第七章双水相解析
F——法拉第常数 T——温度
进一步可证明： ZiF(U2-U1) RT
InKi*= InKi+
Ki*——i组分带电时在体系中的分配系数 Ki——i组分不带电时在体系中的分配系数 Zi——i组分的离子价
意义：
A 荷电溶质的分配系数的对数与 溶质的净电荷数成正比. B 由于同一双水相系统中添加不 同的盐产生的不同,故k与Zi的 关系因盐而异。
盐离子在两相中有不同的分配，因而在两相间形成电位差，由 于各相要保持电中性，因此对于带电荷的蛋白质等物质的萃取 来说 ,盐的存在就会使系统的电荷状态改变 ,从而对分配产生显 著影响。 （P137） 盐的种类对双水相萃取也有一定的影响 ,因此变换盐的种类和 添加其他种类的盐有助于提高选择性。 在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在 PEG/磷酸盐 /水 中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由 4提高到 1 2 0 ,而 在 PEG/DeX/水体系中只从 1 . 55提高到 5。
同种类的盐时，由于相间电 位不同， lnk–pH 关系曲线也 不一样。但在 pI 处， k 应相 同，即两条关系曲线交于一 点。所以 , 通过测定不同盐 类存在下 lnk–pH曲线的交点 , 可测定蛋白质 / 细胞器以及 微粒的pI。
血清蛋白
(4)体系温度的影响
一般地，临界点附近，温度对分配率的影响较大，远离临界 点时，影响较小。 大规模操作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于： (1) 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质 不会发生变性; (2) 常温下溶液粘度较低,容易相分离; (3) 常温操作节省冷却费用。
(5)体系中微生物的影响。
1）表面自由能的影响
λ=γp2－ γp1
2）表面电荷的影响
道南电位(, Donnan potential):实际双水相系统中有电解质, 当这些离子在两相中K 1, 则两相间产生电位差
U2，U1——相1和相2的电位 Z+, Z－ ——分别表示一种盐的正负离子的离子价
保持生物活性和强化相际间的质量传递 ② 分相时间短(特别是聚合物/ 盐系统) ,自然分相时间一般 只有5～15min。 ③ 双水相萃取技术易于连续化操作。 ④ 目标产物的分配系数一般大于3 ,大多数情况下,目标产物
有较高的收率。( P141 )
⑤ 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液 分离方法相比,双水相萃取技术可省去1～2 个分离步骤,使 整个分离过程更经济。 ⑥ 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。
(3)体系pH的影响
pH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因而改变蛋白 质所带电荷和分配系数。
pH也影响磷酸盐的离解程度，若改变H2PO4-和HPO42-之间 的比例，也会使相间电位发生变化而影响分配系数。pH的 微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变2—3个数量级。
交 错 分 配 法 (cross partitioning): 当 加 入 不
双节线
系线 两相区 均 相 区
别消失,任何溶质在两相中
的分配系数均为1。如C点。
聚合物的分子量越高，相分离 所需的浓度越低 两种聚合物的分子量相差越 大，双节线的形状越不对称。
3、物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。 CT K= —— CB Ct、CB——分别代表上相、下相中溶质的浓度 1）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大) 2）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大) 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验） 4）影响分配平衡的参数 (1)聚合物的影响； (3)体系pH的影响； (2)体系中无机盐离子的影响； (4)体系温度的影响；
聚合物的不相溶性：
主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗
透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的 水相，所以具有强烈的相分离倾向。
某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓
度达到一定值，也会形成两相，即聚合物—盐双水相体系
双水相萃取技术的优点
① 系统含水量多达75 %～90 % ,两相界面张力极低,有助于
3）综合考虑
4）影响分配平衡的参数
(1)聚合物的影响
A
聚和物的分子量的影响
当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的 相。例如在PEG—DeX系统中，PEG的分子量减小，会使分 配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。 这是一条普遍的规律，不论何种成相聚合物系统都适用。 (P135)
一、 双水相分离理论
1、双水相的形成
熵增——混合——自发 分子间作用力------随着Mr的增加,而增大. 聚合物的不相容性------含有聚合物分子的溶液发 生分相的现则
2、相图
临界点(critical point)：当 系线长度趋于零时, 两相差
第七章 双水相萃取技术
有机溶剂萃取的不足：
许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂 ； 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件 下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。于是有 可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移 到另一水相中，从而完成分离任务。
B
成相聚和物浓度的影响
当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数接近 于 1。 如成相聚合物的总浓度或聚合物／盐混合物的总浓度增加时， 系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别 也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过 1，或减小低于1。
(2)体系中无机盐离子的影响
(5)体系中微生物的影响
结合P139图7-10和P140图7-11
二、 双水相萃取技术的应用
1. 双水相萃取法常用于胞内酶提取和精制
目前已知的胞内酶约2600种，但投入生产的很少。 原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步是将细胞 破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞 碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离 的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以 及酶的进一步精制。
下游答案——精选推荐
下游答案1.平衡分离过程：建⽴在相平衡关系上的，利⽤相的组成差别进⾏混合物体系的分离。
2.拟平衡分离过程：混合物体系之外加⼀个势能场，在它的作⽤下，形成分离场。
使被分离物在分离场的端⾯上浓缩，或者在分离场内形成⼀个稳定的浓度分布。
3.传递通量：流体在分离场内的传递现象可⽤经典流体⼒学中动量（通量）传递、热量（通量）传递和质量（通量）传递规律和作⽤于分离场的外加势能场来描述。
4.特异性结合：主要以蛋⽩质为代表的⽣物⾼分⼦，能分辩特定的物质，再与其可逆性结合。
这种现象是⾮常排他性的，特异性的结合，或称为特异性相互作⽤。
有时也被称为⽣物亲和⼒。
第六章1.临界点：状态超过⽓液共存时的最⾼压⼒和最⾼温度下物质特有的点。
2.拖带剂：添加拖带剂即辅助溶剂以增加物质的溶解度和萃取选择性，是实际运⾏中常⽤的⽅法之⼀。
第九章1.不对称膜：是由很薄的较致密的起分离作⽤的表层(0.1～lµm)和起机械⽀撑作⽤的多孔⽀撑层(100～200µm)构成。
2.复合膜：⼀般是指在多孔的⽀撑膜上复合⼀层很薄的致密的、有特种功能的另⼀种材料的膜层。
3.浓差极化：膜分离过程中的⼀种现象，会降低透⽔率，是⼀个可逆过程。
是指在膜分离过程中，由于⽔透过膜⽽使膜表⾯的溶质浓度增加，在浓度梯度作⽤下，溶质与⽔以相反⽅向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表⾯形成⼀溶质浓度分布边界层，它对⽔的透过起着阻碍作⽤。
4.膜污染：指由于在膜表⾯上形成了附着层或膜孔堵塞等外部因素导致了膜性能变化，根据其具体原因采⽤某种清洗⽅法，可以使膜性能得以恢复。
5. 截留分⼦量：截留分⼦量的定义和测定条件不很严格，⼀般⽤分⼦量差异不⼤的溶质在不易形成浓差极化的操作条件下测定脱除率，将表观脱除率为90％～95％的溶质分⼦量定义为截留分⼦量。
第⼗⼆章1.分配⾊谱：是利⽤混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同⽽得以分离，其过程相当于连续性的溶剂抽提。
7双水相
二、体系中无机盐离子的影响
无机盐离子在两相中也有不同的分配，因此在两相间形 成电位差。由于各相要保持电中性，使得带电生物大分子， 如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。
水相pH6.9时, （碱性） 溶菌酶带正电荷 （酸性） 卵蛋白带负电荷
双水相在细胞碎片分离中的应用：
细胞碎片的分布行为图
双水相组分表：
从图中可以看出，随着液相中无机盐浓度的 增加，细胞逐渐由下层向上层分配；先进入双 水相，最后完全进入上相。
从清除细胞碎片的角度考虑，在刚形成双水 相时细胞碎片的沉淀最完全，上清液最清，也 最有利于离心分离。
思考题： 1、双水相是怎样形成的？ 2、图7-2中，T、B各表示什么，BM、TM表示什么？ 3、结合图7-10、7-11，说明为什么细胞浓度对分配系
顺便提一下： 菌体细胞一般带负电荷，
指的是：中性水。但在 pH < 4.0以下，则带正电荷。
关键是要了解它的pI。
3、体系pH的影响
pH会影响蛋白质中可离 解基团的离解度，因而改变 蛋白质所带电荷和分配系数； 另外，pH还影响系统缓冲物 质磷酸盐的离解程度，影响 相间电位差，从而影响分配 系数。
根据这一原则测定蛋白质 等电点pI的方法，称为交错 分配法
当正负电荷完全中和时，即形成沉淀。 （5区）
（二）、双水相体系的相体积比：
对萃取分离体系而言，相体积比是影响萃取分 离效率的重要因素，正、负离子表面活性剂的配 比及总浓度对双水相体积比有很大影响：
1、正、负离子表面活性剂配比对相体积比的影响：
固定表面活性剂的总浓度为0.18mol/L，从图中 可看出，在能够形成双水相的两个浓度区间，随 着CTAB配比的增加，上相体积呈增加的趋势。这 主要是由于CTAB的极性较大，能够争夺更多的水 分子。
双水相萃取详细资料
三步两水相萃取酶的流程：
细胞匀浆液
第一步双水相萃取
+PEG +盐（或是葡聚糖）
分离机
下相 ） 细胞碎片
杂蛋白 （核酸、多糖）
上 相（PEG相
（目标产物）如prot、E +盐
第二步双水相萃取 静置分层
下 相（盐相） 核酸多糖
上 相（PEG相） 目标产物
杂蛋白
（亲水性较强）
+盐
第三步双水相萃取 静置分层
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
➢ 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
优点：1.与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的 扩散阻力，故反应速度快，生产能力较高；2.生物催化剂在两水 相系统中教稳定；3.两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度 分散的系统，分散相液滴在10μm一下，有很大的表面积，有利于 底物和产物的传递。
PEG系统中细胞碎片分配到下相中较容易 分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐（有时也可 加入适量的PEG），尽兴第二次双水相萃取，以除去多 糖和核酸，它们的亲水相较强因而容易分配在盐相中， 而蛋白质就留在了PEG相中；在第三步萃取中，应该使 蛋白质分配在盐相中（例如：调节pH），以使和主体 PEG分离。色素由于其疏水性，通常分配在上相。主体 PEG可循环使用，而盐相蛋白质则可用超滤方法去除残 余的PEG以提高产品的纯度。
双水相系统
●双水相系统与萃取: 某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后
可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统（aqueous two-phase system,ATPS）。
利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质.20世纪50年代后期开发了双水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又称双水相分配法.
●双水相系统是一个十分出色的方法，用以进行从粗制细胞浓缩物或其他混合
物中萃取蛋白质/酶以及其他易变性生物分子的操作
●双水相体系萃取分离原理是基于生物质在双水相体系中的选择性分配。
当生
物物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数
●本文用的双水相系统是聚乙二醇-右旋糖酐体系
“上相”是由更加疏水性的聚乙二醇（PEG）所形成，此相较“下相”的密度小，下相由更加亲水性且密度大的右旋糖酐溶液组成。
双水相名词解释
双水相名词解释
双水相系统（Aqueous two-phase system）是一种新型的分离技术，通常由两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐（一种是离散盐且另一种是亲液盐）在适当的浓度或是在一个特定的温度下相混合在一起形成。
这两相大多数情况下由水与非挥发性成分组成，因此避免了挥发性有机成分的使用。
这种系统被广泛应用于生物技术领域，如蛋白质、酶和细胞等的分离和纯化，因为它具有非变性且温和的特性。
双水相系统的形成是由于聚合物之间的不相溶性，即聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，从而分为两相。
一般认为，只要两种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可发生相分离，并且水溶性差别越大，相分离的倾向越大。
此外，双水相系统还可以用于金属离子分离、环境修复、冶金应用等。
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双水相体系是怎样形成的其分配机理是什么什么双水相
包括： 双水相的形成 溶质在双水相中的分配 双水相的分离。
新型分离技术
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2.3.3 双水相萃取操作及特点
萃取一般操作
固体聚合物 盐
加入
细胞匀浆
搅拌
成相物质溶解
形成双水相
蛋白质在两相中发生物质传递，达到分配平衡； 采用离心沉降进行相分离。
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均相区 双节线
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B 临界点
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2.3.1 双水相体系的形成与分配
双
T’
水
相
体
系
单相
的
相
图
K 临界点
•N
TKB 双
节线
新型分离技术
双相 节线
M’
B’
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2.3.1 双水相体系的形成与分配
M点, 两相T和B的量之间的关系(体积)服从杠杆规则，即
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两 相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中 的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
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2.3.3 双水相萃取操作及特点
2.3.3.1 双水相系统的选择
选择原则： 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子
质量、等电点和表面电荷等性质上的差别 综合利用静电作用、疏水作用,添加适当种类和浓度
的盐，可选择性萃取目标产物。
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2.3.3 双水相萃取操作及特点
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本节要点及学习要求
双水相的研究
正负离子表面活性剂混合体系双水相性质的研究一、目的要求1.掌握表面活性剂的基本性质，了解其前沿研究动态2.学会运用称量法配制三元相行为中的特定样品，运用恒温法得到双水相3.学会用分光光度法测定双水相两相中被萃取物质的浓度，并学会萃取效率和分配系数的计算方法二、实验原理表面活性剂是一大类有机化合物，它的性质极具特色，应用广泛。
表面活性剂的分子特点是具有不对称。
整个分子可分为两部分，一部分为亲油的非极性集团，叫做亲油基（hydrophobic group）；另一部分是亲水的，叫亲水基(hydrophilic group)。
因此，表面活性分子具有两亲性。
表面活性剂溶于水后，当其浓度很小（小于临界胶束浓度CMC）时，其在溶液中主要以单分子状态或少数几个分子聚集在一起的形式存在。
当其浓度超过临界胶束浓度CMC时，表面活性剂自发聚集成胶束。
表面活性剂在形成胶束前后，一系列的性质会发生突变，如表面张力、电导、渗透压等。
表面活性剂按极性基团的解离性质分类：1、阴离子表面活性剂：硬脂酸，十二烷基苯磺酸钠2、阳离子表面活性剂：季铵化物3、两性离子表面活性剂：卵磷脂，氨基酸型，甜菜碱型4、非离子表面活性剂：脂肪酸甘油酯，脂肪酸山梨坦（司盘），聚山梨酯（吐温）表面活性剂在工农业中已经得到了广泛的应用，实用中的表面活性剂几乎都是混合物。
两种或两种以上的表面活性剂混合物往往显示出更加优良的表面活性。
同系混合物为表面活性剂产品中常见的混合物；与单一的表面活性剂相比，正负离子表面活性剂混合物系统形成胶束的能力大为增强。
在适当的具体条件下，正负离子表面活性剂与负离子表面活性剂是可以混合使用，并且在混合溶液中存在强烈的相互作用。
这种作用的本质是电性相反的表面活性离子静电作用及其疏水性碳链间的相互作用。
与单一表面活性离子键的作用相比，混合表面活性剂离子间的相互作用不但没有相同电荷间的斥力，反而增加了相反电荷间的引力，从而大大促进了两种不同电荷离子间的缔合，在溶液中更易形成胶束，产生更高的表面活性。
第七章 萃取-双水相萃取
主要内容
一、概述 二、物质在两相中的分配 三、双水相萃取工艺流程 四、双水相萃取技术的应用 五、思考题
实用文档
3
一、 异）难于进行收集微生物的细胞器、分离除去细胞碎片、 提取和浓缩胞内物质的操作。
萃取已广泛用于液液分离，但一般的有机溶剂萃取难 于分离蛋白质?
② 对胞内蛋白萃取，使碎片分配于下相中， 来增大两相的密度差，达到快速分离，降 低操作成本和操作时间。
③ 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、 相对分子质量、等电点和表面电荷等性质 的差别，来选择萃取目标产物。如调pH、 添加盐、提高成相系统的浓度（系线长度）
实用文档
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双水相萃取过程放大较容易，一般10mL刻度离 心管内结果即可直接放大到产业化规模。具体的实 验步骤： ①配制一系列不同浓度、pH值及离子强度的双水相， 每个双水相改变一个参数。
②加入料液后，再加水使整个系统的质量达到5-10g。 离心管封口后充分混合。（反复倒置或涡旋混合器）
③在1800-2000g下离心3-5min，分相。
④分别吸出上下相，测定上、下相中目标产物的浓 度或生物活性，计算分配系数。
⑤分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水 相系统。
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2、相平衡与相分离
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3、人生长激素、β-干扰素的提取
用PEG4000 6.6%/磷酸盐14%体系从大肠杆菌 提取。
4、病毒的提取、纯化
5、生物活性物质的分析检测
实用文档
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何谓双水相萃取？ 在一定条件下，水相可形以成两相。将 水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从 一个水相转移到另一水相的过程。
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2、影响分配的因素
(1)双水相中聚合物（组成和浓度）的影响 分子量的影响
7双水相
结论：正、负离子表面活性剂在水溶液中能形成 双水相体系，缺点是双水相区域较狭窄，正、负 离子的配比有较严格的要求。
双水相在细胞碎片分离中的应用：
细胞碎片的分布行为图 双水相组分表： 从图中可以看出，随着液相中无机盐浓度的 增加，细胞逐渐由下层向上层分配；先进入双 水相，最后完全进入上相。 从清除细胞碎片的角度考虑，在刚形成双水 相时细胞碎片的沉淀最完全，上清液最清，也 最有利于离心分离。
一些水溶性有机溶剂和无机盐能够形成双水相， 但是，有些双水相体系和有机溶剂萃取一样，仍然 很容易使生物活性物质失活。
研究表明，正、负离子表面活性剂在特定的浓度区域也
会形成双水相。这种双水相具有三个特点： （1）两相中表面活性剂浓度很稀，为生物活性物质的分离提 供了良好的分离环境。 （2）由于表面活性剂的加入，使体系的表面张力更低，物质 传递速率更快，萃取可在短时间内完成。 （3）表面活性剂来源广，价格便宜。
称为
道南电位
U 2 U1 RT (Z Z )F
_
ln
K BZ K AZ
当KAZ＋ ≠ KBZ-时，U2 - U1 ≠ 0
ln K i* ln K i
Ki* 带电荷
Z i F (U 2 U1 ) RT
U2 U1 2相和1相电位 Z 盐的离子价 KB KA 盐离子分配系数 Ki i 组分分配系数 F 法拉第常数
VT VB
=
BM MT
下标表示： T：上相 B：下相
双节线的位置和形状 与聚合物的分子量有关。
聚合物Dex的分子量 越高，相分离所需的浓度 越低。 两种聚合物分子量相 差越大，双节线的形状越 不对称。
三、物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相 中的分配用分配系数 K 表示。
第七章 双水相萃取技术
双水相萃取
双水相萃取：利用 物质在互不相溶的 两水相之间分配系 数的差异，进行萃 取的方法。
第一节 双水相分离理论
一、双水相的形成
当两种聚合物混合时，究竟是否分层或混合成一相， 取决于两种因素：
体系熵的增加：与分子数量有关，与分子大小无关。
分子间作用力：主要表现为分子中各个基团间的相互 作用力。分子量越大，分子间的作用力也越大。 对于大分子间的混合，分子间作用力决定是否分层。
双水相萃取技术的应用
要成功地运用双水相萃取方法，应满足一些要求：
（1）欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；
（2）酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比 时，经过一次萃取，就能得到较高的收率； （3）两相用离心机很容易分离。
胞内酶连续双水相萃取工艺流程
第三节 双水相萃取技术的发展
lnK = -ΔE/(kT) 式中：ΔE — 溶质从相2转移到相1所需的功
k — 波尔兹曼常数(J/K)
T — 温度(K)
表面自由能的影响
lnK = -ΔE/(kT)
假设溶质分子或粒子为球形，它在两相中的表面 能分别为：4πR2γS1、4πR2γS2 ΔE = 4πR2γS1- 4πR2γS2 = 4πR2(γS1-γS2) 式中：R — 溶质分子或粒子半径 γS1 、γS2 — 溶质与相1间、相2间的表面张力 lnK = -4πR2(γS1-γS2)/(kT)
分配系数与pH的关系
影响分配平衡的参数
— 温度
影响分配平衡的参数
— 微生物
对于同一种双水相 体系，微生物影响 体系上下相的比例 以及胞内蛋白在体 系的分配系数。