不同窖龄窖泥中放线菌的荧光定量PCR研究_裴乐乐

DOI ：10.13746/j.njkj.2014384基金项目：国家自然科学基金资助项目（31071585）。

收稿日期：2014-09-05作者简介：裴乐乐，男，在读硕士，研究方向：食品科学，E -mail ：peilenanyang@ 。

通讯作者：张文学，男，教授，博导，研究方向：发酵工程，E -mail ：foodbiotech@ 。

优先数字出版时间：2015-01-21；地址：/kcms/detail/52.1051.TS.20150121.1438.001.html 。

不同窖龄窖泥中放线菌的荧光定量PCR 研究裴乐乐1，罗青春1，刘超兰1，吴正云1，张文学1，2（1.四川大学轻纺与食品学院，四川成都610065； 2.四川大学锦江学院白酒学院，四川眉山620860）摘要：放线菌在浓香型白酒生产的发酵窖泥中普遍存在。

为了探究不同窖龄窖泥中放线菌的变化规律，选取了两个知名酒厂窖龄分别为5年、20年、50年和1年、20年、50年的窖泥样品，并通过荧光定量PCR 方法定量检测窖泥中放线菌的原始Copies 数。

结果表明，同一酒厂相同窖龄的不同窖池窖泥中，放线菌数量较为接近。

随着窖泥窖龄的增加，放线菌的Copies 数随之增加。

研究结果为进一步揭示窖泥微生物变化规律以及判断窖泥的老熟程度提供了相关依据。

关键词：窖泥；放线菌；荧光定量PCR ；白酒中图分类号：TS262.3；TS261.4；TS261.1文献标识码：A文章编号：1001-9286（2015）03-0001-04Quantitative Real-time PCR Analysis of Actinobacteriain Pit Mud of Different Pit AgePEI Lele 1,LUO Qingchun 1,LIU Chaolan 1,WU Zhengyun 1and ZHANG Wenxue 1,2(1.College of Light Industry,Textile &Food Engineering,Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610065;2.School of Liquor-makingEngineering,Jinjiang College,Sichuan University,Meishan,Sichuan 620860,China)Abstract :Actinobacteria is commonly existed in pit mud of Nongxiang Baijiu(liquor).In order to investigate the change rules of Actinobacte-ria in pit mud of different pit age,pit mud samples from two famous distilleries with their pit age as 5years,20years and 50years,and 1year,20years,and 50years respectively were selected,the original Copies number of Actinobacteria in those samples were detected by Real-time PCR.The results showed that,the quantity of Actinobacteria was similar in pit mud from different pit of the same pit age and from the same dis-tillery;with the increase of pit age,the number of Copies increased.This study was helpful to further reveal the change rules of microbes in pit mud and to judge the aging degree of pit mud.Key words :pit mud;Actinobacteria ;real-Time PCR;Baijiu(liquor)窖泥是生产浓香型白酒的关键,窖泥内的微生物的种类和数量，在一定程度上决定了浓香型白酒的香气和口味[1]。

近年来，我国学者在运用传统分离培养方法研究窖泥微生物的同时，开始应用分子生物学方法研究窖泥中微生物的分布情况与变化规律。

罗青春等人应用荧光定量PCR 研究了不同年份窖泥中主要产甲烷菌的变化规律[2]。

施思、邓波[3]等通过PCR -DGGE 结合聚类分析技术比较了不同酒厂的不同窖龄窖泥中的细菌群落差异。

王明跃应用PCR -ARDRA 和16S rDNA 克隆测序技术对不同窖龄窖泥古菌群落结构进行研究，揭示了不同窖龄窖泥古菌系统发育多样性的差异与窖泥老熟的关系[4]。

张超、王涛[5]等通过对不同多粮浓香型白酒厂中窖泥、糟醅和大曲中放线菌的分离及系统发育树分析，探讨了多粮浓香型白酒生产中放线菌的多样性。

因此，分子生物学方法在窖泥研究中的应用，进一步加深了对窖泥中微生物群落结构的认识。

荧光定量PCR （Real -time PCR ）技术是近年来发展起来的新的检测方法，与常规PCR 相比具有明显优越的灵敏度、特异性和操作简单的特点[6]，可以准确地将样品的初始基因拷贝数计算出来，整个过程只需4～5h 。

实时荧光定量PCR 技术发明至今，人们已经利用实时荧光定量PCR 技术的优越性将其广泛运用于医学诊断、海关检验检疫、新型农业、基础研究等领域[7-10]，但目前用于传统酿造行业的研究还较少。

放线菌是与人类生活密切相关的一类特殊细菌，其代谢产物一直是食品工业和医学上的研究热点[11-12]。

现有研究显示，放线菌可能会促进浓香型白酒主体香味物质的形成[13]。

窖池窖龄与酿酒质量关系极为密切，只有老窖泥才能出好酒[14]。

但目前对窖泥中放线菌的研究仍然较少，对不同年份窖泥中放线菌的研究更少，本研究应用荧光定量PCR技术对2家知名酒厂不同窖龄窖泥中的放线菌进行研究，反映放线菌在不同窖龄窖泥中的数量变化趋势，为进一步揭示窖泥中微生物变化及窖泥老熟程度提供相关依据。

1材料与方法1.1材料、试剂及仪器实验样品采集：窖泥样品取自四川的两个国家名酒厂，分别为5年、20年、50年和1年、20年、50年窖池的窖底泥，每个窖池分别在窖底4个角落和接近中心点的一点各取一个样，在无菌袋中混匀后于-20℃冷冻密封保存。

其中，不同窖龄的窖泥有2个平行样品，分别取自同一窖龄的不同窖池。

试剂：SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO，日本)，普通质粒小提试剂盒(TIANGEN)，琼脂糖凝胶DNA片段纯化回收试剂盒，OMIGA土壤试剂盒。

仪器设备：高速冷冻离心机(Thermo Scientific，美国)、梯度PCR仪(TECHNE，英国)、DYY-5电泳仪(北京六一，中国)、电泳槽(北京六一，中国)、凝胶成像仪(Bio-Rad，美国)、微量核酸与蛋白质分析仪(GE，美国)、Lightcycler Nano(Roche，瑞士)。

1.2实验方法1.2.1样品总DNA的提取采用反复冻融裂解细胞法与试剂盒相结合的方法对窖泥样品的总DNA进行提取。

具体步骤参照罗青春的方法进行[2]。

1.2.2引物合成与重组标准质粒的构建本实验用于扩增放线菌的正向引物序列为Act920F, TACGGCCGCAAGGCTA，反向引物序列为Act1200R, TCRTCCCCACCTTCCTCCG，变性温度为65℃[15]，引物与重组标准质粒由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3标准曲线的构建参照相关方法构建标准曲线[2]，PCR反应循环条件(采用三步法)[15]：50℃保持2min，95℃预变性10min，95℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸15s，共进行40个循环。

每个浓度2个平行，构建标准曲线。

1.2.4荧光定量PCR扩增曲线的建立分别取1μL窖泥样品DNA为模板，空白对照以水补充至总体系20μL，以Act920F/Act1200R为引物，采用1.2.3中所述的反应体系和反应条件。

标准质粒、样品及空白对照均做2个重复，获得标准质粒和待测样品的扩增曲线。

2结果与分析2.1荧光定量PCR方法的建立2.1.1标准曲线在进行荧光定量时,Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。

因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

本研究分别以105～109copies/mL和106～1010cop-ies/mL梯度浓度的标准质粒为模板，建立放线菌含量标准曲线。

其回归方程、相关系数及扩增效率见表1。

重组质粒标准曲线见图1。

由表1可知，两组荧光定量PCR标准曲线的回归方程相关系数均＞0.99，其扩增效率均＞97%，这说明荧光定量PCR扩增效果较好。

2.1.2检测限与荧光定量方法的灵敏度标准质粒以10倍梯度稀释，取1010～101copies/mL 表1放线菌荧光定量PCR标准曲线相关性分类放线菌(酒厂1)放线菌(酒厂2)线性回归方程Cq=-3.34log10(q)+55.18Cq=-3.37log10(q)+56.26相关系数R20.99570.9901扩增效率(%)99.197.9图1荧光定量PCR标准曲线(a.酒厂1，b.酒厂2)梯度浓度的质粒作为模板，按照构建标准曲线的方法进行qPCR检测，建立Cq与目的DNA初始拷贝数的对数线性关系，当线性系数达到良好时[19]（相关系数R2≥0.98，扩增效率90%≤E≤110%），所对应的最高Cq值作为方法的最低检测限，也就是方法的灵敏度。

放线菌门质粒最高Cq值分别为32.538，代表检测放线菌的检测限。

因此，定量检测时，样品的Cq值不能超过放线菌相应的检测限，否则定量检测不准确。

2.2窖泥中放线菌的荧光定量PCR检测分别对两个酒厂5年、20年、50年和1年、20年、50年窖龄窖泥中的放线菌数量分布进行探讨，同一窖龄窖泥分别做两个平行检测，分析放线菌在同一窖龄不同窖池中的分布情况，结果见表2。

由表2可知，同一窖龄不同窖池窖泥的放线菌Ct值较为接近，说明同一窖龄窖泥中的放线菌含量比较相近，这可能是由于同一窖龄窖池窖泥的微生态环境相近导致。