基因敲除细胞系构建流程
基因敲除技术的方法
基因敲除技术的方法
基因敲除技术是一种利用CRISPR-Cas9系统对细胞基因进行定向编辑和删除的新技术。
该技术可以帮助研究人员研究基因功能和疾病发生机制，以及开发新的治疗方法。
基因敲除技术的方法主要包括以下几个步骤：
1. 设计sgRNA：首先需要选择待敲除的基因，然后设计合适的sgRNA序列。
sgRNA是一种小RNA分子，能够将Cas9蛋白精确地指向目标基因，并切割该基因的DNA序列。
2. 转染sgRNA和Cas9：将sgRNA和Cas9蛋白导入目标细胞中。
通常采用的方法有脂质体转染、电穿孔转染等。
3. 筛选细胞：利用细胞内的修复机制，CRISPR-Cas9系统会在目标基因处切割DNA序列，并引起细胞的修复。
通过筛选，可以获得已经敲除目标基因的细胞。
4. 鉴定敲除效果：可以采用PCR、Western blot、qPCR等技术检测目标基因是否已被完全删除。
通过基因敲除技术，研究者能够研究目标基因对某种生物功能的影响，以及对疾病发生的贡献。
这一技术被广泛应用于生命科学研究领域，并在基因治疗等领域也具有广阔的应用前景。
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基因敲除沉默细胞构建流程
基因敲除沉默细胞构建流程一、细胞选择。
咱得先挑个合适的细胞呀。
就像挑衣服一样，得根据自己的需求来。
如果是研究某种疾病相关的基因，那可能就选和这个疾病有联系的细胞类型。
比如说要是研究癌症相关基因，癌细胞系就比较合适啦。
这个细胞呢，还得状态好，要是细胞本身就病恹恹的，那后面的实验肯定也不好做。
而且细胞的来源也要靠谱，可不能随便找个不明不白的细胞就开始做实验呀。
二、基因敲除工具选择。
接下来就是选个厉害的基因敲除工具啦。
现在有好多选择呢，像CRISPR - Cas9就超级火。
它就像是一把精准的小剪刀，可以在基因组上特定的位置把基因剪掉。
不过使用这个工具的时候也要小心哦，就像拿着小剪刀不能乱剪东西一样。
还有TALEN 之类的工具，它们也各有各的优缺点。
在选择的时候，得看看自己的实验条件、对敲除效率的要求以及成本之类的因素。
三、设计向导RNA（gRNA）要是选了CRISPR - Cas9系统呢，向导RNA的设计可太重要了。
这就像是给小剪刀指个路，告诉它要去剪哪里的基因。
这个gRNA的设计要尽量特异性强，可不能让它乱指一通，把不该剪的地方给剪了。
得根据基因的序列信息，精心设计这个小向导。
而且设计好之后还要验证一下，看看它是不是真的能准确地找到目标基因，就像考试之前要检查自己有没有带齐东西一样。
四、基因敲除操作。
然后就开始正式的基因敲除操作啦。
把细胞和设计好的基因敲除工具放在一起，让它们相互作用。
这个过程就像是一场小小的战斗，细胞在那里努力地维持自己的状态，而基因敲除工具则在想办法对基因进行改造。
在这个过程中，实验条件要控制好，温度呀、培养基的成分呀之类的，就像照顾小婴儿一样细心。
如果条件不合适，细胞可能就不高兴了，不按照我们预期的那样进行基因敲除。
五、筛选沉默细胞。
基因敲除之后，就要把那些成功被敲除基因的细胞筛选出来啦。
这就像在一群小朋友里面找出那些做了特定动作的小朋友一样。
可以利用一些筛选标记，比如抗生素抗性之类的。
基因敲除沉默细胞构建流程
基因敲除沉默细胞构建流程基因敲除沉默细胞构建，那可真是个超有趣又有点小复杂的事儿呢。
一、细胞选择。
咱们得先挑个合适的细胞呀。
就像挑水果一样，得找那种健康又有代表性的细胞。
这个细胞得对咱们要做的基因敲除有意义，比如说如果是研究某种疾病相关的基因，那就得找那种和这个疾病相关的细胞系。
而且细胞的状态也很重要哦，要是细胞本身就病恹恹的，那后面的构建肯定会出问题的。
这就好比要盖房子，得先选一块好地基一样。
二、基因敲除工具的准备。
三、转染细胞。
然后就到了把这个基因敲除工具送进细胞里的时候啦，这个过程叫转染。
这就好比是给细胞送快递一样。
有不同的转染方法呢，像脂质体转染就像是把工具包裹在一个小泡泡里，然后这个小泡泡和细胞融合，就把工具送进去了。
还有电穿孔法，这个就比较猛啦，用电来在细胞上打个小通道，让工具进去。
不过不管用哪种方法，都要把握好度，不能把细胞给弄伤了，要是细胞被弄得太惨，那它就没办法好好进行基因敲除的后续工作啦。
四、筛选敲除成功的细胞。
转染之后呢，并不是所有的细胞都成功地被敲除了基因哦。
所以咱们得把那些成功的细胞挑出来。
这就像是在一群小动物里找到咱们想要的那几只特别的小动物一样。
通常会用一些筛选标记来做这个事儿。
比如说如果给基因敲除工具带上一个抗药性的标记，那把细胞放到含有相应药物的培养基里，那些没有敲除成功的细胞就会被药物杀死，剩下的就是咱们成功敲除基因的细胞啦。
不过这个过程也得小心呢，有时候细胞会很调皮，会出现一些假阳性或者假阴性的情况，得仔细地去分辨。
五、验证基因敲除。
最后呀，可不能就这么轻易地相信细胞已经成功敲除基因了。
咱们得验证一下。
可以用好多方法来验证呢，比如PCR（聚合酶链式反应），这个方法就像是给基因做个小检查，看看那个基因是不是真的被敲掉了。
还有Western blot（蛋白质印迹法），这个是从蛋白质水平来看看那个基因对应的蛋白质是不是消失了。
只有经过这些验证，咱们才能真正确定构建出了咱们想要的基因敲除沉默细胞呢。
cas9 构建基因敲除细胞系 步骤
cas9 构建基因敲除细胞系步骤1. 设计gRNA序列需要设计合适的gRNA（guide RNA）序列。
gRNA是一种由RNA和DNA组成的分子，在CRISPR-Cas9系统中起到引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA的作用。
gRNA序列应当与目标基因的特定区域互补，并且要避免与其他基因的序列相互匹配。
2. 合成gRNA和Cas9蛋白合成设计好的gRNA序列，并将其与Cas9蛋白结合。
Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统中的核酸酶，能够与gRNA一起识别目标DNA 序列，并在其靶向区域引发双链断裂。
3. 转染细胞将gRNA和Cas9蛋白复合物转染到目标细胞中。
转染可以使用多种方法，如化学法、电穿孔法或病毒载体介导的转染等。
转染后，gRNA和Cas9蛋白会进入细胞质，并寻找目标基因。
4. 筛选敲除细胞系根据需要敲除的基因，选择适当的筛选方法来鉴定敲除细胞系。
常用的筛选方法包括PCR、Western blot和细胞克隆等。
通过这些方法，可以检测到目标基因的敲除情况。
5. 确认敲除细胞系对筛选出的细胞系进行进一步的确认。
可以使用DNA测序技术对目标基因的敲除位点进行测序验证。
此外，还可以通过功能实验来验证目标基因的敲除效果。
6. 存储和维护敲除细胞系成功敲除目标基因后，需要对敲除细胞系进行存储和维护。
细胞系应当保存在液氮中，以确保其长期保存和使用的稳定性。
同时，细胞系也需要定期培养和检测，以确保其生长状态和敲除效果。
以cas9构建基因敲除细胞系的步骤包括设计gRNA序列、合成gRNA和Cas9蛋白、转染细胞、筛选敲除细胞系、确认敲除细胞系以及存储和维护敲除细胞系。
这些步骤需要在实验室中进行，确保操作的准确性和稳定性。
基因敲除细胞系的建立为研究基因功能和疾病机制提供了有力的工具，对于深入理解生命活动和疾病发生发展具有重要意义。
【分享】基因敲除细胞株构建流程
【分享】基因敲除细胞株构建流程如果选择的方法不对，或者细胞株不对，不同的细胞株做基因敲除细胞系的改造会有什么变化呢？筛选细胞是基因敲除细胞成败的重要环节！如果没有正确的方法那么基因敲除的细胞株工作就不能顺利的进行，首先要知道影响基因敲除细胞系的主要关键点是什么？其次是要了解和熟悉具体的实验流程和实验步骤，让自己轻松的完成基因敲除细胞株的构建流程。
一. 如何选择基因敲除的细胞：1.关键点：支原体污染在绝大部分的实验室里都不太被重视，如果支原体污染了细胞，则会导致细胞产生很多问题：如细胞的增殖问题，同时还会影响细胞的代谢，产生的数据也会有很大的误差，所以在实验室里的技术人员都需要非常重视。
2.检测方法有两种：细胞培养和PCR鉴定。
3.基因敲除的优势：克隆形成率高，敲除效率高，细胞容易增殖，但是有一个例外就算是做了细胞基因敲除株的构建，也无法获得基因敲除的单克隆细胞，那就是没有多基因的问题；染色体不突变；难增殖的细胞；细胞的数量有限；做基因敲除细胞株难以得到纯合子敲除的细胞系的原因就是克隆的拷贝数太多。
4具体原因：只能是肿瘤细胞系，不能是永生细胞系，往往很多永生细胞系做起来都比较有挑战性，当在做基因敲除细胞株时，如果敲除效率是x，则拷贝数是n，那么纯合敲除的效率就是：x^n，可见效果就不显著了。
二. 基因敲除细胞系的敲除方法：1.建议首选：如果只是做常规的移码敲除，那么一个细胞里面只有2个基因位点，是很难保证两个基因位点是一样的移码，所以得到移码的数据也不同，当你在鉴定测序看图的时候就没有那么清晰，所以，选择片段敲除是一个较为有效的办法。
2.关键点：移码敲除在很多时候并不彻底，会在后续的实验中出现Western Blot的问题，出现神秘的条带，大片段的基因敲除是几kb的缺失，mRNA就没有目的蛋白的转录，Western Blot问题也解决了，鉴定敲除方法：纯合敲除细胞系，比移码敲除效率更高。
3.如何判断是大片段敲除的细胞系：主要是通过目的基因片段对PCR扩增的方式判断。
CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程
CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程Puro 抗性浓度摸索实验将细胞如下图1稀释。
给药7天后，弃培养液，用台盼蓝染色2 min，显微镜下观察细胞存活情况。
确定细胞多克隆细胞筛选和单克隆细胞筛选浓度。
图1 抗性浓度摸索单克隆形成验证实验细胞计数，将细胞悬液稀释混匀后加入96孔板，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养。
静置培养48 h后每日观察并记录单克隆形成情况。
sgRNA 靶标设计根据基因序列信息，设计 sgRNA。
靶标位点序列信息确认PCR扩增（图2），测序验证基因序列，以确定sgRNA区域有无SNP。
图2 靶标序列扩增sgRNA克隆引物合成根据sgRNA设计sgRNA克隆引物。
lentiCRISPRv2-sgRNA载体构建退火，连接，转化，涂板（LB/Amp）培养。
lentiCRISPRv2-sgRNA载体验证每个实验组各挑取6个单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提效果（图3）。
图3 质粒抽提酶切验证：取3个单克隆进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果（图4）。
选择2个样品送样测序。
图4 单克隆酶切验证病毒包装lentiCRISPRv2-sgRNA无内毒素质粒提取，病毒包装。
细胞转染配制梯度病毒稀释液，细胞于培养箱中静置培养48h。
阳性单克隆细胞株筛选细胞转染48h后，更换完全培养基，筛选至对照组大部分细胞死亡，实验组细胞扩大培养，进行单克隆筛选。
几天后挑选阳性单克隆进行扩增，并取样验证。
阳性单克隆细胞株验证测序验证阳性单克隆细胞株的基因序列，以确定是否敲除成功。
实验结果示例：该基因有两个单克隆细胞株，A1和A2。
单克隆细胞A1的目的基因在sgRNA2位置出现两种突变形式，分别缺失1个和19个碱基，在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子。
单克隆细胞A2的目的基因在sgRNA2位置发生突变，插入1个碱基，在新序列的第340位碱基提前出现终止密码子。
CRISPR实验流程
CRISPR/Cas9 实验流程一、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的详细过程1.1 确定待敲除基因的靶位点1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）1.3 构建表达sgRNA的质粒1.4 sgRNA活性检测1.5 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。
找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。
按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。
对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。
如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列。
一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。
而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。
因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。
不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。
因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。
根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos。
1.3、构建可表达sgRNA的质粒（Precut SgRNA Cloning kit and pSD-gRNA Plasmid构建试剂盒）将合成的Oligos以逐步降温的方法退火成双链，然后与我们提供的质粒进行连接，连接后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。
同源重组敲除基因步骤
同源重组敲除基因步骤第一步：设计构建同源重组敲除基因的构建体1.选择目标基因：确定要敲除的目标基因，通常选择对细胞或个体生存具有重要作用的基因。
2.设计修饰子：通过设计修饰子使目标基因发生敲除。
常用的修饰子包括启动子，转录终止子，脱氧核苷酸连接位点和选择标记等。
3.构建构建体的载体：选择合适的载体，将修饰子和选择标记序列连接在一起，构建构建体的载体，通常为质粒或病毒载体。
第二步：构建构建体的DNA片段1.文库筛选：根据目标基因的序列，选择合适的文库进行筛选，以获取包含目标基因首尾序列的克隆。
2.PCR扩增：使用目标基因的首尾序列为引物，进行PCR扩增，得到目标基因的DNA片段。
3.克隆目标基因：将PCR扩增的目标基因的DNA片段连接到构建体的载体上。
第三步：构建转基因动物胚胎干细胞库1.培养胚胎干细胞：从小鼠或其他动物的胚胎中分离胚胎干细胞，并在适宜培养基中进行培养。
2.转染构建体：使用适当的转染技术将构建体转染到胚胎干细胞中。
3.筛选转染细胞：通过筛选选择已经内含构建体的胚胎干细胞进行下一步的实验操作。
第四步：构建敲除基因小鼠模型1.筛选胚胎干细胞：将筛选出的含有构建体的胚胎干细胞注入到小鼠的早期胚胎中。
2.基因敲除小鼠的获取：将经过注射的早期小鼠胚胎移植到代孕母鼠的子宫中，等待小鼠的出生。
出生后通过PCR检测小鼠的基因是否被敲除。
第五步：分析敲除基因小鼠1.分离小鼠基因组DNA：从小鼠的组织或细胞中分离基因组DNA。
2. 使用PCR或Southern blotting等方法检测是否敲除基因：利用PCR或Southern blotting等分子生物学方法检测小鼠组织或细胞中目标基因是否被敲除。
3.表型分析：通过对敲除基因小鼠进行行为学、生理学、病理学或其他实验方法的分析，评估目标基因对小鼠表型的影响。
以上是同源重组敲除基因的主要步骤。
通过这些步骤可以对目标基因进行敲除，进而研究其功能以及生成相应的基因敲除动物模型，从而更深入地了解基因的生物学功能与作用机制。
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基因敲除细胞系构建流程
基因敲除细胞系构建流程通常包括以下步骤：
1. 确定目标基因：选择需要敲除的目标基因。
2. 基因敲除设计：设计合适的靶向序列，该序列将在基因敲除过程中与目标基因发生特异性的DNA双链断裂。
3. CRISPR-Cas9系统构建：构建CRISPR-Cas9系统，其中包
括Cas9核酸酶和相应的靶向RNA（sgRNA）。
4. 细胞系培养：培养适合的细胞系，如细胞株或原代细胞。
5. 转染：将CRISPR-Cas9系统转染到细胞中，可以使用化学
转染、电转染或病毒载体转染等方法。
6. 筛选敲除细胞：在转染后的细胞中，通过添加选择性抗生素或使用基因标记物等方法，筛选出含有目标基因敲除的细胞。
7. 制备克隆：将筛选出的细胞进行单细胞克隆，并培养扩增。
8. 确定敲除效果：通过PCR、Western blot、流式细胞术或其
他适合的实验方法检测敲除细胞的基因表达水平和蛋白质表达。
9. 验证敲除细胞的功能：通过细胞功能实验，如细胞增殖、凋亡、迁移等实验，验证目标基因敲除对细胞功能的影响。
注意：以上流程是一般化的基因敲除细胞系构建流程，具体步
骤和条件可能因实验目的、细胞类型、基因敲除方法等而有所不同。