微生物学基本操作技术演示文稿
微生物及无菌操作课件共37页文档
3、滤过除菌法
4、射线除菌法
1、干热灭菌法
系指在干燥环境中进行灭菌的方法。
火焰灭菌法 干热空气灭菌法
1.1火焰灭菌法
系指用火焰直接灼烧灭菌的方法。 该法适用于耐火焰材质（如金属、玻璃及瓷器等）的物品与用具的灭菌，不适合药品的灭菌。
1.2干热空气灭菌法
系指用高温干热空气灭菌的方法。 该法适用于耐高温的玻璃和金属制品以及不允许湿气穿透的油脂类
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“灭菌方法与无菌操作”
01 基本概念
n灭菌：系指用物理或化学等方法杀灭或除去所有致病和非致病微生物繁殖体和芽孢的手段。 n灭菌法：系指杀灭或除去所有致病和非致病微生物繁殖体和芽孢的方法或技术 n无菌：系指在任一指定物体、介质或环境中，不得存在任何活的微生物。 n无菌操作法：系指在整个操作过程中利用和控制一定条件，使产品避免被微生物污染的一种操作方法或技术 n防腐：系指用物理或化学方法抑制微生物的生长与繁殖的手段，亦称抑菌。对微生物的生长与繁殖具有抑制作用的物质称抑菌剂或防腐剂。 n消毒：系指用物理或化学方法杀灭或除去病原微生物的手段。对病原微生物具有杀灭或除去作用的物质称消毒剂。
“灭菌方法与无菌操作”
02 分类
目的
n提高药物制剂的安全性 n 保护制剂的稳定性
n 保证制剂的临床疗效
灭菌法
n物理灭菌法 n化学灭菌法 n无菌操作法
“物理灭菌法”
n利用蛋白质与核酸具有遇热、射线不稳定的特性，采用加热、射线和过滤方法， n杀灭或除去微生物的技术称为物理灭菌法。
1、干热灭菌法
2、 湿热灭菌法
Microorganism
微生物是什么
微生物检验的基本操作技术
微生物检验的基本操作技术一、无菌操作技术1、定义是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。
2、内容无菌操作技术主要包括两方面：1）创造无菌的培养环境。
包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。
包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。
3、无菌操作原则1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。
严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。
二、无菌操作的环境要求1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；（2）无菌室的消毒和防污染•每日（使用前）紫外线照射（0.5~1小时）；•每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；•每季度用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时），特殊情况下可增加熏蒸频次。
（3）无菌室使用要求①无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；②无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；③处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
微生物培养及实验基本操作技术
微生物培养及实验基本操作技术一、培养基配制培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。
配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。
注意事項–灭菌锅的使用①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培养基中的主要成分及其作用：营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等抑制剂：1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。
2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。
培养基的类型：●根据培养基的物理状态来区分：1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。
●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。
●根据培养基的用途来区分：➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。
微生物学(PPT格式课件)第六章微生物的生长及控制
一、 温度(temperature)
微生物学(PPT格式课件)第六章微 生物的生长及控制
根据温度对微生物的影响分类
嗜冷菌 (<20oC) 嗜温菌 (20-45oC) 嗜热菌 (50-60oC) 嗜高温菌 (80-95oC) 极端高温菌(105-150oC)
应用范围
生产为主
实验室为主
分批培养与连续培养的比较
微生物学(PPT格式课件)第六章微 生物的生长及控制
连续培养的优缺点
优点
高效 自控 产品质量稳定 节约动力、人力、水和蒸汽等
缺点
菌种容易退化 容易污染杂菌 营养物的利用率低于单批培养
微生物学(PPT格式课件)第六章微 生物的生长及控制
Thermophile and Biotechnology
来自嗜热菌的酶可在高温下稳定的催化生物化学反应；
其中由Thermus aquaticus 中分离出来的 DNA 聚合酶， Taq polymerase， 已广泛应用于PCR反应；
分离自Pyrocuccus furiosus 的 pfu polymerase应用于
嗜碱微生物（basophile） 多数放线菌、硝化细菌、根瘤菌等
耐碱微生物（basotolerant microorganism） 若干链霉菌
• 嗜酸微生物（acidophile） • 多数真菌
• 耐酸微生物(acidotolerant microorganism) 乳酸杆菌、醋酸杆菌，许多肠杆菌等
微生物学(PPT格式课件)第六章微 生物的生长及控制
Ⅲ 稳定期(stationary phase)
①生长速率常数R=0，即新繁殖的细胞数与衰亡的细 胞数相等；
微生物无菌操作技术ppt课件
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分区划线法
连续划线法
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6、穿刺接种 穿刺接种技术是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到
固体或半固体的深层培养基中的接种方法。 用于厌气性细菌培养、检查细菌的运动能力、保藏菌种。 只适宜于细菌和酵母的接种培养 具体操作： ①贴标签 ②点燃酒精灯 ③接种 1）手持试管 2）旋松试管塞 3）接种针灼烧灭菌，接着把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也 灼烧灭菌 4）拔出试管塞
吸入预过滤器，经由静压箱进入高效过滤器过滤，将过滤后的空气
以垂直或水平气流的状态送出，洁净空气(进滤空气)按
设定的方向流动而形成的。使操作区域达到
所需的洁净度。
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超净工作台的使用及注意事项 ①使用前30到60分钟用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面 ，打开紫外灯照射30min；
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超净工作台（clean bench）与生物安全柜（Biosafety Cabinet）不同 。超净工作台只能保护在工作台内操作的试剂等不受污染，并不保护工 作人员，而生物安全柜是负压系统，能有效保护工作人员。
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2、无菌室的操作规则
①将所有的实验器材和用品一次性全部放入无菌室（如同时放入培养基 则需用牛皮纸遮盖）。应尽量避免在操作过程中进出无菌室或传递物品 。操作前先打开紫外灯照射半个小时，关闭紫外灯后，在开始工作。
3、其他器具的准备
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（2）灭菌和消毒
消毒：用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物的措施， 实际上是部分灭菌。例如，酒精擦拭。
灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外所有微生物永远丧失其生长 繁殖能力的措施。
微生物检测技术 演示文稿
（二)外部质量控制
a.实验室应参加外部的质量控制活动,对其开展的每 一项检测均应参加相应的室间质量控制。
b.对有关实验室或管理机构发出的测试样品应严格 地当作普通样品一样处理,这样一种方法有助于实验 室每天测试的准确性和重复性,是对实验室所用的方 法,试剂,设备,人员能力的测试。
C.从室间样品测试中的错误可以发现实验室的 不足之处,对工作人员的教育改进可以提高实 验室的检测质量。
7、微生物的生长
1.个体生长很不明显，持续很短时间就繁殖。
被后人尊为细菌学鼻祖，传染病的克星，细菌学的奠基人和开拓者 传染病是人类健康的大敌。从古至今，鼠 疫、伤寒、霍乱、肺结核等许多可怕的病 魔夺去了人类无数的生命。人类要战胜这 些疾病，首先要弄清楚致病的原因。而第 一个发现传染病是由病原细菌感染造成的 人就是罗伯特· 科赫。
2003年，经过全球10个国家的科学 家的共同努力，终于确认了冠状病毒 是SARS的病原体。最终判定这种冠 状病毒是否真正的元凶，依靠的是 100多年前德国伟大的细菌学家科赫 提出的“科赫原则”。
微生物
金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 沙门氏菌 酵母菌 霉菌
热死 时间 温度( ℃) 时间( 分)
63 60 60 50~60 60 7 5~30 5 10~15 5~10
消毒与灭菌方法 a、干热灭菌法
1.火焰灭菌（酒精灯） 2.干热灭菌（电热干燥箱） b、湿热灭菌法 1.巴氏消毒 2.煮沸消毒 3.间歇灭菌法 4.加热蒸汽灭菌法（高压灭菌锅） c、辐射 d、过滤 e、化学方法
微生物检验技术
讲授:周慧恒
目录
一、第一讲 二、第二讲 三、第三讲 四、第四讲 五、第五讲 六、第六讲 七、第七讲 八、第八讲 九、第九讲 十、第十讲
最新微生物保藏及基本操作技术PPT课件
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
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真空干燥
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随 后逐渐达到26.6～13.3Pa，在此条件下，样品将保持冻 结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。
终止干燥时间应根据下列情况判断：
安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状 真空度接近空载时的最高值 样品温度与管外温度接近 选用1～2支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为
灭菌
121 ℃，30min.
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保护剂的准备
保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管； 灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌
20min； 打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅
速放入凉水中冷却； 30℃培养2天，无菌检查合格后备用。
冻结速度对菌种细胞的影响
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菌种保藏技术进展
❖ 原位低温保藏技术
有些菌种不可培养，也无法采用标准的冷冻干燥技术保藏，如一 些致病菌、无法培养的菌种或者与其他微生物共生的菌种（如菌 根真菌）等。这些菌种可采用原位低温保藏技术，这一技术已经 被应用在一些锈菌种的保藏过程中。
对于1微米直径的纯净水滴，只有当冷却速率高达107℃/秒时才 能实现“玻璃化”。
微生物检验的基本操作技术
微生物检验的基本操作技术一、无菌操作技术1、定义是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。
2、内容无菌操作技术主要包括两方面：1）创造无菌的培养环境。
包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。
包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。
3、无菌操作原则1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；2）在操作前20〜30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。
严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。
二、无菌操作的环境要求1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；(2)无菌室的消毒和防污染■每日(使用前)紫外线照射(0.5~1小时)；•每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；•每季度用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸(2小时)，特殊情况下可增加熏蒸频次。
(3)无菌室使用要求①无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；②无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；③处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
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选择培养基分离
选择培养基特性
促生长能力 抑制能力 指示（鉴别）能力
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都 应接种此平板。
营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、
一、微生:
- 球型 (Sthaphylococcus) - 棒状(Escherichia coli) - 螺旋 (Rhodospirillum) 生长迅速，20min至几小时可 繁殖一代 可利用多种碳源
真核生物
细胞器： 线粒体 内质网 高尔基体 液泡
曲线法：
将挑取有样品的接种环在平板培养 基上作连续划线。
平板划线法
血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌（大的金黄色菌落）
平板倾注法
对起始样品进行连续10倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀， 培养后获得单菌落。 培养基表面菌落为圆形，而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。
一、微生物分类
/cells/procaryotes/images/ procaryote.jpg
/cells/animals/images/animalcell.jpg
一、微生物分类
原核生物
微生物学基本操作技术演示文稿
内容
微生物分类 微生物接种和培养 微生物的分离 微生物的鉴定 微生物保藏 质控微生物
一、微生物分类
一、微生物分类-微生物的进化和多样性
普遍性系统发育树,亲缘关系根据rRNA序列比较来决定。
G. J. Olsen and C. R. Woese, ‘Ribosomal RNA: A key to Phylogeny’ in the FASEB Journal, 7:113123,1993
二、微生物接种和培养
三、微生物分离
微生物纯培养分离技术
纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。 获得纯培养物对微生物学研究至关重要。
微生物纯培养分离技术
涂布平板法 平板划线法 平板倾注法 稀释摇管法
液体培养基分离法 单细胞（孢子）分离法 选择培养基分离法
涂布平板法
1、少量样品加到平板中央（0.1mL）； 2、玻璃三角涂棒浸入酒精； 3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却； 4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养。
稀释摇管法
适合厌氧菌的纯培养分离
无菌琼脂培养基试管加热 使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右 梯度稀释后的待分离菌株加入试管中
摇匀、冷凝 在琼脂柱表面倾倒一层灭菌 液体石蜡和固体石蜡的混合物 培养后，菌落形成在琼脂柱的中间
液体培养基分离
不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液 体培养基分离来获得纯培养。
焰上灼烧； 接种环灼烧灭菌后插入试管内，冷却、挑菌，转入另一斜面底部
，沿斜面划曲线或直线。
二、微生物接种和培养
二、微生物接种和培养
液体接种
操作方法与斜面接种基本一致，只是将接种环送入液体培养基中 时使接种环与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散；
塞上棉塞，轻轻摇动均匀； 如果菌种培养在液体培养基中，使用移液管或滴管接种。
涂布平板法
样品需适当稀释30-300CFU/mL
平板划线法
斜线法 曲线法 方格法 放射法 四格法
平板划线法
斜线法：
用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的 一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿70°角，并 将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作 第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第 三次平行划线和第四次平行划线。
微生物接种定义
将微生物的纯种或含菌材料（如水、食品、空气、土壤、排泄物等）转 移到培养基上，这个操作过程叫微生物的接种。
接种工具
微生物接种技术分类
✓ 斜面接种 ✓ 液体接种 ✓ 穿刺接种 ✓ 平板接种
二、微生物接种和培养
斜面接种
左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平； 右手先将棉塞（硅胶塞）拧转松动，再拿接种环； 用右手的小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，同时将管口在火
二、微生物接种和培养
三、微生物接种和培养
穿刺接种
用接种针调取菌种后，插入深层固体培养基内（不要刺到底部） ，再沿原路拔出；
此法用于厌气性细菌接种，检查细菌的运动能力。
二、微生物接种和培养
二、微生物接种和培养
平板接种
平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，以及活菌计数 等； 平板接斜面：平板分散的单菌落接于斜面； 斜面接平板：点种法、划线法。
“种” 的定义：一个种（基因型 种）是有相似G+C组成并通过 DNA杂交试验判断由70%或更大 相似性的菌株的集合。
分类等级
界（Domain） 门（Phylum） 纲（Class） 目（Order） 科（Family） 属（Genus） 种（Species）
二、微生物接种和培养
二、微生物接种和培养
奈瑟菌等的标本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制G+细菌，有选择地促进
一、微生物分类
真核生物
一、微生物分类-多相分类
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征
遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
多相分类 Polyphasic Texonomy
Technology
一、微生物分类-微生物的分类等级
“种”是微生物分类中最基本的分 类单元。
稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。
在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数 （一般应超过95%）表现为不生长。
单细胞（孢子）分离
单细胞（或单孢子）分离法 是采取显微分离法从混杂群 体中直接分离单个细胞或单 个个体进行培养以获得纯培 养。
较大的微生物，可采用毛细 管提取单个个体。
个体相对较小的微生物，需 采用显微操作仪，在显微镜 下用毛细管或显微针、钩、 环等挑取单个微生物细胞或 孢子以获得纯培养 。