ELISA试剂盒方法测定重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)浓度

验表明在 ’ 型 糖 尿 病 用 磺 酰 类 降 糖 药 无 效 的 病 人 中， 外源性给予 KLM%& 可 有 效 地 降 低 血 浆 葡 萄 糖 浓
［’， #］ 度， 短暂升高胰岛素和 !% 肽浓度 。 对肥 胖 老 年 ’
美 国 L,"!N +AEA2=5J ， 0L,-< 试 剂 盒， ,95 : 公 司 生 产， 批号： （ ?%#) ） 冻 干 粉， 上海华谊 KLM<0&?$ 。 =JKLM%& 生 物 技 术 有 限 公 司 生 产， 规 格 ( : ’ 1G* 支， 批号 ’(($($(& 。 ’ +, 测试原理 此药盒分析应用酶联免疫吸附分 析 （ 0L,-<） 技术。根据说明， 该试剂盒用来检测血 浆 中 KLM%& 的活性形式 ［如 KLM%& （?%#)） 213SA 和 KLM%& （?%#?） ］ 。由 于 华 谊 的 KLM%& 为 KLM%& 活 性 形 式 的 一种， 所以该试剂盒适用于 KLM%& （?%#)） 的检 测。 因 此可 以 用 于 =JKLM%& （ ?%#) ） 的 药 代 动 力 学 研 究。 首先， 活 性 KLM%& 被 预 0L,-< 分析 的原理 简要 如下： 先包被在微 孔 板 板 孔 上 的 特 异 性 针 对 其 " 端 的 单 克隆抗体俘获， 经过洗涤去除未结合物质后， 一个究原著
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中国临床药理学与治疗学 中国药理学会主办 !" #$%&’()* +，,--" &((.%’/(& 0%1234 ： 5567.) 8 ’&59 : 5;1 （$） ： ’(() <6=； && $$$ > $$?
!"#$% 试剂盒方法测定重组人胰 高血糖素类多肽 &’ （(&)*） 浓度
［ &］ 高血糖素 6=A6=;G4H52G;9 蛋白的组成部分 。临床试
素类多肽 %&（?%#)） ［ =JKLM%& （?%#)） ］ 的含量。 方法： 用 L,"!N 公 司 生 产 的 试 剂 盒 对 =JKLM%& （ ?%#) ） 的标 准品和血浆样 本 进 行 定 量 检 测。 结 果： 测定的特异 性、 灵敏度、 测量 范 围、 重现性和回收率满足生物制 品药代动力学研究 的 要 求。 结 论： 用 L,"!N 公 司 生 产的试剂盒定量血浆 样 品 中 的 =JKLM%& （ ?%#) ） ， 该检 测方法符合生物 制 品 检 测 方 法， 可以作为其药代动 力学研究血药浓度的检测方法。 关键词 浓度 重 组 人 胰 高 血 糖 素 类 多 肽 %& ； 血药 0L,-<；
接碱性磷酸酶的抗体与被俘获的 !"#$% 活性 原 形 结 合。最 后， 一 个 荧 光 显 色 底 物 &’# 用 来 生 成 荧 光， 荧光生成量与 !"#$% 活性原形成比例。将相 对 荧 光 单位 ()’ 对 !"#$% 活性原 形 浓 度 作 出 标 准 曲 线， 利 用此标准曲线可以计算相同一块微孔板上未知样品 中 !"#$% 活性原形的含量。 ! "# 测定步骤 测 定 操 作 遵 照 药 盒 说 明 书。 * % ： 每孔 加 +,, ! 弃去液体并 - 洗 液 室 温 下 孵 育 . /01， 在纸巾上拍干。在非特 异 性 结 合 （ 234） 孔内加入分 析稀 释 液 5,, ! 其它样品孔加入分析稀释液 -， 质控样 品 和 待 测 样 品 %,, ! %,, ! - 。然后将标准品、 分别加入 不 同 样 品 孔。 封 板， 6 7 放 置 过 夜。 * 5 ： 弃去板孔内液体并在纸巾上拍干， 洗板， 每孔立即加 入 5,, ! 室温 下 孵 育 5 8， 弃 去， 洗 板。 - 酶联复合物， 每孔 加 5,, ! 避 光， 室 温 放 置 5, /01。 待 足 - 底 物， 够荧光量 产 生， 每 孔 加 ., ! 避 光， 室温下 - 终 止 液， 放置 . /01。 用 荧 光 读 取 仪 于 激 发 波 长 +.. 1/， 发 射波长 69, 1/ 条件下读取相对荧光强度值 （ ()’） 。 ! "$ 试验结果的计算 用 &0:;<=>- 公 司 ?;0@01 软
郑专杰， 方 翼， 王 睿
解放军总医院临床药理室， 北京 &((B/# 摘要 目的： 定量 检 测 血 浆 样 本 中 重 组 人 胰 高 血 糖 糖正常动物的胰 岛 素 分 泌 及 血 糖， 对于给糖负荷动 物， （?%#)） 使其胰岛素分泌增加， 并进而 使升 =JKLM%& 高的血糖明显降低， 表 明 =JKLM%& （ ?%#) ） 具有明显的 葡萄糖依赖的促胰岛素分泌作用。而对化学致糖尿 病模型动物部分 !细胞破坏的胰岛仍有促分 泌胰岛 素及降糖作用。上海华谊生物技术有限公司利用专 利技术生产出重组人 KLM%& （?%#)） ， 药效学 实验显 示 良好的活性， 进行药代动力学研究时， 需要定量检测 血浆样本 中 重 组 KLM%& （ ?%#) ） 的 含 量。 美 国 L,"!N +AEA2=5J， ,95 : 公 司 生 产 的 KLO!<KN"%L,P0 M0M% @,Q0%& （ <!@,R0 ） 0L,-< 试 剂 盒 可 以 测 定 血 浆 中 如 KLM%& （ ?%#) ） 酰 胺。 华 谊 KLM%& 活性原形的 浓 度， 中图分类号：+.)/ : ’ 文献标识码：< 文 章 编 号：&((.%’/(& （’(()） ($%($$$%($ 人胰高血 糖 素 类 多 肽 %& （ KLM%& ） 是天然前原胰
型糖 尿 病， 特 别 是 胰 岛 素 抗 性 患 者， KLM%& 有 降 血 糖、 降糖化血红蛋 白、 果 糖 胺， 增加胰岛素受体敏感
［$， ［)， /］ ?］ 。动物试验 提示重组人胰 高 血 性等有益作用
糖素类 多 肽 %&（ ?%#) ） ［ =JKLM%& （ ?%#) ） ］ 并不影响血
（ >6 :’;86!（ 5):’<8）8&’=5 药盒测 定 华 谊 公 司 产 /13&96! 标准品的典型校正曲线 #?）
（ K$+9） ： 重组人胰高血糖素类多肽 $% （ K$+9） ;8!"#$%
% "%
灵敏度
Q%
实际测定标准品的最低浓度为
上式中 " />D （ 最 大 ()’ 值 ） ： 为 3$ 形 曲 线 最 大 值。 " /01 （最小 ()’ 值） ： （ ., J 3$ 形曲线最小 值； I=., 响应 值 的 对 应 的 浓 度） ： 即 3$ 形 曲 线 中 点； 斜率 （ 3-<GH） ： （ K$+9 ） 浓 度 的 变 化 率。 用 ()’ 值随 ;8!"#$% 被测定未知样品同一块 L9 孔板设置的标 准 曲 线， 计 算样品中 ;8!"#$% （K$+9） 浓 度， 经稀释倍数校正后求 得血浆浓度。
人 !"#$% （ K$+9 ） 酰 胺， "M2=? (HAH>;:8 M1: N 公 司 已 证 明药盒与 !"#$% （L$+9 酰胺） 、 !"#$5 、 !-O:>@<1 无 交 叉 反应或 干 扰 测 定。 本 实 验 待 测 样 品 是 ;8!"#$% （ K$ ， 与药盒标准品的 = 端酰胺化有 +9） = 端未酰 胺 化， 所不同。因此， 华谊公 司 生 产 的 ;8!"#$% （ K$+9 ） 是否 与药盒抗体存在 免 疫 反 应， 能否将该药盒用于定量 测定血浆中 ;8!"#$% （ K$+9 ）浓 度 成 为 方 法 学 至 关 重 要的问题。实验结果表明药盒抗体对华谊公司产品 有良好的反应性， 在半对数坐标上均呈现为典型浓 度依赖性 “ 3” 形 曲 线， （ K$+9 ）浓 度 对 数 值 与 ;8!"#$% 相对荧光强度 值 的 曲 线 可 用 四 参 数 "<@0AB0: 函 数 描
・" 5 G/<% "#
， 人血 浆 中 校 正 稀 释 倍 数 后 实 际 测 定 受 受试标准品的标准浓度
试品 ;8!"#$% （K$+9）的最低定量低限为 5 G/<・" Q % 。 精密度和 测 定 范 围 对 数 %& 选在 “ 3” 形 曲 线 的 5 R 96, G/<・" Q % 范 围 内， 相对荧光强度 ()’ 值。 K 次受试标准品校正曲线批 内 (3S J 均 小 于 %. J ；批 间 (3S J 为 . N , J R 。实验各板均设置受试标准品的校正 59 N % J（表 %） 曲线用于计算同 一 板 内 未 知 样 品 的 浓 度， 对于浓度 高于标准曲线的样品用稀释液稀释至校正曲线范围
图!
&’()* +,-,./01 ’20 " 公 司 产 3&4)53*(6&’78 9896
件作浓 度 对 数 与 光 吸 收 绘 制 标 准 曲 线。 用 四 参 数 "<@0AB0: 函数拟合实验数据： !C （ " />D E " /01 ） AB<GH E " /01 （ # F "$ ., ） %E
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表! "#$%& 法测定华谊公司标准品的重复性和精密度 浓度 ・& ’ ( !"#$% 荧光强度值 批次 ( * / , + . 2 板内 345 ! 6 ( * / , + . 2 !1 " ) *00 1 + /)2 1 . /(0 1 , *-, 1 ( *-) 1 ) *-) 1 * *-. 1 ( ( 72 * 7( ( 7( ) 7+ ) ) 7) 7+ + 7) * /)* 1 ( /(- 1 , //- 1 ( *-+ 1 ( *-, 1 ) *-) 1 ) *-0 1 * ) 7+ ( 7( ) 7, ) 7* ) ) ) 72 . 70 + /(- 1 / /,, 1 ( /+* 1 + *-0 1 , *-- 1 ( *-( 1 / *0- 1 ( ) 70 ) 7* ( 7, ( 7* ) 7+ ( 7) ) 7+ - 7() /,* 1 . /++ 1 . *0, 1 ( *0+ 1 , *0+ 1 + /)0 1 ( ( 72 ( 7, 7/ ) 7+ ( 7* ( 72 ) 7* (( 7 0 *) /-. 1 + ,) ,22 1 /