人乙醛脱氢酶2 (ALDH2)多态性分析

根据已知DNA片段两端序列设计引物，一端是等 位基因特异性引物，另一端是共同引物；
对已知基因 DNA 片段再进行PCR特异扩增；
特异的引物配对可以扩增出某一特异基因型的片 段，根据扩增出来的DNA条带大小的差异，可以 分析基因型（纯合型、杂合型）
ALDH2引物
AL1 5’-TAG GAC ACT CAC AGT TTT CACAT C-3’ (78bp) AL2 5’-CTC TCA CAG TTT TCA CTT T-3’ (73bp) AL3 5’-AAG ATG TCG GGG AGT GG-3’
• 凝胶结构均匀，孔径较大， 可用来分离酶的复合物、核 酸、病毒等大分子物质。
• 透明度较好，可直接或干燥 成薄膜后进行染色。
• 不吸收紫外光，可直接利用 紫外光吸收法作定量测定
• 有热可逆性
缺点
• 机械强度差，易破碎，浓度 不能太低。
• 易被细菌污染，不易保存， 临用前配制。
• 琼脂糖支持层上的区带易于 扩散，电泳后必须立即固定 染色。
➢ 引物浓度0.1-0.5 mol/L，浓度过高易导致模 板与引物错配，反应特异性下降
➢ Taq DNA聚合酶0.5-2.5 U/50 l，酶量增加使 反应特异性下降;酶量过少影响反应产量
➢ 四种dNTP浓度应相等 ➢ Mg2+ 是DNA聚合酶的激活剂，0.5 ～2.5mmol/L
基于PCR的扩增产物长度多态性 （PCR-APLP）
综合实验二
人乙醛脱氢酶2 (ALDH2)多态性分析
---PCR-APLP以及PCR 产物电泳鉴定及结果分析
综合实验
（一） 基因组抽提
（二） PCR-APLP
（三）
PCR产物电泳鉴 定及结果分析
已经完成
PCR反应液配置
① 2* Master Mix ② 模板--即抽提的基因组DNA片段 ③ 引物 ( AL1+AL3) or (AL2+AL3) ④ H2O
10 μl 3 μl 2 μl 5 μl
每个样品分2管进行扩增
PCR反应条件 （DNA扩增仪设定反应条件）
预变性：
94℃ 10 min
模板DNA的变性：
94℃ 30 sec 39
模板DNA与引物的退火： 58℃ 30 sec
个 循
引物延伸：
72℃ 30 sec 环
末次循环后延伸：
72℃ 10 min
1.0 0.25-12 0.4-8
0.4-8
1.2
0.15-6
0.3-7
0.3-7
1.5
0.08-4
0.2-4
0.2-4
2.0
0.1-3
0.1-3
3.0
0.05-1
4.0
6.0
低黏度低熔点 (kb)
0.5-1 0.1-0.5 0.01-0.1
电泳缓冲液
TAE、TPE及TBE都是常用电泳缓冲液。三者相比： 1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝
电泳
1. 待胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约20分 钟），小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳 槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶12mm。
2. 用移液器吸取2 μl 的6X载样缓冲液于封口膜上， 再加入5 μl样品，混匀后，小心加入点样孔。
3. 接通电源，调节电压至4-5V/cm，DNA从负极移 到正极。电泳时间30－60分钟。
• 与PAGE相比，分子筛作用小， 区带少。
DNA的迁移速率决定因素
1. DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的
常用对数近似成反比。 2. 琼脂糖浓度
浓度越低，相同核酸分子迁移越快。
3. DNA的构象 一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞松弛环状
4. 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减
22DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1 2 3 4 时间（min） 5
PCR的基本原理
引物2
DNA引物
PCR反应条件50℃
PCR过程 PCR的特点
引物1
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
琼脂糖凝胶电泳
Agarose gel electrophoresis
实验原理--琼脂糖凝胶电泳技术
琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元 是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键 及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成 大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此该凝胶适合于 免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。
凝胶的制备及电泳
制胶
1. 准备好凝胶成型器，插入成型梳。 2. 将3 g琼脂糖加至100 ml 1×TAE缓冲液中，摇匀。
在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化，冷却至60℃ 以下。 3. 加入10 μl GelRed（1: 10000比例）至熔化的琼 脂糖液中混匀，但避免出现气泡。 4. 将冷却的琼脂糖倒入凝胶成型器，制备凝胶。
PCR的反应体系
Taq DNA聚合酶 2.5 U
4种dNTP混合物 各200 μmol/L
引物
各10～100 pmol
模板DNA
0.1～2 μg
Mg2+
1.5 mmol/L
PCR反应条件
➢ 模板浓度一般为100 ng/100 L，浓度过高 会导致反应的非特异性增加 ➢ 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑 制剂、DNA结合蛋白。
与引物复性
DNA双螺旋
时间（min）
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
PCR的基本原理
PCR反应条件95℃
PCR过程 PCR的特点
1 模2 板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
温 94 72 度
（℃）
55
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
PCR的基本原理Βιβλιοθήκη PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的特点
➢ 灵敏度高 ➢ 简便、快速 ➢ 对标本的纯度要求低，血液、体腔液、洗嗽 液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA
引物设计
➢ 引物长度以15-40 bp为宜 ➢ 碱基尽可能随机分布，G+C占50-60% ➢ 引物内部避免形成二级结构 ➢ 两引物间避免有互补序列
保温：
10℃ Hold
注意：PCR试管做好记号
多聚酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）类似于DNA 的天然复制过程：经过 变性、退火、延伸多次循环, DNA 扩增倍 数可达2 n 倍。
PCR 是 一 项 DNA 体 外 合 成 放 大 技 术 ， 能 快 速特异地在体外扩增任何目的DNA。
少、刚性和长度增加 5. 所用的电压
低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比
Agarose gel electrophoresis
不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围
浓度 （%）
标准 (kb) 高强度(kb) 低熔点(kb)
0.3
1-50
0.5 0.7--25
0.8 0.5-15 0.8-10
0.8-10
每个样品
EP管1
EP管2
结论
引物
AL1+AL3 AL2+AL3
条带 条带 条带
出现78 bp 不出现73 bp
野生型 纯合子基因
不出现78 bp 出现73 bp
突变型 纯合子基因
出现78 bp
出现73 bp
野生型和突变型 杂合子基因
综合实验
（一） 基因组抽提
（二） PCR-APLP
（三）
PCR产物电泳鉴 定及结果分析
PCR技术简史
➢ 1985年，美国PE-Cetus公司 的Mullis等人发明PCR ➢ 基本原理是在试管中模拟细 胞内的DNA复制 ➢ 1993年，Mullis等因此项技 术获诺贝尔化学奖
Mullis的构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
Taq DNA聚合酶
100 酶 80 活 性 60
EB被认为是一种强致癌物质 sybr-green---- 不稳定，易降解
GelRed & GelGreen 的凝胶染色
它们是一种新型极 敏感染料的商品名称。 其 与 DNA 结 合 的 亲 和 力高，并且结合后，能 够极大增强荧光信号。
凝胶中DNA的成像
可以用透射或入射紫外光对GelRed染色 的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观 察。
胶的阳极一侧将发生酸性化；
2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快
10%； 4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或
TPE ， 对 于 低 分 子 质 量 的 DNA ， TAE 要 差 些 。 超 螺 旋 DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。
4. 电泳结束，关掉电源。
结果分析
1. 将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统 的平台中间;
2. 开通紫外光，可见到发出荧光的DNA条带， 在电脑中观察图像；
3. 关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像； 4. 根据图像判定结果。
每个样品
EP管1
EP管2
结论
引物
AL1+AL3 AL2+AL3