基因治疗时代到来：常用基因治疗载体的介绍与选择
基因治疗中的基因修饰载体选择与优化
基因治疗中的基因修饰载体选择与优化基因治疗是一种重要的生物技术，旨在通过向患者体内引入特定的基因来治疗或预防疾病。
一个关键的问题是如何有效地将目标基因传送到患者体内。
基因修饰载体的选择和优化是实现高效基因治疗的重要一环。
基因修饰载体是将目标基因传递到细胞内的介质，通常由两个主要组成部分构成：基因传递的载体（如病毒或质粒）和携带目标基因的DNA片段。
在选择和优化基因修饰载体时，以下几个因素需要考虑。
首先，选择合适的基因传递载体非常重要。
最常用的基因传递载体有病毒和质粒两种。
病毒有多种类型，包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒等。
病毒能够高效地传递基因到细胞内，但也存在一些潜在的问题，如免疫反应和基因传递的效率限制。
质粒则是一种无害的环形DNA分子，可以通过电穿孔、胶质转染或共转染等方式传递到细胞内。
质粒的使用相对安全，但传递效率较低。
因此，在选择基因传递载体时，需要综合考虑病毒和质粒的优缺点，根据治疗需求和目标细胞类型进行选择。
其次，目标基因的选择和优化也是基因修饰载体设计的关键。
目标基因的选择应该基于疾病的类型和特点。
例如，基因治疗用于治疗遗传性疾病时，目标基因可能是一个缺失或突变的基因，用于恢复蛋白质的功能。
在优化目标基因时，可以采用多种策略。
一种常见的策略是优化基因的信号序列，以确保基因在目标细胞中得到充分的表达。
另一种策略是使用启动子和增强子序列来调节基因的表达水平。
此外，还可以使用遗传密码子优化技术，使得目标基因在适应宿主细胞的转录和翻译机器时效率更高。
基因修饰载体的设计还需要考虑目标细胞类型和递送策略。
不同类型的细胞可能对基因修饰载体有不同的偏好。
例如，一些细胞具有高度易感性，可以通过简单的递送策略（如病毒转染或质粒电转染）实现高效基因传递。
然而，其他细胞类型可能需要经过基因修饰载体的定向修改，以提高基因递送的效率和特异性。
这种定向修改可以通过改变病毒或质粒表面蛋白的配体，或采用基因修饰载体与胶体或纳米粒子复合等方法实现。
基因治疗中的基因传递载体比较与选择建议
基因治疗中的基因传递载体比较与选择建议基因治疗是一种新兴的治疗方法，通过向患者的细胞中引入正常的基因，以纠正产生疾病的异常基因。
在基因治疗过程中，选择适当的基因传递载体对于基因的有效传递至关重要。
在此，我将比较常用的基因传递载体，并提供选择建议。
基因传递载体是一种用于将治疗性基因传递给细胞的工具。
它们可以是病毒或非病毒载体。
常用的病毒载体包括腺相关病毒（AAV）、腺病毒、逆转录病毒等。
而非病毒载体则包括质粒、脂质体等。
首先，我们来比较病毒载体和非病毒载体。
病毒载体具有高效的基因传递能力和长期表达的优势。
特别是AAV，因其能够稳定地整合到宿主基因组中，被广泛研究和应用于基因治疗领域。
然而，病毒载体也存在一些潜在的危险性，如免疫响应、细胞毒性和有限的装载容量。
此外，病毒载体的制备过程繁琐、昂贵且时间长，限制了其在临床应用中的推广。
相比之下，非病毒载体相对安全，制备简单、成本低廉。
质粒是常见的非病毒载体，具有较大的载荷容量和可定制性。
但是，非病毒载体的基因传递效率和稳定性较差，且易被内生性核酸酶降解，进而降低了基因传递效果。
基于以上比较，我提出以下建议：1. 在选择基因传递载体时，要根据具体情况考虑病毒载体和非病毒载体的优缺点。
如果治疗需要长期稳定的基因表达，可以优先考虑病毒载体，特别是AAV。
如果治疗方案需要大容量基因载荷或较短期的基因表达，非病毒载体如质粒可以是一个合适的选择。
2. 在使用病毒载体时，需要注意选择对目标细胞类型有亲和力且少有免疫反应的病毒载体。
对于AAV来说，不同亚型对不同细胞类型有不同的亲和力，因此需要进行亚型选择。
3. 需要充分评估基因传递载体的安全性。
病毒载体的毒性和免疫原性是关键问题，因此需要进行严格的体外和体内实验，评估载体的安全性和免疫原性。
4. 在选择非病毒载体时，应考虑其基因载荷容量、转染效率和稳定性。
需要进行合适的质粒构建和优化，以提高基因传递效果。
5. 不同疾病可能需要不同的基因传递载体。
基因治疗中的基因传递载体比较与选择建议
基因治疗中的基因传递载体比较与选择建议基因治疗是一种新兴的治疗方式，可以通过将特定的基因传递到患者体内，以修复或替代缺陷基因，从而治疗遗传性疾病。
在进行基因治疗时，选择合适的基因传递载体非常重要，因为它可以影响基因的有效性、安全性和稳定性。
在本文中，我们将比较常用的基因传递载体，并给出选择建议。
一、病毒载体病毒载体是最常用的基因传递工具之一。
它们具有高度传染性和高效的基因传递能力。
目前，常用的病毒载体主要包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒。
1. 腺病毒（Adenovirus）腺病毒被广泛用于基因治疗研究中。
它们能够传递大分子量的基因，并能够感染广泛的细胞类型。
腺病毒具有较高的转染效率和较短的表达时间，但由于免疫反应等问题，其基因传递效果较为有限。
2. 逆转录病毒（Retrovirus）逆转录病毒是一种RNA病毒，它能够将其RNA转录成DNA，并将其整合到靶细胞的基因组中。
逆转录病毒能够传递长期稳定的基因，并且可以针对特定细胞类型进行修饰，但其转染效率较低，并且由于整合位点的随机性，可能会导致不可预测的安全性问题。
3. 腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）腺相关病毒是一种非致病的病毒，其在人体中广泛分布。
AAV具有良好的基因传递能力和安全性。
它能够传递较短的基因序列，并能够长期稳定地表达基因。
然而，由于AAV的包装能力有限，其传递能力受到一定的局限。
二、非病毒载体相比病毒载体，非病毒载体在基因传递中具有更好的安全性和更低的免疫反应。
然而，非病毒载体传递效率较低，需要优化。
1. 基因枪（Gene gun）基因枪是一种通过加速金属微粒来传递DNA或RNA的方法。
它能够有效传递基因到细胞中，并且不受基因大小的限制。
尽管基因枪具有卓越的穿透性和稳定性，但它的应用仍然受到技术要求和操作复杂性的限制。
2. 转染剂（Transfection reagents）转染剂是基因治疗中常用的非病毒载体。
如何选择合适的基因载体用于基因治疗
如何选择合适的基因载体用于基因治疗基因治疗是一种利用基因载体将特定基因导入体内，以达到治疗疾病的目的的新兴疗法。
而基因载体在基因治疗中扮演着至关重要的角色，它决定了治疗效果的稳定性、安全性和有效性。
因此，选择合适的基因载体对于基因治疗的成功至关重要。
本文将从选择标准、常见的基因载体类型和近期研究进展等方面，详细探讨如何选择合适的基因载体用于基因治疗。
首先，选择合适的基因载体需要考虑以下几个标准。
首先，稳定性。
基因载体应具有良好的稳定性，能够保持所携带基因的稳定表达，避免基因丢失或突变。
其次，容量。
基因载体应有足够的容量，能够携带所需的基因片段或序列，以实现治疗效果。
接下来是毒性和免疫原性。
基因载体应具有低毒性和低免疫原性，避免对宿主产生有害影响。
此外，选择基因载体还要考虑其易操作性，比如是否易于转染和加工等。
目前，常见的基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两类。
病毒载体因其高效率、持久性表达和强大的转染能力而备受关注。
常见的病毒载体有腺病毒、适用于特定疾病治疗的单链RNA病毒等。
腺病毒作为一种常用的病毒载体，具有较大的基因携带容量和优良的转染效率，广泛应用于临床研究。
单链RNA病毒在近年来的研究中也取得了显著进展，其具有较小的基因载体，可携带较小的靶向序列，使其在特定疾病治疗中具有广阔的应用前景。
除了病毒载体外，非病毒载体也为基因治疗提供了很多选择。
常见的非病毒载体有质粒DNA、聚合物、脂质体等。
质粒DNA是最常用的非病毒载体之一，它适用于一些简单的基因治疗方案，具有操作简便、成本低廉的优势。
聚合物和脂质体则广泛应用于细胞转染和基因递送领域，其优点包括易于合成、调制、无免疫原性等。
近年来，随着基因治疗领域的迅速发展，基因载体的研究也取得了重要突破。
例如，纳米技术的应用使得基因治疗载体更小、更稳定，同时提高了基因的递送效率。
此外，基因编辑技术的发展，如CRISPR-Cas9系统，使得研究者能够更精准地改变基因序列，从而提高治疗效果。
基因工程载体及其选用
载体的选择标准
宿主范围
根据外源基因的表达和克隆需求选择合适的宿主 范围。
选择性标记
选择具有合适选择性标记的载体，以便于筛选和 纯化。
复制能力
选择能够在宿主细胞内稳定复制的载体，以确保 外源基因的持久表达。
插入容量
考虑载体的插入容量，以确保能够容纳所需的外 源基因片段。
基因组。
基因治疗
人工染色体可插入正常基因，通过基因转移技术将 其导入病变细胞，以治疗遗传性疾病和恶性肿瘤等 疾病。
生物制药
人工染色体可用来克隆和表达药物相关基因，为生 物制药提供有效的工具。
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基因工程载体的比较与选择
载体的比较因素
载体的基本结构与功能
01ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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质粒载体
通常由一个复制子、一个选择 性标记和一个多克隆位点组成 ，用于在细菌中克隆和表达基 因。
噬菌体载体
病毒载体
由噬菌体DNA和相关基因组成 ，用于将外源基因整合到宿主 细菌基因组中。
基于病毒DNA或RNA构建， 用于将外源基因导入细胞中进 行表达。
人工染色体
能在宿主细胞内稳定复制，并遗 传给下一代细胞的质粒，常用于 基因克隆和表达。
100%
表达型质粒
除了具有复制能力外，还能表达 出特定的蛋白质或性状，常用于 基因表达和蛋白质生产。
80%
穿梭质粒
一种既能复制也能整合到宿主细 胞染色体上的质粒，常用于基因 转移和基因治疗。
质粒载体的应用场景
基因克隆与表达
容量大小
不同载体能够容纳的DNA片段大小不同，选 择时应考虑外源基因的大小和复杂性。
基因治疗的三大类基因传递载体与基因传递效率评估
基因治疗的三大类基因传递载体与基因传递效率评估基因治疗是利用基因传递载体将修复或替代基因传递到患者的细胞中，以治疗遗传性疾病、癌症等难治性疾病的一种方法。
在基因治疗过程中，选择合适的基因传递载体和评估基因传递效率是非常重要的一步。
本文将介绍基因治疗中的三大类基因传递载体以及基因传递效率的评估方法。
第一类基因传递载体是病毒型载体。
病毒型载体可以将基因传递到目标细胞内，并整合到宿主基因组中，实现长期稳定的基因传递效果。
常用的病毒型载体包括腺病毒（Adenovirus）、逆转录病毒（Retrovirus）和腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）等。
这些病毒型载体具有高效率的基因传递能力，但也存在一些问题，比如免疫反应、随机插入等。
然而，病毒型载体在基因治疗中仍然是最常用的载体，因为它们可以针对不同类型的细胞和组织进行基因传递。
第二类基因传递载体是非病毒型载体。
非病毒型载体是指没有感染细胞的能力，通常可以通过物理或化学手段将基因传递到细胞中。
常见的非病毒型载体有质粒DNA、利用电穿孔或超声波破裂、脂质体等。
相比病毒型载体，非病毒型载体有许多优点，如安全性高、简易制备、规模化生产等。
然而，非病毒型载体的缺点是传递效率相对较低，对于某些细胞类型的基因传递效果较差。
第三类基因传递载体是基因编辑工具。
基因编辑工具一般用于精确修改基因，包括锌指核酸酶（Zinc Finger Nucleases，ZFNs）、类转录因子效应子（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和CRISPR/Cas9等。
这些工具可以通过靶向特定的DNA序列来实现基因的精确修饰，比如基因敲除、插入和突变等。
基因编辑工具具有高效的基因传递能力和精确性，但也面临着安全性和伦理问题的挑战。
为了评估基因传递效率，科研人员通常会采用多种方法来确定基因传递的效果。
基因治疗中基因载体的选择与制备方法
基因治疗中基因载体的选择与制备方法基因治疗是一种新兴的生物技术，旨在通过修改患者或被治疗个体的细胞或基因组，从而治疗某些遗传性疾病。
而在基因治疗中，选取适合的基因载体并进行有效的制备是非常重要的环节。
基因载体是将治疗目标基因引入患者细胞中的载体。
常见的基因载体包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体经过改造，使其具备携带外源基因的能力，并可安全地将其传递到目标细胞中。
而非病毒载体则通过物理方法将外源基因直接引入目标细胞。
选择适合的基因载体需要考虑多个因素，包括载体的携带能力、稳定性、毒性、免疫原性和适应性等。
病毒载体由于其自然而强大的感染能力，是最常用的基因载体之一。
常见的病毒载体有腺病毒、乙型肝炎病毒和逆转录病毒等。
腺病毒被广泛应用于基因治疗中，因其较低的免疫原性、能有效传递DNA负载和能稳定地整合到宿主细胞染色体中。
逆转录病毒则常用于基因治疗中的基因编辑，其逆转录酶能将外源基因逆转录为DNA并整合到宿主细胞基因组中。
非病毒载体则由于其较低的免疫原性和不会对宿主细胞的基因组产生影响而备受关注。
常见的非病毒载体包括质粒、合成肽和聚合物。
基因载体的制备方法是基因治疗中不可或缺的步骤之一。
制备病毒载体通常涉及病毒的扩增、负载外源基因、纯化和体积扩增等步骤。
通常，病毒载体的制备是通过细胞培养和转染实现的。
首先，将病毒载体的基因组与负载外源基因的载体进行重组，以构建含有外源基因的载体。
然后，将此载体转染至细胞中，通过细胞进行复制和扩增。
之后，通过离心等方法将病毒粒子从培养基中纯化出来，最终得到纯净、高效的病毒载体。
非病毒载体制备相对病毒载体制备来说较为简单，常用的方法包括钙磷共沉淀、电穿孔、脂质体转染和基因枪等。
钙磷共沉淀法是指将外源基因与钙盐共沉淀，形成核酸盐沉淀颗粒后，将其与细胞一同培养，使其穿过细胞膜进入细胞质。
电穿孔法是通过创造短暂的孔隙，使外源基因直接进入细胞内。
脂质体转染是通过外源基因与脂质体形成复合物，利用脂质体的疏水性与细胞膜相互作用，进入细胞质。
基因治疗中的新型载体与递送系统研究进展
基因治疗中的新型载体与递送系统研究进展基因治疗是一种利用基因技术来治疗疾病的新型治疗方法。
它可以通过改变、修复或替代患者体内的异常基因来治疗遗传性疾病、肿瘤和其他疾病。
然而，基因治疗的成功与否很大程度上取决于有效的基因输送系统。
载体选择和递送系统的设计是基因治疗研究中的重要环节，目前已出现了一些新型载体和递送系统，为基因治疗的发展带来新的机遇和挑战。
1. 载体的选择载体是基因治疗中输送基因的载体，目前常用的载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。
病毒载体是用病毒进行基因转移的载体。
腺病毒、腺相关病毒和腺病毒相关病毒在基因治疗中得到了广泛应用。
它们具有高传染性和高效率的特点，但安全性和规模化生产的问题仍然存在。
此外，病毒载体还可能引发免疫反应，限制了其在临床应用中的推广。
非病毒载体是指不使用病毒进行基因转移的载体。
脂质体和类脂体是常用的非病毒载体，它们具有低免疫原性、易于合成和改造的优点。
然而，非病毒载体在基因递送效率和稳定性方面还存在一些挑战，需要进一步研究和改进。
除了传统的病毒载体和非病毒载体，其他新型载体例如多肽、核酸酶和纳米材料等也正在被研究和开发。
这些新型载体可以提高基因递送的效率和特异性，为基因治疗带来更多可能性。
2. 递送系统的设计递送系统是指将基因载体成功输送到目标细胞的系统，包括体外递送和体内递送两个部分。
体外递送是指在体外为细胞输送基因载体，主要应用于基因疫苗、干细胞治疗和免疫疗法等领域。
体外递送可以通过脉冲电疗法、电穿孔、微粒轰击和磁场驱动等方式实现。
其中，微粒轰击是一种通过将基因载体与微粒一起加入细胞中，利用高速旋转离心或气动力学刺激，将基因载体推入细胞的方法。
体外递送方法的选择取决于目标细胞的特性和治疗的需要。
体内递送是指在体内为组织或器官输送基因载体。
体内递送可以通过直接注射、静脉输液、阴离子型聚合物、磁导航、热力学方法等方式实现。
其中，阴离子型聚合物在体内递送中得到了广泛的应用。
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基因治疗时代到来：常用基因治疗载体的介绍与选择
摘要：1989年Rosenberg等利用逆转录病毒载体实施第一例人类基因治疗实验，此后基因治疗研究在全球范围内逐渐展开。
2017年，基因治疗在癌症和罕见遗传病的治疗中接连取得了巨大成功，本文梳理了这一系列的标志性事件，重点讲述基因治疗中的载体选择。
2017年11月8日，Nature发表论文：Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells，通过逆转录病毒载体基因治疗，一位7岁的交界性大疱性表皮松解症（JEB）患者全身约80%的皮肤获得重建，且皮肤功能完全正常（图1）。
图1
2017年11月2日，NEJM发表论文：Single-Dose Gene-Replacement Therapy for Spinal Muscular Atrophy，以腺相关病毒9型（AAV9）为载体的基因疗法成功延长了15位1型脊髓性肌萎缩症（SAM1）患儿的生命（图2）。
图22017年8月30日，诺华公司治疗B细胞急性淋巴细胞白血病的以慢病毒为载体的CAR-T疗法Kymriah获FDA批准上市，成为FDA批准的第一款基因疗法（图3）。
图3以上三个基因治疗的标志性案例，使用了三种不同的基因治疗载体，分别是逆转录病毒（RV）、腺相关病毒（AAV）、慢病毒（LV）。
基因治疗载体分为两大类：病毒载体（主要包括慢
病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等），非病毒载体（主要包括裸露DNA、脂质体、纳米载体等）在讲基因治疗载体前，我们先讲一下基因治疗中的两个概念：in vivo 和ex vivo。
in vivo：活体直接转移,将带有遗传物质的载体直接注射到实验动物或人体内。
适用载体：腺相关病毒、腺病毒、非病毒载体等。
ex vivo：在体转移,将实验对象的细胞取出,体外培养并导入重组基因,而后将这些经遗传修饰的细胞重新输回实验动物体内。
适用载体：慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等。
接下来我们介绍以下常用的基因治疗载体基因治疗中的病毒载体
逆转录病毒（RV）：单链RNA病毒，可高效地感染多种类型细胞，可以将外源基因随机插入并稳定整合到宿主细胞基因组中持续表达。
其中γ-逆转录病毒载体最早被改造的且广泛地被应用到基因治疗中，并取得了不少巨大的成功。
不足之处：①不能感染非分裂细胞；②转录终止能力相对较弱，从而有可能造成转录通读；③可能产生有复制能力的病毒；④可能造成插入性突变，例如使用逆转录病毒载体治疗的10例X连锁重度复合型免疫缺陷病(X-SCID)患者中，有4例因载体整合在原癌基因LMO2等的附近，激活下游基因的表达而罹患白血病。
逆转录病毒的插入位点是随机的，但更偏向于插人基因的第一个内含子和转录起始位点。
此后人们开始重新审视基因治疗载体的使用所
带来的风险，此次使用逆转录病毒治疗JEB后，研究团队通过全基因测序确定了插入位点，发现有27000多个插入位点，但基本都集中在非编码序列，没有破坏已知的抑癌基因。
慢病毒（LV）：以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
属于逆转录病毒，能有效感染分裂细胞和非分裂细胞。
随机插入并稳定整合到宿主细胞基因组中持续表达。
一系列的临床研究效果非常理想，具有广阔的应用前景。
慢病毒因为也属于逆转录病毒，所以也存在因为随机插入造成基因突变的风险，但是一系列的临床研究证实，慢病毒载体相对于逆转录病毒来说安全性更高，适用性也更广。
腺病毒（AdV）：无包膜的线性双链DNA病毒，腺病毒载体宿主细胞范围广泛，有效感染分裂细胞和非分裂细胞，不与宿主细胞基因组整合，因而不存在插入突变风险，载体容量较大。
不足之处：①缺乏特异靶向性，在一些缺乏其相应受体的细胞中感染效率低；②目的基因的表达时间短，可能需要重复治疗；③有较强的免疫原性，例如18岁少年Jesse Gelsinger在接受Jim Wilson教授主导的腺病毒（AdV）的临床治疗中，因强烈的免疫反应去世（图4），此后Wilson教授找到了更适合更安全的用于基因治疗的病毒载体：腺相关病毒（AAV）。
腺相关病毒（AAV）：目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与复
制。
由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因治疗载体，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
除了上述几种常用的病毒载体外，在临床基因治疗中还有牛痘病毒载体、痘病毒载体、单纯性疱疹病毒载体等，由于使用较少，不再一一介绍。
图4--Jesse Gelsinger（图左），Jim Wilson教授（图右）基因治疗中的非病毒载体在临床基因治疗中，病毒载体存在潜在安全性问题，且病毒载体容量有限，这些缺点促进了非病毒载体系统的发展。
非病毒载体具有成本低、制备简单、便于大规模生产、安全性高、外源基因长度不受限制等优点。
最简单的非病毒载体是裸DNA，可直接注入特定的组织，特别是肌肉，能达到较高水平的基因表达，在临床基因治疗中裸DNA有着较为广泛的应用。
以及近期异军突起的纳米材料载体，之前BioWorld专门做过解读，详情点击右边：CAR-T新策略：纳米颗粒携带CAR载体在体内产生CAR-T 细胞。
非病毒载体虽然有着诸多优点，但也存在着明显的缺点：①转染效率不理想；②外源基因转导到宿主细胞后表达时间短，③非特异性靶向较高等，因此非病毒载体进入临床治疗还需要做更深入的研究与改进。
2017年，基因治疗领域的一系列成功，宣告了基因治疗时代的到来。
我们的最终目标是安全有效的治愈癌症和遗传疾病，这个在
之前看来的不可能任务正通过基因治疗在一步步实现。