超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧化法）（适用于：SOD及各种抗氧化剂）操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
（空白参比：Tris-HCl 缓冲液）ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。
由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。
此时的ΔA为ΔA0。
3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。
超氧阴离子清除实验
·O2ˉ自由基清除实验(1) 实验原理黄嘌呤氧化酶黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。
·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。
(2)试剂Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。
实际配制500mL。
高压灭菌，室温保存。
PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度实际配制见记录本！HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml)实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。
NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱(3) 测定方法超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。
清除超氧阴离子自由基
清除超氧阴离子自由基
取0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液（PH8.2）5ml ，置于25℃水浴中预热20min ，分别加入4ml 不同浓度的提取液，25℃水浴中预热20min ，再加入3mmol/L25℃水浴中预热20min 的邻苯三酚溶液1ml ，混匀后于25℃水浴中准确反应5min ，加入10mol/LHCl 1ml 终止反应，于320nm 处测定吸光度，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品。
每个试样作三个平行样，取其平均值。
实验结果以清除率E 表示： E=空白
样品空白A A A -×100% A 样品用相同样品浓度的空白调零，消除样品颜色的影响。
注：A 空白是不加样液测一值（A 0），A 样品空白(A x0)是只加样液，其他用水代替。
2.5.2.3清除羟自由基
于试管中分别加入不同浓度的提取液2ml ，9mmol/L 水杨酸-乙醇2ml ，9mmol/L FeSO 4 2ml ，最后加入2ml 8.8mmol/L H 2O 2 启动反应，37℃反应15min ，以蒸馏水为空白对照，在510nm 下测量各待测液的吸光度。
考虑到本身的吸光值，以9mmol/L 水杨酸-乙醇2ml ，9mmol/L FeSO 4 2ml ，蒸馏水2ml ，不同浓度的样品溶液2ml 为提取液的本底吸收。
清除率的计算公式为：
·OH 清除率=0
)0x x (0A A A A --×100% 式中：A0为空白对照液的吸光度，Ax 为加入样品液后的吸光度，Ax0为提取液本底的吸光度。
中药对超氧阴离子自由基清除率的测定
第１ 期
林祥 潮等 ：中药对 超氧 阴 离子 自由基 清 除率 的测 定
３ ３
在表 ｌ 示 的光度 法 中，羟 胺氧 化法 由于 甲萘 胺溶 液不 稳定 ，因而 线性相 关性较 差 ；氯 所 化硝 基 四氮 唑蓝还 原法 和 四 甲基 偶氮 唑盐还 原法 都 需要 昂贵 的氮 唑类 化合 物 ； 照核黄 素法 光 中硫 代碳 酰腙 类化 合物 需要 合成 ；酶催 化法 需要 昂贵 的酶试 剂且 测定 条件 苛刻 ；而本 方法 只 需 用天 青 Ｉ 为指 示物 质 ，指示 反应简 单直 接 ，且指 示物质 易得 价廉 ，体 系稳 定性好 ，能快 作
液后 ， 向其 中一 支加 入 ０８ ０ｍｍｏ Ｌ的邻 苯三 酚溶 液 ，另一支 不加 。分 别用水 稀释 至 ．０ ３ ｍＬ ｌ ／
刻度 ，在 室温 下反应 １ ｎ ５ ｍｉ，以水 为参 比，用 １ ｍ 比色皿在 ６ ２ ｌ 波长 处测 定体 系 的吸光 ｃ ０ Ｙ ｎｌ
度 。设不加 邻苯 三酚 时体 系 的吸光度 为 ｏ ，加 入邻 苯三 酚后 体系 的吸光 度 为 １ ，则超氧 自
超氧 阴离 子 自由基 （ ２・ ０ 。）作 为生物 体所产 生 的一种 自由基 ，大 量研 究证 明 ， 自由基 的
作用 与 生物 衰老 、某些 疾病 的发病 机制 密切相 关 。关 于它 的清 除方法 ，光度 测 定 已有 一些报 道 【 ］ 以天青 Ｉ为指示 物质 ，褪 色光 度法 测定 中药 清 除超氧 阴 离子 自由基 未见 报 道 。本 １ ，但 文研 究发现 ，在一 定条 件下 ，天 青 Ｉ 能被超 氧 阴离子 自由基氧 化而褪 色 ，中药提 取物 可 以清
度值 记为 ２ 。 超氧 自由基清 除率 Ｒ ％ ： 二 × ０ ／ １０ ４
抗氧化活性实验方法
抗氧化活性实验方法（体外实验）之巴公井开创作1、清除DPPH自由基能力的测定称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH 溶液。
分别取2mL分歧浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。
取上清液于517nm处测吸光值。
用Vc作为阳性对照。
样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：DPPH()121100%A AA-=-⨯清除率A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。
2、总还原能力的测定在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和分歧浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃ FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。
Vc作为阳性对照。
3、对Fe2+离子螯合能力的测定分别取1mL分歧浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。
EDTA为阳性对照。
样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：Fe 2+()1201100%A A A -=-⨯螯合率 A 0—1mL 蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值； A 1—样品溶液反应后的吸光值；A 2FeCl 2溶液后的吸光值。
4、超氧自由基（O 2-）清除率的测定采取邻苯三酚自氧化法测定。
取50mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.2）4.5mL ，置25℃水浴中保温20min ，分别加入1mL 样品溶液和0.4mL 25mmol/L 邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min ，加入1mL 8mmol/L HCl 终止反应，于299nm 处测定吸光度（A x ），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。
超氧阴离子自由基的测定
超氧阴离子自由基的测定试剂：65 mmol·l-1PBS（磷酸盐缓冲液），10mmol·l-1盐酸羟胺，α-萘胺，乙醚，黄胺，三氯甲烷材料：叶片第一步：称取2 g叶片，加入6ml 65 mmol·l-1 PBS（pH 7.8），冰浴研磨成匀浆，四层纱布过滤，5000×g（4℃）离心10 min。
取1 ml上清液加入0.9 ml上述缓冲液和0.1 ml 10mmol·l-1盐酸羟胺，25 ℃温浴20 min。
然后取0.5 mlα-萘胺，于25℃下反应20 min，最后加入同体积乙醚充分摇动，1 500×g离心5 min，取粉红色水相测定530 nm的OD值。
同时做NO2-标准曲线，将[NO2-]乘以2得[O2-·]，结果以O2-·nmol·min-1·mg-1protein 表示。
第二步：实验组空白调零组PBS0.50.5盐酸羟胺0.10.1摇匀，25℃水浴加热10min实验组空白调零组提取液0.50PBS00.5摇匀，37℃水浴加热20min实验组空白调零组黄胺11α-萘胺10.5摇匀，37℃水浴加热20min实验组空白调零组三氯甲烷33↓10000r/min 离心 3min（5000r/min 6min）↓取粉色水相（上层）测定A530A530（NO2¯）=A（实验组）—A（空白调零组）备注：提取液：称取2 g叶片，加入6ml 65 mmol·l-1 PBS（pH 7.8），冰浴研磨成匀浆，四层纱布过滤，5000×g（4℃）离心10 min，收集得到的上清液。
超氧化活性自由的清除作用
1.2.3 鲽鱼鱼皮胶原蛋白肽清除超氧阴离子自由基能力的测定采用邻苯三酚自氧化法测定胶原蛋白肽对O2·ˉ的清除能力。
参考文献[9]中的方法于15 mL试管中依次加入4.0 mL去离子水，4.5 mL 50 mmol/L pH8.2 的Tris-HCl 缓冲液，0.2 mL胶原蛋白肽，混匀，25℃保温10 min。
取出后迅速加入0.3 mL 25℃保温10 min的邻苯三酚溶液（3 mmol/L，10 mmol/L HCl配制）。
混匀后立即在320 nm 下每隔30 s 测1 次吸光值，记录4 min 内吸光值的变化，回归求出吸光度的变化斜率。
空白管中用去离子水代替样品溶液，以10 mmol/L HCl代替邻苯三酚用以吸光值调零。
按照下式计算清除率。
清除率=（k0 – k）/k× 100%式中：k0为空白管吸光度变化斜率，k 为样品管吸光度变化斜率。
2、杨梅色素粗提物对超氧阴离子的清除作用量取Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.2）4.5 mL于10 mL比色管中，分别加入质量浓度为0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4和0.45 mg/mL 色素粗提物醇溶液1 mL，混匀于25 ℃保温20 min，取出后立即加入等温的25 mmol/L的邻苯三酚0.5 mL，混匀后于25 ℃水浴中反应5 min，再加8 mol/L HCl溶液1 mL终止反应。
以Tris-HCl缓冲溶液作为参比，空白对照组以酸化乙醇溶液（V (0.1 mol/L HCl)︰V (95%乙醇)=6︰4）代替样品，对照组以抗坏血酸代替样品，在λ425 nm 处测吸光度，取其平均值，计算清除率。
超氧阴离子清除率=（A0－A1）/A0×100%（2）式中：A0-空白对照组的平均吸光度；A1-样品的平均吸光度。
Tris － HCl 缓冲溶液的配制: 首先称量12. 110 0gTris，加去离子水溶解定容至1 000mL，即得0． 1mol /L的Tris 溶液。
羟基自由基清除能力测定法的简易操作图解-脱氧核糖降解法-脱氧核糖分析法
羟基自由基(·OH)清除能力测定法的简易操作图解（适用于各种抗氧化剂）文献来源[1] Xican Li. Solvent effects and improvements in the deoxyribose degradation assay for hydroxylradical-scavenging. Food Chemistry, 2013, 141(3):2082-2088.操作图解图1 羟基自由基(·OH)清除能力测定法（脱氧核糖降解法）的实验操作图具体方法1 溶液配制0.2 MKH2PO4溶液: 100mL蒸馏水+2.7218g KH2PO4。
0.2 M Na2HPO4溶液: 500mL蒸馏水+35.814g Na2HPO4·12H2O。
磷酸盐KH2PO4－Na2HPO4缓冲液phosphate buffer（0.2M, pH7.4, 100mL）：19mL0.2 MKH2PO4+ 81mL 0.2 MNa2HPO4. （注意：19：81是大概的体积比，具体的比例以pH=7.4为准）。
Na2EDTA溶液：（1mM, 25mL）：8.4 mg+25mL蒸馏水。
FeCl3溶液：（3.2mM, 5mL）：4.2 mg+5mL蒸馏水。
抗坏血酸溶液：（1.8mM, 50mL）：15 mg+50mL蒸馏水。
H2O2溶液：（50 mM,5mL）：30 mg 30% H2O2+5mL蒸馏水。
脱氧核糖溶液：（50 mM, 2 mL）：15 mg脱氧核糖+2 mL蒸馏水(该用量约可做40个数据) 。
三氯乙酸溶液TCA（10%, 10 mL）：1 g + 10 mL蒸馏水。
硫代巴比妥酸溶液TBA：（5%, W/V, 20mL）:取1gTBA+20mL蒸馏水+20mgNaOH (临用时配，超声溶解. 该用量可做40个数据) 。
样品溶液：选合适的溶剂（如甲醇、无水乙醇等），先配成1mg/mL的溶液试试。
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超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自
氧化法）
（适用于：SOD及各种抗氧化剂）
操作图解
具体方法
1 溶液配制
1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）
40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH
计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）
取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液
2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
（空白参比：Tris-HCl 缓冲液）
ΔA＝A325nm,300s- A325nm,30s。
由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。
此时的ΔA为ΔA0。
3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。
（空白参比：Tris-HCl缓冲液）
ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。
此时的ΔA为ΔA样。
3 计算公式
清除率＝(ΔA0-ΔA样)/ΔA0 *100
4 注意事项
由于连苯三酚自氧化反应对温度和pH值很敏感，而pH值又受温度的波动而变化。
因此，实验过程中，要严格控制温度。
缓冲液宜多，比色皿用3.5mL规格。
这样数据才比较稳定。
5 实验结果（以原儿茶酸为例）
采用文献[1]的改进方法，测原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力，结果如图2（pH7.4）。
用旧方法，在pH8.2时测量，结果有很大误差，是不可取的。
图2 原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力的对比（pH7.4 vs pH8.2）
参考文献:
[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.
致谢：本文由广州中医药大学李熙灿教授依据其发表的论文[1]，整理而成。