DNA甲基化与肺癌疗效及预后判断
DNA甲基化与癌症之NGS检测篇
DNA甲基化与癌症之NGS检测篇摘要DNA甲基化是哺乳动物中研究最为深入的表观遗传修饰之一。
正常细胞中，DNA 甲基化有效的调控基因表达水平。
某些抑癌基因的失活是由于启动子区域的高甲基化，大量实验研究表明，在多种类型癌症中，DNA甲基化导致了大范围的基因沉默。
除了启动子区域和DNA重复序列中的甲基化水平改变外，甲基化还与非编码RNA（如肿瘤抑制作用相关的microRNA）的表达调控有关。
DNA甲基化水平与肿瘤发生发展过程的联系，鼓励着我们不断的解码人类表观基因组。
甲基化测序是研究不同生命过程中基因调控的一个重要工具，例如细胞分化和疾病进展，并且越来越多的应用到包括肿瘤早筛、诊断等临床检测中。
全基因组甲基化测序（WGBS）允许无偏好性的进行单碱基分辨率检测，是理想的检测目标区域方法。
当您想进一步研究感兴趣的目标基因组区域，经过杂交捕获后再测序，这种有针对性的甲基化测序检测方案成本更低。
特别地，在评估具有低水平甲基化特征的复杂样本时（如液体活检中的游离DNA），一般需比常规全基因组甲基化测序达到更高的测序深度，杂交捕获成为理想的实验方案。
什么是甲基化在哺乳动物细胞中，DNA甲基化的特征是在DNA甲基转移酶（DNMT）的作用下，胞嘧啶嘧啶环（5-甲基胞嘧啶；5mC）第5位碳原子上添加上甲基基团（-CH3），并且甲基的共价加成通常发生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶中（见下图[1]），该二核苷酸集中在称为CpG岛中，CpG位点成簇的以预期频率出现。
在人类基因组中，约有2800万个CpG位点，约70%的正常体细胞中为甲基化，并且，这些CpG位点的分布并不均匀。
大多数CpG岛的长度为500-1000个碱基对（bp），他们通常跨越启动子区域，特别是管家基因。
与大部分基因组不同，位于CpG岛内的CpG位点通常在正常体细胞中为未甲基化状态。
在哺乳动物中，负责5-甲基胞嘧啶（5mC）形成的DNA甲基转移酶包括DNMT1，DNMT3A及DNMT3B。
DNA甲基化修饰异常与肺癌
第29卷第5期2009年10月国际病理科学与临床杂志 http ://www.g jb.l netIn ternati onal Journal ofPat h ol ogy and C li n i calM ed ici ne Vo.l 29 N o .5O ct . 2009收稿日期:2009-05-25 修回日期:2009-08-30作者简介:胡春燕,硕士,主要从事肺癌的基础研究。
通讯作者:周建华,E m ai:l ji anhzhou@hot m a i .l co m基金项目:湖南省自然科学基金(06JJ2098)。
Th i s work w as s upport ed by Nat u re Sci ence Foundati on ofHunan Provi nce (06JJ 2098),P .R .Ch i na .DNA 甲基化修饰异常与肺癌胡春燕 综述 周建华 审校(中南大学基础医学院病理学系,长沙410078)[摘要] DNA 甲基化是表观遗传学研究的重要内容之一,与多种肿瘤的发生、发展密切相关。
近年研究发现,肺癌相关基因高甲基化及甲基化转移酶的表达异常与肺癌发生有重要关系。
了解DNA 甲基化修饰异常在肺癌发生机制中的作用,将有助于患者的早期预防、早期诊断和改善预后。
[关键词]DNA 甲基化; DNA 甲基转移酶; 肺癌; 去甲基化[中图分类号] R 734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673 2588(2009)05 0398 05Abnor m ality of DNA m ethylation modification and lung cancerHU Chunyan ,Z HOU Jianhua(D e part m ent of P athol ogy,B asicM edical C oll ege ,C e n tral S ou t h Universit y ,Changsha 410078,Ch ina )[Abstract] DNA m ethylati o n is one of t h e i m portan t contents i n ep i g enetics research and it isclosely related to the occurrence and the deve lopm ent o f various tum ors .Recent research found that the hyper m ethy lation of l u ng cancer re lated genes and the abnor m al expressi o n o f m ethy ltransferase w ere closely related to t h e occurrence of l u ng cancer .Understand i n g the role of t h e abnor m a lDNA m ethy lation i n lung cancer pathogenesi s is bene ficial to earl y prevention and diagnosis as w e ll as the i m prove m ent o f prognosis for diseases .[Key w ords] DNA m ethy lati o n ; DNA m ethy ltransferase ; gene ; de m ethylati o n[Int J Pathol C linM ed ,2009,29(5):0398 05]肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。
DNA甲基化在肿瘤发生中的作用
DNA甲基化在肿瘤发生中的作用肿瘤是人类健康的头等大事，它是由基因突变和表观遗传学变化引起的遗传疾病。
DNA甲基化是一种常见的表观遗传学变化，它是指DNA分子在胞内繁殖时，通过在在五碳脱氧核糖核苷酸的C5位加上一个甲基基团而产生的一种修饰，它在正常组织中具有调控基因表达，维护基因稳定性，参与细胞分化和应答外源性刺激等多种功能。
但是，在肿瘤发生中，DNA甲基化的模式发生改变，造成癌基因的高度表达或肿瘤抑制基因的沉默，这种表观遗传学的改变往往会引起肿瘤的发生和发展。
因此，深入了解DNA甲基化在肿瘤发生中的作用，对于治疗肿瘤有着重要的意义。
DNA甲基化的机制DNA甲基化是一种简单的化学修饰，它是由甲基转移酶催化丙烷基单元(C1)从S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)转移到细胞内DNA链合成过程中的胞嘧啶(Cyt)的C5核苷酸上。
DNA甲基转移酶(DNMT)是DNA甲基化的关键酶，它包括DNMT1, DNMT3a和DNMT3b三个亚型。
DNMT1是在细胞分裂期间能够保证分子和细胞的遗传稳定性，通过识别和甲基化前一代细胞从父本获得的甲基化DNA，维持其在细胞分裂后的遗传稳定性。
DNMT3a/b通过识别新的DNA序列元素来甲基化胞苷。
然而，过度的DNA甲基化也可能触发继承性的表观遗传学改变，从而引起肿瘤的发生。
DNA甲基化对于肿瘤的发生和发展，具有重要的作用。
它可以通过多种方式参与调节肿瘤细胞的基因表达和功能。
首先，DNA甲基化可以引起癌的基因高度表达，包括促细胞分裂和生长的基因和转录激活因子。
例如，在结肠直肠癌和胃癌中，印迹基因CDKN2A的启动子区域的甲基化状态的改变被认为是这些肿瘤的重要驱动因素。
此外，在癌症中经常出现的促细胞分裂和生长信号通路基因的DNA甲基化也是引起癌症的重要机制之一。
其次，DNA甲基化还可压制肿瘤抑制基因的表达。
肿瘤抑制基因损失或其功能异常的情况下，细胞将失去对癌症的抵抗能力。
例如，在人类胃癌和乳腺癌中，肿瘤抑制基因BRCA1的基因沉默与BRCA1启动子区域的甲基化增加有关联。
肺癌的分子标志物与早期诊断研究
肺癌的分子标志物与早期诊断研究引言：肺癌作为全球范围内死亡率最高的恶性肿瘤之一，早期诊断对于患者治疗和生存率具有重要意义。
然而，由于其隐匿性和无特异性的症状，往往导致晚期确诊。
因此，寻找有效的分子标志物用于肺癌的早期诊断已成为许多研究者关注的焦点。
一、肺癌相关分子标志物1. 血液循环中可检测到的标志物血液样本是非侵入性获取生物学信息的重要途径之一。
在血液中，许多分子标志物被认为与肺癌发生和发展密切相关。
其中最有潜力的标志物包括循环肿瘤细胞（CTCs）、DNA甲基化修饰、miRNA等。
a) 循环肿瘤细胞(CTCs)循环肿瘤细胞是指从原发肿瘤脱落进入血液循环并迁移到其他部位的恶性细胞群体。
检测CTCs在早期诊断中起着重要作用。
b) DNA甲基化修饰DNA甲基化修饰是肺癌发生和发展过程中常见的遗传改变。
通过检测血液样本中DNA的甲基化状态，可以辅助早期诊断及预后判断。
c) miRNAmiRNA是一类非编码RNA，与多种肿瘤相关。
许多研究表明，某些特定的miRNA在肺癌早期诊断中有较高的敏感性和特异性。
2. 呼出气标志物近年来，呼出气体分析成为一种非侵入性、简单易行、经济实用的方法。
研究表明，在呼出气息中存在一些潜在的分子标志物，具有很强的早期诊断价值。
a) 挥发性有机化合物（VOCs）肺癌患者呼出气息中挥发性有机化合物（VOCs）含量与健康人群存在差异。
通过检测呼出气体中特定VOCs的水平，可以对肺癌进行早期诊断。
b) 血液气体检测除了VOCs外，血液氧气和二氧化碳浓度的变化也被认为是肺癌早期诊断的标志物。
二、研究进展1. 基于分子生物学方法的早期诊断研究通过利用血液样本或呼出气体中的特定分子标志物，结合分子生物学技术，已经取得了一些进展。
例如，利用PCR技术检测CTCs数量的多元化平台、甲基化特征和miRNA水平等方面开展的研究。
2. 基于人工智能技术的肺癌早期诊断随着人工智能（AI）技术的发展，其在医学领域也得到广泛应用。
肺泡灌洗液中DNA甲基化检测在周围型肺癌诊疗中的应用研究演示稿件
VS
详细描述
通过对周围型肺癌患者进行甲基化检测， 可以了解肿瘤细胞的甲基化状态，从而评 估患者的预后。甲基化水平较高的患者通 常预后较差，生存期较短，且容易发生复 发和转移。因此，甲基化检测可以为临床 医生提供重要的预后信息，有助于制定更 加个性化的治疗方案。
06
结论与展望
研究结论
肺泡灌洗液中DNA甲基化检测在周围型肺癌的诊断中具有较高的敏感性和 特异性，有助于早期发现肺癌。
肺泡灌洗液是周围型肺癌诊断中 常用的样本，通过支气管镜获取 。
100%
样本处理
采集的肺泡灌洗液需要进行离心 、去细胞碎片等处理，提取出上 清液用于后续检测。
80%
样本保存
处理后的样本应保存在-80℃低温 冰箱中，以保持DNA的稳定性。
检测方法与流程
检测方法
目前常用的肺泡灌洗液中DNA 甲基化检测方法包括甲基化特 异性PCR（MSP）、焦磷酸测 序（Pyrosequencing）和基 于芯片的检测技术等。
肺泡灌洗液中DNA甲基化检测 在周围型肺癌诊疗中的应用研
究
汇报人:XXX
2024-01-08
目
CONTENCT
录
• 引言 • DNA甲基化概述 • 肺泡灌洗液中DNA甲基化检测技术 • DNA甲基化检测在周围型肺癌诊疗
中的应用 • 案例分析 • 结论与展望
01
引言
研究背景
02
01
03
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其中周围型肺癌 占比较高。
02
DNA甲基化概述
DNA甲基化定义
DNA甲基化是指在DNA序列中，CpG位点的胞嘧啶被甲基所修饰 ，形成5-甲基胞嘧啶的过程。
DNA甲基化是基因表达调控的重要机制之一，对维持细胞正常功 能和个体发育具有重要意义。
DNA甲基化——新一代癌症早期诊断指标(肺癌篇)
DNA甲基化——新一代癌症早期诊断指标（肺癌篇）导读：在全世界范围内，肺癌是威胁公众健康的头号恶性肿瘤，早期诊断可大大提高5年存活率。
肺泡灌洗液（BALF）由于创伤小、毗邻肿瘤细胞，有望成为肺癌的早期诊断标本。
然而，受诸多因素影响，BALF的细胞学检查灵敏度并不高。
近年来，随着分子遗传学技术的发展，灵敏度高、特异性强的肿瘤标志基因检测被广泛地应用于临床诊断、治疗及预后评估。
BALF遗传学标志物的检测有望辅助肺癌早期诊断。
1、肺癌与DNA甲基化DNA甲基化是表型修饰的一种，与癌症的发生密切相关。
尤其是CpG岛区的启动子超甲基化可能会导致抑癌基因转录沉默，从而影响肿瘤发生的进程。
由于DNA甲基化几乎在所有癌症中均有发现，并且发生在癌前或者癌症早期阶段，因而有望成为癌症早期诊断的理想标志物。
矮小同源盒基因（SHOX2）和RAS相关家族1A(RASSF1A)是常见的肺癌DNA甲基化标志物。
SHOX2属SHOX基因家族，位于3号染色体q25-q26.1区域，编码60个氨基酸构成的DNA 结合区域蛋白,是一种常见的转录调控因子。
RASSF1A是Ras信号通路的成员，位于3号染色体p21.3，调控细胞的增殖和自噬。
研究显示，相比于肺腺癌，SHOX2基因甲基化检测对于小细胞肺癌和鳞癌具有更高的特异性。
而RASSF1A的表达下调对肺腺癌的发展至关重要。
2、DNA甲基化检测方法对于特定片段的甲基化检测方法很多，包括甲基化特异性PCR（MS-PCR）、亚硫酸盐处理+测序、联合亚硫酸盐的限制性内切酶法（COBRA）、焦磷酸测序、PCR荧光变性曲线分析及荧光定量法（MethyLight）等。
MS-PCR：DNA 经亚硫酸盐处理后, 非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持不变。
在PCR 反应时, 有两套不同的引物对，分别针对经处理后的甲基化和非甲基化链，若甲基化的链被扩增出说明发检测位点生了甲基化，若非甲基化的链被扩增出，则说明无甲基化。
抑癌基因甲基化与肿瘤的预后及化疗疗效
抑癌基因甲基化与肿瘤的预后及化疗疗效
抑癌基因甲基化是DNA甲基化这一过程中的一种现象，指的
是与抑癌基因相关联的DNA区域上的甲基化现象。
许多实验
和研究表明，抑癌基因甲基化的存在与肿瘤的预后和化疗疗效密切相关。
首先，抑癌基因甲基化被普遍认为是一种肿瘤早期事件。
在许多研究表明，抑癌基因甲基化可以作为一种早期肿瘤标志物进行检测和诊断，而且其浓度和程度与肿瘤的恶性程度呈正相关。
因此，可以说抑癌基因甲基化是一个重要的预后指标，它可以帮助医生预测肿瘤的生长和扩散趋势，从而为病人提供更好的治疗方法选择。
其次，抑癌基因甲基化也对肿瘤的化疗疗效有重要影响。
一些研究表明，抑癌基因甲基化的存在可以导致化疗药物对肿瘤细胞的作用减弱，从而使化疗疗效降低。
因此，了解抑癌基因甲基化状态可以使医生更好地预测肿瘤的药物敏感性，从而更好地选择和调整化疗药物的类型和剂量，以提高治疗疗效和减少不良反应的发生率。
总之，抑癌基因甲基化是肿瘤研究和治疗中一个重要的领域，其对肿瘤的预后和化疗疗效有着重要而又复杂的影响，需要进一步的研究和探索。
未来将会有越来越多的关于抑癌基因甲基化与肿瘤治疗的研究出现，这将为人类提供更精确、更有效的肿瘤治疗方法。
DNA甲基化在人类癌症中的作用
DNA甲基化在人类癌症中的作用DNA甲基化与人类癌症DNA甲基化是一种转移甲基基团到DNA分子上的反应，它可以改变某个基因的表达和功能。
在人类癌症中，DNA甲基化起着重要的作用。
在这篇文章中，我们将讨论DNA甲基化的作用以及如何在癌症治疗中利用它。
DNA甲基化的作用和机制DNA甲基化是一个添加一个甲基基团到DNA链上一个特定的碱基（通常是胞嘧啶）的反应。
这个过程由甲基转移酶来完成。
通常情况下，甲基转移酶会在胞嘧啶与鸟嘌呤相连的CpG位点上加上甲基基团。
这些位点通常分布在基因上下游以及调节区域。
甲基化可以阻止RNA聚合酶的结合、调节外显子的剪切和阻止转录因子与DNA之间的相互作用。
甲基化水平的变化是人体一些生理和病理过程的关键因素。
在正常情况下，DNA甲基化是保持细胞状态稳定不变的一种方式。
而在某些情况下，例如癌症，机体内的DNA甲基化分布会有很大的变化。
DNA甲基化与人类癌症的关系在癌症中，由于DNA甲基化不正常，细胞基因的表达和功能发生混乱，导致癌细胞的异常生长和扩散。
全基因组甲基化水平的变化与几乎所有类型的癌症相关，例如结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌等。
这些癌症的DNA甲基化变异模式与DNA损伤、DNA修复以及失效的基因表达等因素相关。
DNA甲基化失调与癌症的关系被证明是双向的，因为某些基因在癌症中可能会被过度甲基化或低甲基化。
例如，转录因子和DNA修复基因的异常表达可以促进癌症的发展。
由于DNA甲基化与癌症之间的相互作用，对DNA甲基化的观察和研究成为了诊断和治疗癌症的重要方法。
DNA甲基化在癌症治疗中的应用在研究人类癌症的过程中，发现一个新的癌症标志物可以加速诊断和治疗过程。
DNA甲基化已被证明是一种可靠的癌症标志物，在诊断癌症和监测疗效方面发挥着重要作用。
例如，乳腺癌病人的血液中的CpG甲基化水平的变化可以判断病人的预后和治疗效果。
许多研究人员利用这些表征基因的CpG位点来评估疗效。
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DNA甲基化与肺癌疗效及预后判断
前面我们已经初步认识了主要的导致肺癌的抑癌基因的甲基化。
事实上这些甲基化的抑癌基因作为分子标志物不仅可早于传统的肿瘤标志物辅助肿瘤的诊断，它们对于肺癌的疗效评价及预后判断也密切相关，下面来详细了解这些甲基化基因在预后和疗效评估方面的应用：
1、MGMT
MGMT 是一种重要的DNA 修复酶，在修复烷化剂造成的DNA 损伤中发挥重要作用。
MGMT启动子区的超甲基化会导致肿瘤细胞对烷化剂的敏感性增加，从而引起细胞损伤及死亡。
有临床试验证实，对于复发的SCLC患者，MGMT启动子高甲基化者，对烷化剂替莫唑胺的反应性优于MGMT未甲基化者[7]。
然而，有研究发现，对于脑转移的NSCLC 患者，MGMT 启动子的高甲基化，可能意味着切除转移瘤后更大的复发可能性[4]和更短的患者生存期（2.5个月vs. 9.7个月）[8]。
2、人类mutL同系物1（hMLH1）
hMLH1 基因是DNA 错配修复基因之一，主要功能是修复DNA 复制错误，维持基因稳定性。
有研究认为，hMLH1甲基化可能在肿瘤化疗耐药中发挥了重要作用，甚至可能介导顺铂耐药。
吴芳等通过MS P 分析，发现NSCLC耐顺铂细胞株中存在hMLH1启动子的高甲基化失活，而在敏感株中未发现甲基化，用去甲基化药物作用于耐受细胞株后可增强细胞对顺铂的敏感性[10]；并证实hMLH1甲基化状态与NSCLC患者的无病生存期相关，是手术切除后、顺铂辅助化疗后发生肿瘤复发和转移的危险因素[11]。
3、RASSF1A
R A S S F1A 是一种抑癌基因，是近年来发现的在肿瘤中甲基化程度最高、最多见的基因之一。
张卉[12] 等检测了150 例NSCLC 发现，RASSF1A 启动子高甲基化的患者预后较RASSF1A 未甲基化的患者差（中位生存期：22个月vs.57 个月），Cox 回归显示，RASSF1A启
动子甲基化状态是NSCLC术后的预后相关因素。
Yanagawa N等[13]亦发现，RASSF1A甲基化的病例五年生存率显著低于未甲基化组（58.6% vs.78.1%）。
Jun Wang等的回顾性meta 分析证实，对于手术治疗的NSCLC患者，R A S S F1A 高甲基化是一项独立的预后影响因素，其无病生存期及总生存期均显著低于未甲基化的患者[14]。
4、胰岛素样生长因子结合蛋白3 (IGFBP-3)
IGFBP-3 是IGFBP 家族的成员，可阻断IGF-I 介导的促有丝分裂和抗细胞凋亡，被认为是一种候补抑癌基因。
Caceres 等[16] 通过基因表达芯片分析，发现顺铂耐受组IGF B P -3 高甲基化比例显著高于顺铂敏感组（14/19 v s . 2/17,p<0.001），而用s i R N A 沉默敏感株的I G F B P -3 表达可诱导细胞对顺铂的耐受。
Cortes- Sempere M等[17] 进一步发现，肿瘤细胞中IGFBP-3 启动子甲基化导致IGFBP-3 蛋白表达缺失，顺铂治疗时可能通过特异性抑制IGFIR 通路转而活化PI3K/AKT 通路，从而诱导对顺铂耐药。
5、p16
p16 基因的蛋白产物是细胞周期依赖性激酶（CDK）的抑制因子，通过抑制R B 蛋白的磷酸化，将细胞周期阻滞于G1 期。
Brock 等发现p16、CDH13、RASSF1A和A P C 的甲基化状态与肺癌的复发的相关性。
肿瘤组织和纵隔淋巴结中同时检测到p16 和C D H13 高甲基化的患者，其术后短期复发的可能性显著高于未甲基化组（HR：15.5）[18]。
研究者认为这些基因在正常淋
巴结中高甲基化提示可能存在显微镜无法检测到的微转移灶，对预测疾病的复发情况可能有意义。
其他基因的异常甲基化与肺癌的疗效评价及预后判断
1、DAPK
DAPK是一种钙离子和钙调素依赖的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，参与干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、Fas等诱导的细胞凋亡过程，具有促进凋亡的功能，DAPK的表达缺失与其基因CpG岛过甲基化有关。
近来，有研究认为DAPK超甲基化与NSCLC细胞株对西妥昔单抗和厄洛替尼耐药有关[5]。
此外，DAPK甲基化与NSCLC预后相关，DAPK启
动子超甲基化的NSCLC总生存率显著低于未甲基化组[23]。
2、TFPI-2
TFPI-2是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，可抑制多种金属蛋白酶。
下调TFPI-2可增强肿瘤细胞的侵袭潜能。
TFPI-2的甲基化状态是NSCLC的独立预后影响因素，对于无远处转移的NSCLC 患者而言，TFPI-2甲基化的患者预后较差（5年无病生存率：6.1%vs. 35.5%）[6]。
此外，NSCLC中报道较多的预后相关的甲基化位点还有结肠腺瘤性息肉病基因（APC）、脆性组胺酸三联体（FHIT）、H钙粘蛋白（CDH13）等[24]。
由上文可见，肺癌相关抑癌基因的甲基化除了有望应用于肿瘤的早期诊断和良恶性区分，且在肺癌的疗效跟踪和预后评估等方面也具有一定的应用潜力。
我们期待通过发掘更优性能的甲基化标志物或几项基因标志物的组合检测，制定更早期、准确的临床筛查及预后评估方案，从而不断提高肿瘤患者的存活率和生活质量！
来源：王纪文. DNA甲基化与肺癌的疗效评价及预后判断[J]. 医药前沿, 2013(34):74-75.。