抗体常见问题解答
抗体常见问题解答
常见问题：
1. 如何选择合适的一抗？
2. 如何选择合适的二抗？
3. 如何选择合适的同型对照？
4. 如何选择阳性对照？
5. 如何确定一抗的稀释比例？
6. 如何选择合适的抗原修复方式？
7. 为何WB检测条带大小与预期有差别？
8. 抗体能够用于其他种属/实验方法？
9. 如何确定抗体是否能用于未经验证的种属？
10. 抗体能否与该蛋白的其它亚型或同一家族其他蛋白交叉反应?
11. 如何保存抗体？
12. 如何分装抗体？
13. 能否提供抗体的免疫原序列？
1、如何选择合适的一抗？
请先确定您要检测的种属和使用的实验方法，然后查找相关产品，根据说明书上描述的“适用种属和实验方法”来确定合适的抗体。
如果说明书中有明确您要检测的种属和实验方法均经过检测，则您可以放心地购买该产品。
如果说明书中没有注明您用的种属和实验方法经过验证，那么请参考第8、9、10条。
Abcam网站所有说明书都是根据验证情况（Abcam实验室以及客户）实时更新的，所以可以放心参考！
2、如何选择合适的二抗?
二抗的选择原则：
针对一抗来源的二抗（比如一抗是小鼠来源的，二抗就要是抗小鼠的）
针对一抗Ig亚型的（比如一抗是IgM，二抗就要是抗IgM的抗体）
为了增加特异性、降低背景：可以选择Fab段的抗体（去除Fc段的）、经过标本来源种属血清吸附的的二抗
查看二抗的说明书，选择经过验证可以用于相应实验方法的二抗
Abcam提供各种种属、各种类型和标记的二抗，完全满足您实验的需要：
可以通过一抗说明书页面的“Related Products”来选择合适的二抗
通过产品分类目录选择合适的二抗
3、如何选择同型对照？
同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的，而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。
同型对照要与一抗的来源、Ig分型和标记完全一致。
例如：一抗是FITC标记，其抗体分型是小鼠的IgG1，则同型对照要选择是FITC 标记的小鼠的IgG1。
Abcam提供各种种属和Ig分型的同型对照产品，可以在Abcam和51AB的网站，
产品分类“Isotype”/“同型对照”中查找和选择合适的产品
多抗的同型对照：
绝大部分的同型对照产品都是单克隆抗体，因此不适用于作为多克隆抗体的对照（因为多抗含有多种IgG的亚型）。
Abcam同样提供了几种多抗的同型对照产品，满足实验者的需要。
4、如何选择阳性对照?
阳性对照的使用是一个实验中确定抗体及检测系统是否正常工作的依据，也是确定待测标本中是否存在待测蛋白的一个依据！尤其是检测的标本是不确定是否有待测蛋白表达时。
因此当实验没有阳性结果出现时，最好的选择是实验合适的阳性对照。
大部分Abcam的说明书上都有推荐的阳性对照。
但是如果说明书上没有推荐时，请参考以下条款：
看看说明书中是否有Abreviews。
任何被其他客户成功检测的组织、细胞或者裂解物均可以作为合适的阳性对照！
根据说明书上的Swiss-Prot或Omnigene数据库来查找。
这些数据库经常会列出该蛋白表达的组织，这也可以作为合适的阳性对照！
查查该蛋白的GeneCards吧，这里通常会有蛋白在不同组织的表达水平。
如果上述方法还是不能找到合适的阳性对照，推荐您去PubMed查查发表文章，看看有无文章报道该蛋白表达的细胞和组织
5、如何确定一抗的稀释比例?
如果说明书中有推荐的稀释比例，请按照该稀释比例进行实验。
但是由于标本类型、实验条件、操作环境等各种因素的影响，推荐浓度仅作为参考。
实验者需要在推荐浓度周围进行多个浓度梯度的实验，从中发现最佳的稀释比例。
如果说明书没有推荐稀释比例，仅注明“Use at an assay dependent dilution”，就需要做大量的预实验来摸索最佳的比例了。
下表列出的纯化抗体抗体用于不同实验方法时常用的工作浓度，可以作为预实验的参考。
未纯化的抗体一般在说明书中不会标明抗体的浓度，因为大部分全抗血清、培养上清或腹水形式的产品浓度都是没有经过测定的。
如果未纯化抗体产品的说明书中没有标明其中特异性抗体的浓度，实验者可以参考下表中“估计浓度”确定各种实验稀释比例。
请记住，下表中的各种稀释比例和工作浓度仅仅是作为一个起始点，需要根据试验结果来进行适当的调整。
最好以此起点作一系列的浓度，从中确定最佳的工作浓度和稀释比例！
6、如何确定适用于某种特定抗体的抗原修复方法？
有些抗体对抗原修复方式有特别要求的，一般在其说明书中都会有明确的标注和推荐。
但是很多抗体并没有一个特别的推荐，就需要实验者自己来进行优化和摸索了。
可以参考51AB网站实验方法中“免疫组化实验方法”以及abcam网站的的IHC protocols page查看更多的抗原修复方法
7、为何实际检测到的WB条带与预期的有所区别？
WB是根据蛋白质的大小来分离蛋白的，通常小分子量蛋白在凝胶中的迁移速度
要快。
但是迁移率也是受到其他因素影响的，这就造成了实际检测到的条带与预期条带的不一致。
主要有以下几种常见因素：
翻译后修饰－比如磷酸化、糖基化等，这些修饰会增加蛋白质的分子量
翻译后剪切－比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式，如pro-caspases
不同剪切体–有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式，每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的
相对电荷（Relative charge）–氨基酸的组成(charged vs non-charged)
多聚体－如二聚体或三聚体。
这些多聚体的形式通常会抵制WB时所做的还原条件，因此造成检测的条带偏大。
8、抗体是否能用于其他种属/实验方法？
关于某个抗体所有经过检测的种属和用途都标明在说明书上，并且会根据最新验证情况及时得到更新。
如果您希望购买某个产品用于未经验证的种属或者用途，我们鼓励您使用并将实验结果通过在线Abreview来发表（不论是阳性还是阴性的结果），这些结果会对其他的客户起到参考的作用。
对于每篇评论，我们会提供相应的积分（Abpiont），可以用于兑换礼品或折扣券来进行下次购买产品
9、如何确定某个抗体是否能用于未经验证的种属？
Abcam不能保证某个抗体能够成功的用于未经我们验证的种属，即使其序列同源性很高。
因为一个抗体能否用于检测其他种属的影响因素是非常多的。
如果没有其他的选择，您需要考虑购买抗体用于未经检测的种属时，推荐您先确定下该抗体所用免疫原与您要检测蛋白的序列同源性。
您可以通过网上说明书中“Swiss-Prot”来检测，也可以通过其他网站来查找。
如：EMBL-EBI，将说明书中的抗体免疫原序列和您要检测蛋白的序列输入后比较相同性。
如果相同性超过85％，则该抗体能成功检测您要测蛋白的可能性会比较高；但是，即使序列相同性超过85％，我们也不能保证该抗体一定能成功用于您的实验。
10、抗体能否与该蛋白的其它亚型或同一家族其他蛋白交叉反应？
对于一些抗体，说明书中明确指出了与其他蛋白的交叉反应（在‘specificity’项里）。
如果说明书中没有相关信息的话，我们推荐您比较该抗体的免疫原序列和其他您希望了解的蛋白序列。
您可以通过以下网站来进行序列的比较：EMBL-EBI将说明书中的抗体免疫原序列和您要比较蛋白的序列输入后比较相同性。
如果相同性超过85％，则该抗体与比较蛋白交叉反应的可能性会比较高；如果要确定没有交叉反应，则比较出来的同源性要非常低才行。
11、如何保存抗体?
我们坚持推荐您按照说明书上的推荐的储存方式来保存抗体。
如果您没有按照要求来保存抗体，那么我们很难保证抗体的效果
请仔细阅读我们的抗体保存指南
12、如何分装抗体?
请根据一次实验的用量来分装抗体，但是每份不应该少于10ul。
分装的体积越小，
抗体浓度受蒸发和管壁吸附的影响越大。
请仔细阅读我们的抗体保存指南
13、是否能够提供抗体的免疫原序列？
有些抗体其免疫原序列并不会标明在说明书上。
因为筛选合适的免疫原以产生最有效的抗体，其工作量是非常之大的，因此有时这些序列只有在客户特别索取时，才提供。
对于某些非Abcam自产的抗体，免疫原序列是商业机密，很抱歉我们不能提供给您（即使单独索取）
对于特异性表位（免疫原中的抗体结合区）基本上不会提供的，因为这是最核心的商业机密。
抗体是怎么产生的[产生抗体的治疗方法具体有哪些]
![抗体是怎么产生的[产生抗体的治疗方法具体有哪些]](https://360docs-1393072327.cos.ap-beijing.myqcloud.com/a9780bd709a1284ac850ad02de80d4d8d15a0191.webp)
抗体是怎么产生的[产生抗体的治疗方法具体有哪些]什么是乙肝抗体乙肝抗体最常见的有三种抗体，即表面抗体(抗-HB)、E抗体(抗-HBe)和核心抗体(抗-HBc)，乙肝还有其它抗体，因不常用，这里就省略了。
保护抗体抗-HB这是乙肝病毒表面抗原(HBAg)刺激人体免疫系统后产生的抗体，它是一种保护性抗体，也叫中和性抗体。
它能中和掉乙肝病毒的感染力，保护人体免受乙肝病毒再度袭击。
抗-HBS阳性至少说明三个问题：(1)乙肝病人到了恢复期，从此即将告别乙肝病毒感染;(2)既往感染过乙肝病毒，可能患过乙肝病，也可能是不知不觉中的隐性感染，但现在病毒已被清除，获得了对乙肝的免疫，即使有乙肝病毒侵入体内，也仍然安然无恙;(3)是注射乙肝疫苗并免疫成功的标志，当然也不会再感染乙肝病毒了。
在乙肝抗体三兄弟中，以抗-HBS最为特殊，它与乙肝抗原(HBAg、HBeAg和HBCAg)势不两立，它阳性，抗原们也就阴性了;只在很特殊的情况下，抗-HBS和HBAg才同时出现。
一定要注意的抗体滴度血清中的乙肝抗体滴度越高，保持力就越强，持续时间也越长(3~5年以上)。
再次感染乙肝病毒后，乙肝抗体滴度可在2周内明显升高。
一般情况下，乙肝抗体滴度的正常值为10mIU/ml，当乙肝抗体滴度大于这数值时，乙肝表面抗体便能够有效的保护体内。
一旦乙肝抗体滴度小于此数值时，乙肝表面抗体的保护能力减弱，此时，一旦健康人接触到含有乙肝病毒的血液，或者与携带乙肝病毒的患者亲密接触时，便有感染乙肝的可能。
这个时候，最好还是要到医院注射一支乙肝疫苗加强针，以增强保护力。
反应病毒情况抗-HBe这是乙肝病毒e抗原刺激人体免疫系统后所产生的抗体，它是在标志着乙肝病毒复制的HBeAg消失后才出现的，抗-HBe阳性，说明大多数乙肝病毒的复制停止，随之病情也会由活动变为静止。
医生在为慢性乙肝病人治疗时，希望达到的目标之一也是HBeAg转阴、抗-HBe转阳，这叫“血清HBeAg/抗-HBe转换”，这一转换非常好，病人由免疫耐受转为免疫激活，病毒由活跃、复制(高传染性)而趋于复制的静止(无或有很低传染性)，病情及病变活动也逐渐稳定和静止。
抗体的知识点总结
抗体的知识点总结一、抗体的基本概念1. 抗体是由B细胞分泌的一种具有特异性的免疫球蛋白，在机体免疫应答中发挥着重要作用。
抗体分子通常由两个轻链和两个重链组成，具有天然免疫和获得性免疫两种特性。
2. 抗体通过与抗原特异性结合，诱导了涉及多种细胞和蛋白质因子的免疫应答，进而引发了一系列的免疫反应。
3. 根据抗体结构和功能的差异，抗体在免疫功能中具有不同的作用，包括中和毒素、调解细胞毒作用、促进吞噬细胞作用等。
二、抗体的类型及结构1. 根据抗体在免疫应答中的作用和性质的差异，可以将抗体分为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE等不同类别。
其中，IgG是最为常见和重要的抗体，能够通过胎盘穿透到胎儿体内，同时参与包括补体激活、中和毒素、调节细胞免疫等多种免疫功能。
2. 抗体的结构包括变区和恒区，变区决定了抗体的特异性和亲和力，恒区负责介导一些抗体功能。
抗体的结构还包括Fab和Fc区，Fab区含有抗原结合部位，Fc区包含与Fc受体结合的位点。
三、抗体的免疫功能1. 抗体在机体免疫应答中发挥着多种功能，包括直接抗原特异性结合、调节细胞免疫作用、中和毒素、参与补体激活等。
其中，抗原特异性结合和中和毒素是抗体最为重要的两种功能，直接影响着免疫应答的效果。
2. 通过与抗原结合，抗体可以诱导免疫应答中其他细胞和蛋白质的参与，介导了免疫应答的进程。
同时，抗体还能够调节体液和细胞免疫的平衡，促进一些特定免疫效应的发生。
四、抗体的应用1. 抗体在临床医学中被广泛应用，包括免疫检测、治疗和预防等多个方面。
抗体可以用于检测特定抗原或特定病原体的存在，同时也可以用于治疗一些重要感染性疾病和自身免疫性疾病。
2. 抗体药物是当前临床上最为常见的生物制剂之一，已经被证实在癌症、炎症、自身免疫性疾病等多个疾病的治疗中具有显著疗效。
同时，抗体药物的应用不断拓展，逐渐进入到个性化治疗的时代。
五、抗体的研究进展1. 随着免疫和生物技术的进步，抗体研究取得了许多创新性成果。
狂犬病新免疫程序及常见问题解答
不同厂家，不同批号的狂犬疫苗 能交叉使用吗？
• 一般来说不主张在一个疗程中用两个类型、两个
厂家、甚至两个批号的狂犬疫苗。特别是生产厂 家怕注射中万一出现问题，不好判断是哪一个厂 家生产的产品出现的问题，以便分清责任。但是 经过许多观察，证实在迫不得已时可以替用。
《狂犬病暴露预防处置工作规范（2009年
“2-1-1”方案第一次注射两针，能 不能合在一支针管里一次注射？
不可以。 只有通过在两侧分别注射一剂，疫苗中的抗原
才会激发左右两侧的淋巴系统，产生更多的抗体，
免疫效果更好。因此，如果只在一个部位接种， 则达不到上述效果。
关于接种时间延迟的问题
第0天接种两针次后，第三针要求在第7天接种，
如果延后在三天内，也就是第十天前接种第三针
• 一般情况下最好在成大速达狂犬病疫苗全程免疫
完成后，再接种其它疫苗。在某种特殊情况下必 须在此期间接种其他疫苗时，则要求在不同部位 接种。
接种狂犬疫苗期间低热是否 需要推迟接种时间？
• 一般不用，如果是单纯发烧，而无其他症状，则
可能是感冒或其他炎症引起的，可以使用抗感冒 药物，但禁止服用兴奋类药物？
版）》未将2-1-1方案纳入范围，若病人有
疑问，该怎样解释？
• 《狂犬病暴露预防处置工作规范（2009年版）》 出台时，“2-1-1”方案还在注册申请阶段。因此 在规范第三十条中规定：“如药典或产品说明书 的内容发生变更，本规范的相关内容从其规定。” 目前，“2-1-1”方案已获得国家药监局批准，按 产品说明书的相应说明使用改程序是合法合理的。
“2-1-1”方案（Zagreb regimen ）
五针法和“2‐1‐1”方案接种程序比较
程序
第0天
抗体纯化常见问题回答
用户园地Q & A30鉴于亲和层析技术的发展,抗原抗体之间的特异性相互作用，使得抗体的纯化相对来说比较简单,一步亲和层析即可达到90%以上的纯度, 这为科研和实验室使用的抗体纯化提供很好的解决方案。
然而要得到高质量高纯度的抗体，需要我们从样品处理，纯化介质的选择以及纯化方法上悉心考虑，这里我们就这些大家常见的问题来讨论。
1，对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品，有哪些样品处理的方法？在纯化前，合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱，延长使用寿命。
对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂蛋白，酚红，小分子污染物等等。
腹水中经常含有高浓度的脂蛋白，这些脂蛋白和脂类物质会堵塞层析柱，最好能在纯化之前去除。
方法一是在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白，沉淀可以通过离心除去；方法二PVP能产生一个pH值依赖的沉淀效应，PVP在pH＝7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球蛋白。
很多时候，可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释腹水，不仅保证样品的结合pH，还有利于降低黏度。
酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂，虽然并不直接的影响纯化，但是酚红可能结合到某些纯化介质上，应该尽可能早的被除去，可以使用脱盐柱除去酚红。
对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除，如硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀的方法。
最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐，把样品换到合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分子。
更多详细的方法可以参考《抗体纯化手册》。
2，实验室需要纯化小鼠的IgG1，我是选择ProteinG还是ProteinA？首先我们要根据不同的种属亚型参考“相对结合强度”表（图1）来获取选择哪种配基的指导，针对小鼠的IgG1， ProteinA结合相对弱，可以选择ProteinG配基的介质。
但由于Protein G结合力较强，因此有时需要pH低于2.0才能有效洗脱，容易导致某些对酸敏感的抗体聚集沉淀。
单克隆抗体制备常见问题分析
单克隆抗体制备常见问题分析一、前言1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
虽然单抗技术已经非常成熟，但是由于其经济价值，仍然有很多人在从事这项研究，而且其中也会遇到很多这样那样大问题。
我本人就是其中一个，由于是第一次做单抗，所以过程中遇到了很多困难，终于在前几天得到了几株阳性克隆。
鉴于此，我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来，同时搜索了园子里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖，希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。
二、动物的免疫选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10,,0.5ml ip (腹腔内注射)? 2,3周后第二次免疫1×10,,0.5ml ip? 3周后加强免疫(融合前三天) 1×10,,0.5ml ip或iv(静脉内注射)?取脾融合2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂:福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫Ag 1,50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射? (一般0.8,1ml 0.2ml,点)?3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip? (ip剂量不宜超过0.5ml)?3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip? (5,7天后采血测其效价，检测免疫效果)?2,3周后加强免疫，剂量50,500μg为宜，ip或iv?3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如?将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
生物第四章免疫调节知识点
生物第四章免疫调节知识点一、知识概述《免疫调节知识点》①基本定义：免疫调节就是机体免疫系统通过各种方式来维持自身稳定、抵御病原体入侵的过程。
简单说呢，就像身体里有一支军队（免疫系统），免疫调节就是这支军队的指挥系统，指挥着各种免疫细胞、免疫分子去打坏蛋（病原体）或者管住自己人别乱来。
②重要程度：在生物学科中，免疫调节可是超级重要的。
要是没有免疫调节，咱们的身体就会被各种病菌、病毒随便欺负，身体就没法正常运转。
比如说，感染了艾滋病病毒后，病毒会攻击免疫系统，导致免疫调节出问题，人的身体就变得很脆弱，一点小感冒都可能要了命。
③前置知识：得知道细胞的基本结构和功能，像是细胞核、细胞膜、细胞质这些东西是干啥的。
还要了解一些基本的细胞类型，像血细胞有红细胞、白细胞等。
因为免疫调节主要就是各种细胞在干活，不知道细胞是咋回事儿，肯定理解不了免疫调节。
④应用价值：实际应用可不少呢。
在医学上，研发疫苗就是利用免疫调节的原理。
像新冠疫苗，打进去以后让身体的免疫系统认识一下新冠病毒的样子，等真的病毒来了，免疫系统就能很快做出反应把它干掉。
在日常生活中，大家都知道要保持健康的生活方式来增强免疫力，这也是跟免疫调节有关的。
二、知识体系①知识图谱：免疫调节在生物学里属于免疫系统这个大板块。
它跟细胞的识别、内环境稳态等知识点都有关系。
就像一张大网里的一个小网兜，如果免疫调节这一块不行了，整个大网（比如说人体健康这个整体情况）就会出问题。
②关联知识：和细胞的分化关系紧密，因为免疫细胞也是由造血干细胞分化来的。
像B细胞和T细胞，它们都是经过复杂的分化过程才有特殊的免疫功能。
还和神经调节、体液调节有点关联。
比如说有时候身体压力大、神经一紧张，也会影响免疫调节，可能这时候人就容易生病，这就是神经调节影响免疫调节的表现。
③重难点分析：- 掌握难度：有点难。
因为涉及到很多免疫细胞，名字都很拗口，像巨噬细胞、树突状细胞之类的，而且它们的功能还很复杂，有各自的分工又互相配合。
抗体纯化中的常见问题有哪些？
抗体纯化中的常见问题有哪些？抗体纯化中的常见问题有哪些？1、优质的抗体包含的条件：抗体的纯度⼤于95%（这⾥的纯度是指有效抗体的含量⽽不是单纯的电泳纯度）；抗体的活性（效价⾼）；抗体的稳定性（4保存10天⽆沉淀，-20保存3年以上效价⽆明显变化，反复冻融10次⽆沉淀）。
2、ProteinA/G纯化的不利因素：Protein A是⼀种⾦黄⾊葡萄球菌（Protein G是⼀种链球菌株）细胞壁蛋⽩质，能特异性地与⼈和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合（有时结合少许IgM），故此可以分离出IgG抗体。
但是Protein A/G却⽆法区分特异性IgG的Fc段还是⾮特异性IgG的Fc段，故此Protein A/G纯化出的是总的IgG蛋⽩。
腹⽔中含有⽩蛋⽩、γ球蛋⽩、巨球蛋⽩、转铁蛋⽩、细胞及其残⽚、脂肪、⼩⿏的各种杂蛋⽩（如游离的⿏IgG、IgM），⽽我们真正需要的抗体只占很少⼀部分（⼤约占15%左右）；⽽抗⾎清中的有效抗体也只占总IgG的30%左右，其余都是⽆关的IgG或⽆⽤的抗体；所以Protein A/G纯化的抗体看似“很纯”（电泳图），其实真正有效的“⽬的抗体”单抗只占⽐75%左右，（兔）多抗只占⽐30%左右。
3、利⽤抗原亲和纯化抗体的优缺点。
亲和纯化是抗体抗原的结合，理论上应该是纯度最⾼特异性最好的纯化⽅法，但是通常由于抗原的提取难度⾮常困难，所以获得⾼纯度的抗原并不是⼀件⾮常简单的事情。
当我们不能获得⾼纯度的抗原时亲和层析做出来的抗体也就不会那么纯了；另外亲和纯化时抗原抗体的结合⽐较牢固，要想分离抗原抗体就需要⼤幅降低洗脱液的pH值，抗体（蛋⽩）在这么低地pH下很容易变形失活，损伤是⽆法避免的。
故此种情况下纯化出的抗体稳定性差，4保存1天就会出现少许沉淀，反复冻融很容易产⽣沉淀。
4、纯化出的抗体效价低的原因。
效价低是因为特异性抗体含量少；有沉淀是因为抗体纯度不够，杂蛋⽩含量⾼，如果是亲和纯化的抗体，那么可能是由于纯化过程中，抗体受到了损伤，抗体的结构和性能有所改变引起的。
免疫组化(IHC)常见问题解析
免疫组化（IHC）常见问题解析2162 人阅读发布时间：2020-10-22 15:54免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。
然而理想是丰满的，实际操作起来却是骨感的，作为一种分析方法，常常会存在非特异着色的背景问题。
下图中靶点均为胞膜定位，左边背景着色严重，右边染色效果优良。
01 抗体质量问题抗体本身在靶点设计上如果特异性不够，会导致非特异着色。
一般来说，单抗在特异性上相比多抗是具有优势的，但多抗由于识别任一抗原上的多个表位，多抗可放大低表达水平靶蛋白的信号，对微小抗原变化（例如多态性、糖基化异质性或者轻微变性）的包容性更强，可用于非免疫原物种的靶蛋白的检测实验。
具体实验时，还应根据实际需要选择合适的抗体。
另外，抗体保存也应注意防腐及防止反复冻融。
02 内源性酶和生物素当选用肝、肾，脾组织作为样本时，由于这些组织本身含有较高含量的过氧化酶和生物素，对于使用Hrp或生物素-亲和素显色系统的实验都会造成非特异性染色。
对于内源性过氧化物酶，可以用0.9% 的双yang水来灭活。
对于内源性生物素，染色前将切片浸于25 μg/mL 亲和素溶液中15 分钟，PBS 清洗15 分钟后即可染色。
也可以24 mg/mL 的卵白素封片15 分钟。
03 抗体浓度过高获得良好的染色结果，一般应优化一抗的使用浓度，可参考供应商提供的说明书，但预实验也是必不可少的，摸索出最理想的工作浓度。
04 DAB 染色时间太长/变质DAB 的作用时间过长，同样会造成背景。
DAB 的显色时间不是一成不变的，实验时应及时镜检，出现浅棕色时，马上冲洗。
出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体有效浓度过低。
DAB 要保存于避光干燥的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。
抗体做不出来常见原因
抗体做不出来常见原因抗体生产是一个复杂的过程，涉及到许多关键步骤和因素。
以下是一些常见导致抗体无法成功制备的原因：1. 抗原选择：选择合适的抗原对于抗体的成功制备至关重要。
抗原应具有较高的免疫原性和抗原表位丰富性，能够有效刺激机体产生抗体。
如果抗原选择不当，可能无法产生充分的免疫反应，从而无法制备到高亲和力和特异性的抗体。
2. 免疫动物选择：合适的免疫动物对于抗体生产至关重要。
通常选择小鼠、兔子等作为免疫动物，但不同的动物对于不同的抗原可能具有不同的免疫反应。
如果选择的免疫动物与抗原不匹配，可能会导致低效的免疫反应和抗体产生。
3. 免疫方案设计：免疫方案的设计包括免疫剂量、免疫次数和间隔时间等因素。
免疫剂量过低可能无法刺激充分的免疫反应，免疫次数过多或间隔时间过短可能导致免疫耐受。
因此，免疫方案的设计需要根据具体的抗原和免疫动物进行优化，以提高抗体产生的效率和质量。
4. 免疫反应监测：免疫反应的监测能够及时评估免疫效果。
常用的方法包括ELISA、免疫组化、流式细胞术等。
如果免疫反应监测结果显示免疫效果不理想，可能需要调整免疫方案或重新选择抗原、免疫动物等因素。
5. 抗体纯化和检测：抗体的纯化和检测是确保抗体质量的重要步骤。
抗体纯化过程包括初步分离、亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。
如果纯化过程不完善，可能导致抗体含量低、杂质残留等问题。
抗体的检测方法包括Western blot、免疫印迹、免疫沉淀、免疫组织化学等。
如果检测结果不符合预期，可能需要重新考虑抗体生产的步骤和条件。
6. 抗体储存和保存条件：抗体的储存和保存条件会影响抗体的稳定性和活性。
通常抗体应保存在低温（通常为-20C或-80C）下，并避光、避湿。
如果抗体在储存和保存时条件不当，可能会导致抗体的降解、失活等问题。
7. 抗体特异性验证：抗体特异性验证是确保抗体能够准确识别目标分子的重要步骤。
常用的验证方法包括Western blot、免疫印迹、免疫组化等。
流式细胞抗体染色操作步骤及常见问题(详细版)
流式细胞抗体染色的操作步骤及常见问题一、实验物品准备水平离心机、流式细胞仪、流式细胞管、流式细胞缓冲液、细胞过滤器、15ml离心管、流式抗体、同型对照抗体、避光锡纸、移液器、细胞吸管、细胞计数仪等二、FC受体封闭试剂准备阻断Fc受体的试剂可用于减少非特异性免疫荧光染色。
一般标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数也可能是多克隆抗体。
其基本结构都由两部分组成，即包含有特异性结合抗原位点的Fab段和相对保守的Fc段，抗体的特异性表现在Fab段。
标记时利用Fab 段的抗原结合位点与细胞上抗原分子特异性结合，从而标记并且相对量化细胞表达该抗原分子的情况。
但是，有些细胞表面表达FcR(Fc receptor,Fc受体），如巨噬细胞、树突细胞、B淋巴细胞等，FcR可以与荧光素偶联抗体的Fc段进行非特异性的结合，对结果产生一定的影响。
目前封闭方法主要有两种：（1）用市面上卖的适量的CD16/32的抗体与样品细胞充分混匀，4℃孵育10-15min。
CD16/32是一种Fc受体, 能够与IgG的Fc段结合，而荧光素偶联抗体基本上是IgG抗体，所以在标记荧光素偶联抗体前可以用CD16/32抗体封闭样品细胞，使样品细胞表面的FcR都被抗CD16/32抗体结合，从而阻止后续荧光素偶联抗体与FcR的非特异性结合。
（2）用血清全IgG抗体与样品细胞充分混匀，4℃孵育10-15min。
比如研究人的细胞时，若荧光素偶联抗体来源于小鼠，封闭采用小鼠血清全IgG抗体。
注意：无论选用哪一种方法，原则是如果流式抗体可能与样品细胞的FcR发生非特异性结合，那么在标记荧光素偶联抗体之前先用流式抗体同源的全IgG抗体或CD16/32抗体进行封闭，使样品细胞表面的FcR饱和。
三、流式对照设置流式细胞实验对照设置非常重要，常见有阴性对照和单阳对照。
（1）阴性对照设置目的是去除自发和非特异荧光干扰。
阴性对照主要包括两个部分，即:空白对照（检测样本自发荧光）和同型对照（检测样本自发荧光+非特异性荧光）。