转基因植物(精)
转基因植物
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
转基因植物的遗传特性与表达调控
（4）从头甲基化与沉默机制 A 植物对外源DNA的基因免疫诱导反应； B DNA-DNA配对诱导； C DNA-DNA互作诱导。
4. 克服转基因沉默的策略
(1) 转基因的选择： （2）启动子的选择； （3）利用组织和发育特异性作用的增强子 （4）利用MAR序列； （5）利用位置特异性重组系统； （6）选择单拷贝的转化体。
E 交叉相连的DNA链经旋转形成Holliday中间体； F Holliday中间体分枝迁移数个碱基后，另一条链再断裂并与对方的 断裂链重组，这时就完成重组，实现了交换。
（3）位点特异性重组在转基因整合遗传特性研究中的应用
A 控制转基因整合的拷贝数；
B 可导入多个基因进入植物基因组； C 使目标基因重排；
在44个转KM抗性基因的烟草中，通过转基因植株自交、转化与非转化杂 交、转化株杂交进行分析，发现35个无性系包含一个单位点插入KM抗性基 因，其余5个为两位点插入，且观察到双位点插入导致自交后代中出现隐形 致死突变。 多基因转化植株后代分离规律与其整合特性密切相关，多基因连锁形式整 合到一个位点，其符合单基因的孟德尔式分离规律；如分别整合到不同位点， 那么每个基因的分离符合孟德尔式规律，各个基因间不影响。
（2）转录水平的基因沉默 A 转基因及其启动子甲基化； B多拷贝重复基因序列引起的转录水平基因沉默； C 同源基因间的反式失活； D 转基因位置效应引起的转基因沉默； E 染色体包装对转基因沉默的影响； F 后成修饰作用导致转基因沉默。
（3）转录后水平的转基因沉默
A 生化开关模型；
B 异常RNA模型；
当两个loxP基因座方向相同，Cre介导的反应造成loxP基因座之间的 DNA被删除，loxP基因座方向相反，Cre介导使两端携带loxP的片段发 生倒位，如果loxP 不在同一DNA分子，如一个在质粒上，另一个在染 色体上，那么Cre酶可使质粒DNA整合到染色体loxP所在位置，实现定 点重组。
转基因(GM)植物及其安全性(最新)
内容：
★ 转基因生物的性状行为
• 转基因生物的类型、数量、生态习性 • 转基因生物的遗传修饰构成、性状表达、遗传能力及稳 定性 • 转基因生物所含的外源性基因在种群中扩散能力及其向 其他生物漂移和逃逸的能力 • 转基因生物的外源性基因可能诱导演变产生何种变异产 物及其性状 • 若转基因生物中含有沉默基因或不命片段，应考察在环 境胁迫条件下可能出现变异功能及其影响 • 启动子基因与标记基因可能产生的副作用及其后果
植物转基因及其安全性问题
相关概念 转基因的常用方法 植物转基因研究 转基因植物的产业化 生物安全性问题
与生物安全性相关的政策法规
转基因蓝玫瑰
一. 转基因的相关概念
基因是指细胞内编码 特定功能蛋白的DNA 片段
通过基因工程技术，将外源基因(动物、植物、微生物)导 入到被改良的受体中去的过程,叫转基因。
花）种植面积为1550 万hm2 （占12% ）、转基因油菜（HT
油菜）为590 万hm2（占5%）。
从种子市场份额来看，根据国际种子联盟（2008）的报
告，全球商品种子的市值规模大约为365 亿美元，而全球转
基因作物品种销售额为75 亿美元，据此粗略测算，转基因 种子销售额占全球商品种子销售额的20.5% 。自1996 年以 来，转基因作物种子销售额呈快速增长态势 。
2008 年欧盟27 国中有7 个国家种植了很少量的转基因Bt 玉
米。
从转基因作物品种来看，自1996 年转基因作物商业化种植以
来，全球主要转基因作物品种为大豆、玉米、棉花、油菜四种
作物。2008 年全球转基因大豆（HT 大豆）种植面积为6580 万hm2 （占全球转基因作物种植面积的53% ）、其次是转基 因玉米（Bt 玉米、HT 玉米、Bt/Ht 玉米）种植面积为3730 万 hm2（占30% ）、转基因棉花（Bt 棉花、HT 棉花、Bt/HT 棉
转基因植物的遗传特性与表达调控
3、转化后整合位点的DNA结构变化
保持整合外源基因的完整性是实现转基因功能表达的基本条件，外源
基因整合后的完整性与其结构变化有关，现已明确，外源基因作为侵入 者的整合，会引起不同程度的基因重排，涉及缺失、异位、倒位及重复 等一系列现象。这主要与细胞本身的重复和修复功能有关。
Mayerhofer等（1991）和Gheysen等（1991）对15个独立的T-DNA插 入进行了研究，提出了外源DNA整合模型， 他们认为： （1）T-DNA的插入不会引起植物DNA大的重排，但在T-DNA的两侧各出 现了一个158bp的正向重复序列，且多数插入会导致靶位点处小的缺失， 最多79个核苷酸； （2）在T-DNA和植物DNA连接处常有几个至33个核苷酸的填充DNA， 这些填充序列与靠近连接处的植物DNA序列相似； （3）在靶位点处不要求有特异的序列，但若T-DNA两端与植物靶位点之 间有一段短序列（5-10bp）同源，则可能对T-DNA整合进植物基因组其 作用。
（2）整合拷贝数：许多研究表明，外源DNA的插入拷贝数有以下几种：单 拷贝单位点插入；串联多拷贝单位点插入；多拷贝多位点插入，多数情况 是以单拷贝在单位点整合，但在同一位点，也存在较多的多个拷贝串联整 合的情况。形式为头对尾式串联和头对头式串联。农杆菌转化和基因直接 转化整合拷贝数存在差异，前者拷贝数少，整合位点特异性强。
此外，插入植物染色体的外源DNA大小是有限制的，如油菜插入外源 DNA为5-6Kb，烟草中最大可达9Kb，但频率较低。
4、转化方法对整合外源基因结构的影响
尽管转化方法较多，但外源DNA以两种分子形式转化，一种是外源 DNA插入T-DNA质粒载体中导入；另一种是裸露的DNA分子直接导入， 由于转化原理不同，因此与整合后的外源DNA结构必然存在直接关系。 （1）T-DNA转化的外源DNA结构变化
转基因植物的遗传稳定性与影响因素
转基因植物的遗传稳定性与影响因素转基因植物是指对植物进行人为基因改造以达到特定目的的一种方法，它可以为我们的生活带来很多便利，但是也带来不少争议。
其中之一就是关于转基因植物的遗传稳定性和影响因素的讨论。
在下面的文章中，我们将探讨转基因植物的遗传稳定性以及影响因素。
一、遗传稳定性是什么遗传稳定性是指在遗传层面上，植物的基因组结构和其表现的遗传信息没有发生显著变化的程度。
对于转基因植物而言，其遗传稳定性直接影响到它的生长发育和产量。
二、转基因植物的遗传稳定性转基因技术是通过人工管理植物的基因，使其表达某种特定的蛋白质或产生某种物质。
在对植物的基因进行改造后，转基因植物的遗传稳定性会受到不同程度的影响。
1、稳定性受转基因技术影响针对一个植物的基因进行改造是一项非常精细的过程，需要对其进行精确的设计和实验验证。
但是在实际应用过程中，转基因技术往往会受到多种因素的干扰，从而导致转基因植物的遗传稳定性下降。
例如，基因导入时的插入位点、转基因浓度、转化时的细胞状态、基因组修饰等因素都会对转基因植物的遗传稳定性产生影响。
2、稳定性受环境因素影响植物的生长发育受到环境的诸多因素的影响，例如气候、土壤、水分等。
同样，这些因素也会对转基因植物的遗传稳定性产生影响。
尤其是在非自然环境下，转基因植物的遗传稳定性会更容易受到影响。
3、稳定性具有时效性转基因植物的遗传稳定性是具有时效性的。
随着时间的推移，转基因植物的遗传稳定性也会发生变化，例如基因的失活或激活，基因重组等。
因此，贮藏和保存转基因植物也是极为重要的。
三、影响转基因植物遗传稳定性的因素1、转基因技术的精准度如前所述，在转基因技术中，针对植物进行基因改造需要非常高的精准度。
转基因技术的不稳定性往往会导致插入位点未能精准定位，从而影响到植物的遗传稳定性。
因此，转基因技术的精准度是影响转基因植物遗传稳定性的重要因素之一。
2、基因组的复杂性和絮乱性植物基因组由众多的基因组成，它们之间的相互作用和调控关系非常复杂。
【精品】盘点身边的转基因植物和动物
【关键字】精品盘点你身边的几十种转基因作物除了最近闹的沸沸扬扬的转基因大米，还有哪些是转基因的呢？大豆、玉米、木瓜……连三文鱼都有转基因！盘点所有的转基因植物，发现居然有数十种作物都是转基因的！转基因已经无处不在，盘点那些你意想不到的转基因动植物动物1.三文鱼转基因三文鱼：美国培育出一种转基因三文鱼，这种鱼是一种融合两种鱼类基因、生长速度是普通鲑鱼两倍的特殊鱼类，由于体内的生长激素能让其维持长达一年的生长期，但是目前在美国并未上市，而且欧洲非常抗拒这种鱼。
植物1.大豆非转基因大豆：黑龙江地产大豆老练的、经过筛选的黑龙江地产大豆，呈圆形、颗粒饱满、色泽明黄，除黑龙江北部部分地区种植的抗腺品种外豆脐呈浅黄色;我国南方原产大豆有的有黑脐。
转基因大豆：从港口采集到的进口转基因大豆，呈扁圆或椭圆、色泽暗黄，与国产大豆明显区别是豆脐呈黄褐色，俗称“黑脐豆”。
简单的检验方法：转基因大豆不发芽!可以用水检测!本土大豆用水浸泡三天会发芽! 转基因大豆不会发芽，只不过是个体膨胀而已。
从这个发芽试验过程，人们可以发现，这些转基因大豆是一次性产生的果实，它们的胚芽是不具有生命本质活性的，因此，就没有延续后代的能力。
相当于一个人可以正常怀孕，但是每一次都是死胎，这就意味着生命的延续到此为止了。
人类如果大规模的长期食用各种转基因食品，其中危害人类的转基因片断，必然会潜移默化的影响直至改变人类本身的正常基因，抵抗力下降，怪病丛生，或者丧失生育能力都是情理之中的了。
2. 胡萝卜非转基因胡萝卜：表面凸凹不平，一般不太直，从头部到尾部是从粗到细的。
且头部是往外凸出来的。
转基因胡萝卜：表面相对较光滑，一般是直的，它的尾部有时比中间还粗。
且头部是往内凹的。
注：胡萝卜只有在秋冬季节有，夏季的一般是转基因的。
3.土豆非转基因土豆：样子比较难看，一般颜色比较深，表面坑坑洼洼的，同时表皮颜色不规则，削皮之后，其表面很快会颜色变深，皮内为白色。
转基因植物
亲缘物种。 • 许多专家建议对转基因作物的栽种范围作出一定限制，例如不要在有野生的亲缘物种
的地区种植相应的转基因作物。
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各国的转基因情况(qíngkuàng)：
• 1.美国 • 美国是转基因技术采用最多的国家。自20世纪90年代初将基因改
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安全性
• 食品安全性也是转基因植物安全性评价的一个重要方面。如果转基因植物生产的产品与传统 产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。若转基因植物生产的产品与传统产品不存在实 质等同性，则应进行严格的安全性评价。在进行实质等同性评价时，一般需要考虑以下一些 主要方面。
• 有毒物质：必须确保(quèbǎo)转入外源基因或基因产物对人畜无毒。如转Bt杀虫基因玉米 除含有Bt杀虫蛋白外，与传统玉米在营养物质含量等方面具有实质等同性。要评价它作为饲 料或食品的安全性，则应集中研究Bt蛋白对人畜的安全性。
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基因(jīyīn)枪法
• 通过一种被称为基因枪的设备，利用火药爆炸或高压 (gāoyā)气体加速，将包裹了带外源目的基因的高速微弹 直接送入完整植物细胞中。外源目的基因会随机地插入到 植物基因组中，从而实现转基因操作。
• 与农杆菌介导的转化方法相比，基因枪法不受植物是否单 子叶或双子叶类型的限制，且其载体质粒的构建也相对简 单；但基因枪法产生的转基因植物中，外源基因的表达不 如农杆菌介导法稳定，成本也相对较高，而且需要特殊的 仪器。
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俄罗斯
• 2006年年末，世界闻名的反食用转基因产品专家、俄罗斯生物学家伊丽娜・ 叶尔马科娃走马上任，当选为俄罗斯国家基因安全研究会副主席。
转基因动植物
第三节转基因动植物一、转基因动物（一）转基因动物简介转基因动物指把人或哺乳动物的某种基因导入到哺乳动物(如鼠、兔、羊和猪)的受精卵里，目的基因若与受精卵染色体DNA整合，细胞分裂时，该基因随染色体的倍增而倍增，使每个细胞中都带有目的基因，使性状得以表达，并稳定地遗传给后代，从而获得基因产品。
1974年，Jaenish和Mintz应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了SV40 DNA转基因小鼠。
1980年，Gordon等人首先育成带有人胸苷激酶基因的转基因小鼠。
尤其是1982年Palmiter等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，获得比普通小鼠生长速度快2~4倍，体形大一倍的转基因“硕鼠”后，转基因动物技术轰动了整个生命科学界。
随后的十几年里，转基因动物技术飞速发展，转基因兔、转基因猪、转基因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续育成。
转基因动物技术已广泛应用于生物学、医学、药学、畜牧学等研究领域，并取得了许多有价值的研究成果。
（二）转基因动物培育的原理与方法转基因动物培育的基本原理是借助分子生物学和胚胎工程的技术，将外源目的基因在体外扩增和加工，再导入动物的早期胚胎细胞中，使其整合到染色体上，当胚胎被移植到代孕动物的输卵管或子宫中后，发育成携带有外源基因的转基因动物。
培育转基因动物的关键技术包括：外源目的基因的制备，外源目的基因的有效导入，胚胎培养与移植，外源目的基因表达的检测等。
根据目的基因导入的方法与对象不同，培育转基因动物的主要方法有基因显微注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、精子载体导入法等（图1-2）。
图1-2培育转基因动物的三种方法示意图1、基因显微注射法以培育转基因小鼠为例，其培育程序如图1-3。
包括以下基本步骤：图1-3 基因显微注射法培育转基因小鼠示意图（1）目的基因的制备与纯化：目的基因可以来源于：①通过限制性内切酶预先分离的某一基因。
②逆转录法得到的cDNA。
③人工合成的DNA片段。
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3）显微注射法 借助显微注射仪，将外源DNA通过机械方法直接 注射到受体细胞。 4）基因枪法 基因枪法，也称微粒轰击法，是将DNA包被到金 粒或钨粒中然后把这些粒子加速推进靶细胞。优 点是转化受体迅速简单、取材广泛，不受基因型 限制，金属微粒的喷射面广，植株可育性高，转 化频率高等。 5）脂质体介导法 是将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质 体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。
报告基因
• 报告基因是用来筛选和指示转化细胞，组织 和转基因植物的有效标记。 • 根据报告基因编码特点，分为两类，抗性基 因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基 因或发光基因。 • 报告基因由于其表达产物易于检测，已广泛 应用于转基因植物中。
1.（一）抗性基因
一般用抗性基因来富集转化细胞。 抗性基因应满足以下几点：
2.分子生物学检测方法
1.酶联免疫吸附检测
酶联免疫吸附检测是指利用外源基 因表达蛋白的抗体与抗原的特异性，通 过结合在抗体上的酶作用于特定的底物 后发生显色反应，借助比色鉴定转基因 植物。可经免疫反应确定表达蛋白在转 基因植物组织及细胞中的分布。
植物转基因技术
转基因植物技术
• 是指利用基因工程技术，在离体条件下， 对不同生物的DNA进行加工，并按照人 们的意愿和适当的载体重新组合，再将 重载体转入受体中，并使其在体内表达 的植物。 • 转基因植物通常具有高产优质、抗病虫、 环境抗性、抗除草剂、耐储存、提高某 些成分的含量等优良性状。
1.植物转基因技术的基本路线 2.农作物基因工程（抗虫、抗 病毒﹑抗除草剂﹑转基因作物检测
无论使用哪种转基因方法，转化细 胞与非转化细胞相比都只占少数。为获 得真正的转基因植株，进行基因转化后 的第一步工作是筛选转化细胞。在含有 选择压力的培养基上诱导转化细胞分化， 形成转化芽，再诱导芽生长、生根，形 成转化植株。第二步是对转化植株进行 分子生物学鉴定。第三步则是进行性状 鉴定及外源基因的表达调控研究。
6）微激光束法 利用激光微束脉冲引起细胞膜可逆穿孔， 从而将外源DNA导入受体细胞。 7）花粉通道法
将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头 或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠 心进入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵，合子 或早期胚体细胞。
（二）农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化
人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病， 该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发 生。 1907年 Smith和Townsent等 首先发现这种冠瘿瘤 病是由根癌农杆菌 引发的。
1.抗性基因应是显性基因。 2.在选择压力下，转化细胞能继续生长，而非 转化细胞受到抑制，从而使转化子得到富集。 3.抗性基因产物本身不能对转化细胞的生长或 发育有抑制作用。 4.选择物价廉易得。
1.抗生素抗性基因
1.npt 新霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素、 巴龙霉素、新霉素具有抗性。 2.aphIV 潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素 具有抗性。 3.spt 链霉素磷酸转移酶基因，对链霉素具 有抗性。 4.cat 氯霉素乙酰转移酶基因，使氯霉素丧 失抗生素活性。等等。
T-DNA 的长约 23Kb ，在其两端各有一个 25bp 左右的正向重复序列，称之为 T-DNA 的边界序列。 在不同的农杆菌 Ti 质粒上该序列高度保守，一般认 为右端重复序列对T-DNA的转移起决定性作用。
将目的基因导入植物细胞----农杆菌转化法
消毒
切取
土壤农杆 菌浸泡
叶盘
筛选培养基
愈伤组织 分化幼苗
农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化
1974年 Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种 与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为Ti 质粒。 1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿 瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农 杆菌 Ti 质 粒的 一 个片 段 ，称 为 T-DNA （ TransferDNA）。实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合 进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的 发生。进一步研究发现，整合到植物基因组中的 TDNA 可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代， Ti 质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的 重要基础。
2.抗除草剂基因
• 除草剂抗性基因在植物遗传转化中 可同时用作选择标记和培养抗除草 剂的作物。 • 抗除草剂基因主要有抗PPT的bar和 pat基因以及抗草甘膦的epsps基因。
（二）显色或发光报告基因
• • • • 1.GUS基因 2.荧光素酶基因 3.GFP基因 报告基因仅用于筛选转化体，因为报告基 因是在染色体上，只能间接证明目的基因 转入植物细胞，要获得目的基因转化及表 达的直接证据，还需要进行生物学检测。
基因表达载体的构建过程
质 粒
同一种 DNA分子 限制酶处理
一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得目的基因 DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
三、外源基因导入植物的方法
（一）DNA直接转移法 1）化学刺激法 PEG、PNA（肽核酸）、磷酸钙、氯化 钙等化学试剂等处理原生质体，可使其捕获外 源DNA。 2）电击法 在适当的外加电压下，细胞膜可能被击穿， 使得外源DNA容易进入细胞内。原生质体不受 伤害，而且膜孔可恢复。
二、植物转基因技术的基本路线
1.目的基因的分离 2.载体构建 3.导入细菌并利用细菌繁殖扩增重组DNA 4.对植物组织或细胞进行转化 5.植株再生 6.转基因植株的鉴定 7.转基因植株的种植
(一)目的基因的获取1、从基因中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、化学方法人工合成
二.基因表达载体的构建-----------核心
农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化
Ti 质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链 DNA 分子，长约 200Kb 。其中含有一段称为 T-DNA 的可 转移区段，当农杆菌侵染寄主细胞后， T-DNA 可以 从农杆菌转移到寄主细胞内并整合到寄主细胞的基 因组中。 Ti 质粒的这一特性为农杆菌介导法植物转 基因奠定了基础。