DNA Ligase（Thermo）0.5ul
Buf T4 DNA Ligase 1ul
反应条件：首选16℃过夜连接，其次22℃常温1h或者4℃连接24小时。
一般目的片段与载体摩尔比约为5-10:1，但是这里我们通常是按体积比。
一定要做阴性对照：及上述体系连接酶以相同体积ddH2O代替。
2. 连接产物转化
将全部连接产物加入不少于10倍体积的感受态细菌（100ul分装的DH5a或TOP10）中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴静置2min，加入500-800ul（一般500）LB或SOB培养基，37℃ 200rmp恒温预培，40min-1h（若质粒为氨苄抗性无需预培养，时间允许不推荐）。
8000 rmp离心45s，沉淀保留约100ul上清，吹打混匀后均匀涂布抗性平板上。
37℃恒温箱培养14h以上。
附质粒转化步骤：
取质粒1ul或50-100ng加入50-100ul感受态细菌中，后续同连接产物转化步骤，预培养后无需离心，取100ul菌液涂板即可，37℃恒温箱培养过夜。
注：
1、一定要区分质粒和连接产物转化的不同。
2、根据实验要求选择所需要的感受态，克隆扩增用DH5a或TOP10，蛋白表达用BL-21。
3、在选择抗性平板的时候要根据所选载体和感受态两个方面确定。
四、克隆的筛选鉴定
（1）筛选鉴定- 酶切鉴定
1.挑取3-5个克隆接种到5ml LB培养基中，37℃恒温箱培养过夜。
按质粒小抽试剂盒步骤完成质粒提取，并测定DNA浓度。
2.酶切(20ul) 体系：
质粒DNA 0.5-1ug
Buffer 2ul
E1 0.5ul
E2 0.5ul
加ddH2O 至20ul
37度酶切2h，快切酶30min-1h。
琼脂糖凝胶电泳检测。
如果有目标条带，相应克隆的质粒送测序。
（2）筛选鉴定- 菌落PCR (20ul)
ddH2O 9.5ul
2x Taq buffer （Takara）10 ul
上下游引物工作液（10mM）0.5ul
模板为单菌落不算体积
配制方法：10个克隆，上述每种成分所需体积x10x1.125ul（1.125系数为防止枪头加样误差），混匀后，20ul分装PCR管备用。
挑菌落方法：挑菌落前准备相应抗性平板1-2块，画好方格，标记或编号，用10ul枪头挑选菌落后先在平板相应方格取中心点一下，再将枪头放入上述分装好的PCR管中吹打两下即可。
PCR反应条件（参考目标片段的PCR条件）：
95℃ 5min（95℃ 30s . 60℃ 30s . 72℃ 60s）x25 72℃ 5min. 4-10℃保温，电泳验证。
注：阳性率低时，每个项目需挑选5个以上单菌落做菌落PCR。
克隆验证：将电泳验证具有目标片段的克隆（对应平板的方格中），接种到5ml 含相应抗性的LB培养基，37℃ 200rmp培养过夜，小量提取质粒后送测序。