双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用

双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的

应用

摘要

双分子荧光互补技术是近年发展起来的用于体或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术。该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段，这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用，彼此靠近，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，从而产生荧光。BiFC方法简单直观，具有可视性的特点，对温度敏感，荧光片段种类较多，被广泛地应用到不同的细胞中，既可以检测蛋白之间的相互作用，也可以定位蛋白质相互作用的位点。此外，BiFC还能在蛋白构型的确定以及RNA的检测方面发挥作用。经过若干年的发展，双色荧光互补技术已经发展成包括多色荧光互补技术，BiFC和FRET 联用技术以及BiFC和YTH联用技术在的多种技术，拓宽了BiFC的应用。

关键词：双分子荧光互补技术；蛋白质片段互补；荧光蛋白；蛋白质相互作用

蛋白质之间的相互作用(Protein-protein interactions，PPIs)形成了细胞中的调节网络，用来调控细胞的许多功能。因此，研究蛋白之间的相互作用对于深入了解许多生命过程具有非常重要的意义。迄今为止，已经建立了多种技术和方法用于研究蛋白与蛋白之间的相互作用，如酵母双杂交技术(Yeast two-hybrid, YTH)，荧光共振能量迁移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)和蛋白片段互补技术(Protein fragment complementations, PFCs)等方法(表1)。在蛋白片段互补技术中，双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)由于观察直观，检测方便以及能实现在活细胞中对相互作用蛋白可视化等诸多优点，自从其被开发出来后，便得到了广泛地应用。

1 双分子荧光互补技术的提出及理论依据

BiFC技术本质上是一种蛋白质片段互补技术，是指将荧光蛋白多肽链在某些不保守的氨基酸处切开，形成不发荧光的N-和C-末端2个多肽片段。将这2个荧光蛋白片段分别连接到1对能发生相互作用的目标蛋白上，在细胞共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，从而产生荧光[1](图1)。目前用于BiFC技术的荧光蛋白包

括GFP(Green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)[2]，YFP(Yellow fluorescent protein，黄色荧光蛋白)[3]，CFP(Cyan fluorescent protein，青色荧光蛋白)[1]，BFP(Blue fluorescent protein，蓝色荧光蛋白)[4]和RFP(Red fluorescent protein，红色荧光蛋白)[5]等。

最先将荧光蛋白用于蛋白互补实验的是Ghosh等人[2]。2002年Hu等人在此基础上首次提出了BiFC这个概念。他们将1个GFP的突变子增强型黄色荧光蛋白(EYFP)从不同位点切开，用1组相互作用的同向平行的亮氨酸拉链(多肽bFos和bJun)融合到切开的YFP蛋白的N片段和C片段，分别在大肠杆菌中共表达不同组合的融合多肽。他们发现，当EYFP从氨基酸Ala154-Asp155间切时所构建的1组融合多肽，能够在细菌细胞中产生YFP的荧光。他们将这个技术称之为BiFC，并对BiFC的相关性质以及影响因素进行了详细的讨论。这篇文章的发表标志着BiFC作为一种可视化观察蛋白质相互作用的技术被正式建立起来[3]。自此，不同的荧光蛋白突变体被运用到BiFC系统中用来提高荧光强度、增加荧光颜色或减少背景荧光等(表2)。

从BiFC的原理可以看出，构成BiFC技术的三论依据分别是蛋白质剪接(Protein splicing)机制的发现，蛋白质片段互补技术(Protein fragment complementation)的提出以及绿色荧光蛋白结构与功能的解析。

2 双分子荧光互补技术(BiFC)的特点

2.1 可视化

可视化是BiFC技术最大的特点。在此技术中，荧光蛋白由于相互靠近而重新构成能发出荧光的蛋白，这种荧光是自我催化的结果，不需要底物与辅助因子，非常稳定，而且通过荧光显微镜和流式细胞仪等常规仪器很容易检测到BiFC信号，这种直观性使得BiFC 技术在短短几年迅速获得应用，已经成为检测活体细胞中蛋白质相互作用的一种常规方法。这种可视性既可以直观地观察到蛋白的相互作用，而且还能通过对这种可视化的荧光进行定量从而确定蛋白相互作用的强弱，极方便了蛋白相互作用之间的研究。2002年Hu 等[3]首次在动物活细胞中运用GFP及其突变体研究蛋白与蛋白间的相互作用。他们鉴定了7个BiFC复合体(BN173/CC155，CN155/CC155，CN173/CC155，GN173/CC155，YN154/YC155，YN173/YC155和YN173/YC173)，观察显示蓝色、蓝绿色、绿色和黄色荧光。Lee[7]等将Venus和Cerulean荧光蛋白片段在活细胞中混合可在不同位置观察到不同颜色的荧光出现。

2.2 可以应用到不同的宿主细胞中

荧光蛋白结构稳定，能在非厌氧条件下的几乎所有细胞中表达，这种稳定性极拓宽了荧光蛋白的应用围。迄今为止，各种BiFC系统已经被成功用于不同宿主细胞中，包括动物[12]，植物[5]，真菌[10,13]和细菌[3]中；除了体，BiFC技术还能应用于体外试验中[2-3]。

Hoff[10]利用BiFC技术分析来自丝状真菌(Acremonium chrysogenum)活细胞中复制因子AcFKH1和CPCR1之间的蛋白与蛋白相互作用。Hu等人最初进行BiFC实验选择的便是大肠杆菌[3]。Yang等[12]通过改变哺乳动物的表达密码子可以有效改善GFP在真核生物中的表达亮度。目前报道在活细胞运用BiFC研究G蛋白(异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白)信号传导过程中核心部件蛋白间相互作用[13]。

2.3 荧光蛋白片段种类多

在众多的蛋白片段互补技术中，双分子荧光互补技术中可选择的互补蛋白片段更多，主要体现在如下3方面。首先，荧光蛋白自身种类多，绿色荧光蛋白通过突变，可以形成激发波长不一样的荧光蛋白，如YFP，BFP，CFP和RFP等；其次，同一种荧光蛋白可以在不同位置剪切成能进行功能互补的荧光片段；第三，不同的荧光片段之间可以进行功能互补。互补的荧光片段种类多，使得通过荧光互补技术在同一细胞中观察多个蛋白的相互作用成为可能[1]。

BiFC系统中运用较多的为YFP。其突变体Citrine和Venus能改善YFP突变体的附加氨基酸交换，可增强荧光蛋白的明亮度和折叠程度。BiFC的特殊地方体现在如果蛋白高度集中表达甚至它们没有特定的亲和力，也可能观察到非特异性相互作用[15]。

2.4 BiFC系统对温度敏感

BiFC技术的最大缺陷是多个BiFC系统对温度敏感。温度高时，片段间不易互补形成完整的荧光蛋白。一般在30℃以下形成互补效应好，温度越低，越有利于片段之间的互补，这就对研究细胞在生理条件下的蛋白质相互作用带来不利因素。目前，只有基于Venus、Citrine和Cerulean的3个双分子荧光互补系统可以在生理温度条件下实现片段互补[8]。此外，BiFC系统需要2个荧光蛋白片段互补，重新形成完整的活性蛋白以及发生荧光蛋白自体催化过程，不同的BiFC系统往往需要几分钟到几小时完成该过程，因此观察到的双分子荧光信号滞后于蛋白质的相互作用过程，不能实时地观察蛋白的相互作用或蛋白复合物的形成过程。Zhang等[16]利用远红荧光蛋白(mKate)的BiFC系统对肿瘤和神经疾病相关的蛋白质进行了研究。这种远红外蛋白可在37℃的生理温度下发生相互作用。

2.5 BiFC复合物的形成过程可逆

最初的研究表明，荧光蛋白分子通过蛋白互补，形成的BiFC复合物不可逆[1,3-4]，然而，Sung等人的实验却表明，BiFC复合物的形成是可逆的。在研究Pho2和Pho4相互作用时，Sung等分别将Pho2和Pho4与黄色荧光蛋白突变体Venus的两个荧光片段成2个融合蛋白，当含有这2个融合蛋白的酿酒酵母二倍体细胞从不含磷酸盐的培养集中转移到含高浓度磷酸盐的培养基中时，BiFC荧光消失，然而当该细胞重新恢复磷酸盐饥饿时，BiFC信号重新出现[13]。这种特点使得通过BiFC技术来研究蛋白相互作用的动态变化成为可能。

2.6 通过定点突变可有效减少假阳性结果的出现

在实验中，一些阴性对照的信号在检测蛋白与蛋白相互作用中较高，这将造成假阳性结果。可能的原因是最初分开的2个无荧光的片段具有在的亲和力，导致无特定相互作用的自发组装。由于这个局限，BiFC的高灵敏度、时空分辨率和准确性受到质疑。研究表明通过定点缺失和定点突变改变蛋白相互作用可有效减少假阳性结果的出现。目前报道的利用分割超折叠的GFP(sfGFP)来构建BiFC[6]。将sfGFP从214和215氨基酸之间分开(sfGFPN:1-214氨基酸;sfGFPC:215-229氨基酸)，将sfGFPN和sfGFPC分别与目标蛋白融合。由于sfGFPC的N端存在两个调控氨基酸残基R215和D216，将其通过缺失突变

后，发现可有效减少阴性信号的调节。Lin等[17]利用在Venus中对BiFC片段进行1个点突变(V150L)能有效减少BiFC的背景荧光。

3 双分子荧光互补技术的应用

3.1 亚细胞定位

BiFC尤为适合蛋白复合物的亚细胞定位。利用BiFC能够获取活细胞中蛋白质相互作用复合物的亚细胞定位信息，从而为我们推断蛋白质的生物学功能提供必要的基础信息。Hu等人在活细胞中用BIFC分析了包含bzip结构域的Jun和Fos的互作及其定位情况，以及bzip和Rel家族的互作和信号系统对它们的作用和定位调节。结果发现bzip外区决定了蛋白作用位置，跨家族的相互作用影响了它们的定位和转录活性调节[18]。CD99是一种表面糖蛋白、白细胞抗原，并且不属于已知的任何蛋白家族Gowoon Choi等人利用BiFC证明了CD99能形成同源二聚体，并且还将互作定位在细胞核的周围区域。

3.2 转录因子间的互作研究

BiFC已经用于许多结构类别的转录因子之间的互作研究.这些研究使我们对核蛋白互作及其亚核定位的理解更为精细，还可能为我们理解核功能的区室化提供重要线索.转录因子Mstl属于基本螺旋一环一螺旋家族(bHLH)的成员，在胰腺腺泡细胞中表达，对胰腺外分泌功能有重要的作用.Zhu L.Q等发现Mstl~YN、Mstl一YC能形成荧光，而bHLH的螺旋的突变体Msti1MH-YC和Mstl~YN之间没有荧光。结果表明抑制转录因子Mstl同源二聚体的形成将导致胰腺腺泡向腺管的化生[19]。脯氨酸脱氢酶(ProDH)是催化脯氨酸降解的第一步，是碱性亮氨酸拉链S族(bZipS)转录因子AtbZIP53的靶基因.Fridtjof Weltmeier 等人应用BiFC证明AtbZIP53不与本族的成员互作，而是与bZip C族的AtbZIP10强烈互作，从而调节ProDH的转录。这种异源二聚化介导的转录激活是调节转录因子活动与功能的重要机制。

3.3 酶-底物复合物的确定

BiFC已经用于几种酶-底物互作的确定，其中包括泛素连接酶、激酶、鸟嘌呤核苷酸交换因子。在活体确定酶的特殊性底物及其活性位点可为酶新功能的发现提供重要证据。例如，Cengiz Ozalp等应用BiFC系统研究了细胞色素P450单加氧酶系统，在活细胞天然膜状态下验证了细胞色素P450与细胞色素P450还原酶的互作，并且提出了P450还原酶与P450反应中可能存在新的作用方式[20]。Blonde等利用BiFC研究了酿酒酵母中泛素E3连接酶Grr1和细胞分裂M期调节因子Hof1的互作，而Hof1由Grr1的酶促降解是酵母胞质分裂过程中激动蛋白收缩的重要步骤。

3.4 信号转导级联

通过BiFC分析，实现了信号转导网络中许多信号蛋白互作的可视化.膜连蛋白A4是一种钙结合蛋白，Alen Piljic等通过BiFC验证了与它连接的磷酸激酶催化亚基与调节亚基

的互作，体钙离子水平的升高会刺激膜连蛋白A4携带磷酸激酶的催化亚基与调节亚基从胞质、核质向胞膜、核膜转移[20]。SMAD家族转录因子介导转化生长因子β的信号发生，通过BiFC分析，Remy等阐明SMAD3-SMAD4复合物定位于胞核而SMAD与AKT/PKB(蛋白激酶B)则阻止它向核的转移。

3.5 蛋白复合物定位调节

BiFC还适用于蛋白互作复合物的动态研究。例如HuC.D等用BiFC证明转录因子JUN和ATF2形成的异源二聚体分布在细胞质，一旦受到由胁迫激活的蛋白激酶的刺激后，将转移到胞核[18]。Niu T.K用BiFC分析发现鸟嘌呤核苷酸交换因子GBF1和鸟苷酸鸟苷三磷酸酶（GTPase）ARF1（ADP核糖基化因子）形成的复合物受到布雷菲德菌素胁迫将会在细胞高尔基体富集[19]。

3.6 涉及转录后修饰的互作

许多蛋白互作需要特殊的转录后修饰，这类互作也可以通过BiFC在活体分析Kanno 等发现溴域蛋白BRD2有选择性的和乙酰化的组蛋白结合，这种结合不仅要求BRD2的溴域还要求组蛋白有乙酰化的尾部。Nyfeler发现耐药相关基因ERGIC53受体与组织蛋白酶Z和组织蛋白酶C的互作要求ERGIC53的凝集素结合结构域，这表明它们之间的互作要求配基糖基化。因此BiFC能够监视转录后发生的改变蛋白互作的修饰作用。

3.7 监视新的互作蛋白

互补分析以及特殊的酵母双杂交转录激活分析已经用来确定很多蛋白的新互作蛋白Remy等使用BiFC文库监视方法确定了AKT/PKB的新的互作蛋白Ft1蛋白。以BiFC为基础的文库监视方式其优势是能在活体监视蛋白互作，并且能直接观察到刺激对互作的影响。缺点是在实验条件下蛋白表达水平的差异可能影响目的蛋白互作蛋白的确定。但是在特殊的细胞条件下，BiFC仍然能确定目的蛋白的互作蛋白。

3.8 大分子复合物和分子骨架

把荧光蛋白带到一起恢复荧光活性并一定由互作蛋白直接接触发生，融合蛋白通过被大分子复合物组装带到一起也能在互作蛋白不接触的情况下产生互补荧光。类似地，融合蛋白和同一个大分子骨架结合，即使互作蛋白不直接接触也能产生荧光。比如Rackham 等利用BiFC分析了与mRNA结合的人类zipcode结合蛋白(IMP1)和智力发育延迟蛋白(FMPR)互作的可视化[21]。Stains等通过BiFC在活体实现了定位在寡聚核苷酸上的锌指DNA结合蛋白同源互作的可视化。

3.9 multicolour BiFC

研究发现由不同荧光蛋白的片段组成的双分子荧光复合物和由同一种荧光蛋白片段组成复合物有不同的光谱。这些复合物之间的不同光谱实现了同一细胞中多种蛋白复合物之

间的可视化，这就是multicolour BiFC的原理。因此双分子荧光还能进行有共同互作蛋白的竞争性蛋白互作的研究。例如Hu等已用multicolour BiFC来确定bZIP结构域中Fos、Jun和ATF2转录因子形成二聚体的效率，并证明了Fos与Jun异源二聚体的形成效率远高于Fos与ATF2以及Jun与ATF2异源二聚体的形成效率。Grinberg等用多色BiFC比较了Max与bMyc结构域的互作效率和Max与Mad家族转录因子互作效率的差异。多种复合物分布的直接比较不仅消除了寻找跟复合物亚细胞定位相同的标记物，还能帮助确定复合物的不同定位是定位信号所致还是复合物在细胞的不同功能所致。

3.10 检测泛素化途径

泛素(ubiquitin，Ub)是含76个氨基酸残基的多肽，分子质量约8.5ku，高度保守，广泛存在于各种真核细胞中。它的主要作用是以多聚泛素链的形式与要降解的底物蛋白结合，从而标记底物蛋白。Muller等还发现一种类泛素蛋白SUMO，它也标记底物，但不促进其降解。

一个或多个泛素分子在一系列酶的作用下与其他蛋白质分子共价结合就称为泛素化。泛素化可直接影响蛋白质的活性及其细胞定位。细胞许多蛋白质均可被泛素化系统识别和修饰，包括细胞表面受体、信号传导蛋白、转录因子等。泛素化过程是一个由多种酶参与的级联反。首先，在ATP的参与下，泛素激活酶(E1)作用于泛素羧基端的谷氨酸残基，并将其激活。接着，活化了的泛素蛋白利用高能巯基键与泛素结合酶(E2)的半胱氨酸残基结合。最后，E2直接或者通过泛素连接酶(E3)将泛素与靶蛋白连接，从而完成泛素化的过程。泛素化的靶蛋白可被细胞中的26 S蛋白酶体识别，从而将其降解。目前越来越多的研究发现，泛素化系统的改变和细胞的转化与肿瘤的发生、神经退行性疾病、免疫和炎症反应等有密切关系。

BiFC技术为泛素化途径检测提供了一种简便方法。Fang等[21]用YN标记泛素分子，YC标记泛素作用底物Jun，pFLAG-CMV2(γ)-YN-Ub和pFLAG-CMV2(γ)-YC-Jun共染细胞 COS-1，37℃培养24h，再30℃培养4～16h后进行荧光检测。若出现荧光，则表明泛素结合到了底物蛋白上，即底物蛋白被泛素化。经对表达YN-Ub(带Flag标记)的细胞提取物和表达HA-Ub的细胞提取物作蛋白质印迹分析，发现电泳后的蛋白质条带亮度和弥散情况基本相同，仅有由于YN分子质量较HA大而引起的条带稍微滞后，该结果说明，在泛素分子上融合表达一段荧光蛋白不会影响泛素与其底物的结合。

3.11 用于检测RNA

BiFC 对细胞的RNA可进行特异性标记。Valencia Burton 等[22]用基于GFP的BiFC 系统成功在大肠杆菌中标记了mRNA和5S核糖体RNA。他们将真核生物的翻译起始因子(eIF4A)切成2个结构域，分别与GFP的2个片段融合形成融合蛋白。RNA的末端连有eIF4A蛋白的RNA适配子。将其导入细菌后，融合蛋白之间发生相互作用，蛋白表达可特异性的反应到RNA适配器上。GFP重新组成发出荧光，可以照亮连接在eIF4A蛋白的RNA。Ozawa等[23]同样用基于GFP的BiFC系统研究了真核细胞线粒体RNA。借助双分子荧光互补技术来标记RNA为研究RNA提供了新的工具，也拓宽了BiFC技术的应用

围。

4 影响BiFC实验的因素分析

在BiFC实验中影响因素有很多，除了宿主细胞和荧光蛋白的种类外，还有形成融合蛋白时插入到荧光蛋白片段上的小肽和荧光蛋白的位置。

4.1 Linker的序列

通常在荧光蛋白质片段与目标蛋白质之间加1个连接肽，防止由于蛋白质空间位阻导致蛋白片段间不能相互靠近现象出现。常用的连接肽氨基酸序列有RSIAT、RPACK-IPNDLKQKVMNH[1,3]和GGGGS[11]等。linker为单链结构，因此存在空间位置上的旋转灵活性，这使荧光蛋白片段更容易相互靠近发生相互作用，重新产生荧光。

4. 2 荧光蛋白片段的位置

在BiFC试验中，荧光蛋白片段的位置对结果的影响是显著的。Sung等人在研究Cet1的寡聚化作用时，发现将Venus的VN或VC分别连接在Cet1的C末端时，在细胞核中检测不到荧光；将VN或VC分别连接在Cet1的N末端时，在细胞核中检测到了强烈的荧光，而将VN连接到Cet1的N末端，而将VC连接到Cet1的C末端，这样形成的BiFC复合物信号较弱，产生的荧光强度也较弱，造成这种差异的原因可能和表达的蛋白之间的拓扑约束有关。荧光片段位置的差异会导致BiFC实验的差异[13]。这个现象被Chandlter等人在植物中得到了证明。为了证明BIM1和DRN蛋白之间的相互作用，Chandlter等人构建了4个载体，即分别将BIM1和DRN融合到YFP的N末端和C末端，如此构建的载体分别是：BIM1-YFP，DRN-YFP，YFP-BIM1和YFP-DRN。结果发现，只有将BIM1-YFP和YFP-DRN配对，才能产生BiFC复合物。这个实验再次表明，荧光蛋白片段位置的不同，对双分子荧光互补实验的成败起着十分重要的作用[24]。

5 BiFC系统的扩展

5.1 多色荧光互补技术

2003年，Hu等人在BiFC的基础上建立起了多色荧光蛋白互补技术(Multicolor fluorescence complementation analysis)。和BiFC一次只能检测一组相互作用蛋白不同的是，这种技术能同时检测一个细胞中多组蛋白的相互作用。他们将GFP、CFP、YFP 和BFP分别在特定位置切开后与目标蛋白连在一起形成融合蛋白，然后将这些融合蛋白混合。不同的目标蛋白间会发生相互作用，同时使不同的互补荧光蛋白片段结合，形成多个蛋白复合体。通过荧光显微镜可观察到不同颜色的荧光[1]。这为研究蛋白功能奠定了一定的基础。多个BiFC系统运用到植物中。Lee 等[7]在植物细胞中将目标蛋白分别标记上CFP 的C-端片段(cCFP)，Venus和Cerulean的N-端片段(nVenus或nCerulean)，cCFP 融合蛋白和nVenus融合蛋白发生相互作用呈现黄色荧光；而cCFP融合蛋白和nCerulean融合蛋白相互作用则呈现蓝色荧光。根据发光颜色的不用来观察不同蛋白间的