农杆菌感受态制备
农杆菌的转化流程
农杆菌的转化流程方案一1. 农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板，26-28℃培养48 h；②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中,250 r/min，26-28℃悬浮培养12—16 h；③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min,离心8 min；④弃上清，加入用100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌；⑤4℃，8000 r/min，离心8 min；⑥弃上清,加入原始菌液1/50体积（800μl/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μl）的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦置液氮中10 s，放入-20℃冰箱中保存备用。
2.农杆菌的转化（冻融法）将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀,冰上放置30 min;②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中,待其融化；③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2-4 h；（或直接用1 mlμl，留500 μ l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体，将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板)；⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h；⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中，28℃，250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素.在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染。
以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。
3．转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养：① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后，用无菌水清洗两次，更换NaClO处理25—30 min，无菌水清洗四次;②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1。
农杆菌感受态制备之欧阳道创编
版本一 1.1农杆菌感受态细胞的制备 1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。
4℃5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。
再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。
28℃培养到形成单菌落。
其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl （7.0） 0.01 DTT）替代。
版本二普通农杆菌感受态制备与转化： 1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。
5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80℃待用。
农杆菌感受态细胞的制备
农杆菌感受态细胞的制备在科学的世界里，农杆菌这家伙可是个大明星，尤其是在植物基因工程中，简直就像是超级英雄一样的存在。
说到农杆菌，它是个很有趣的小家伙，特别是在我们想把新基因转移到植物里的时候，它的表现真是让人惊叹。
今天就来聊聊怎么准备感受态细胞，听起来有点高大上，其实就是让植物细胞准备好接受外来的基因，像小朋友期待新玩具一样，兴奋得不得了。
要准备的就是农杆菌的培养。
想象一下，咱们要给这些小家伙开个派对，当然要先让它们有个好环境。
选个合适的培养基，像是给它们铺一张舒适的床。
然后，温度、pH值、氧气这些条件也得一丝不苟，不能马虎。
温度太高，农杆菌可受不了，像人一样，热得直冒汗；温度太低，它们又会懒洋洋的，没精神。
要是培养基里的营养不够，嘿，那简直就是饿肚子的小朋友，没啥干劲。
就得让这些小家伙进入生长期，哈哈，听起来像在养宠物。
等它们长到合适的密度，咱们就准备好收割成果啦。
这时候，得小心翼翼地把它们从培养基里取出来，别把它们给弄伤了，像捧着刚出生的小宝宝一样。
取出的细胞要经过洗涤，洗去多余的培养基，确保它们干净得像新洗的衣服。
用生理盐水轻轻地重悬这些细胞，调成合适的浓度，让它们准备好迎接“客人”。
这里有个小窍门，嘿嘿，增加细胞的感受性。
可以用一些特殊的化合物，比如PEG，这玩意儿就像催化剂，能帮助细胞更好地接受外来的DNA。
想象一下，像是给小朋友加了点魔法，立马变得更加活泼，更有好奇心。
然后，得把想要转移的DNA和这些感受态细胞混合。
这个过程就像搭积木，得小心翼翼，别让它们散架。
把这个混合物在特定的条件下静置一段时间，让细胞慢慢适应，就像在等待一场盛大的聚会。
期间，要保持适宜的温度和环境，让它们尽情享受这个过程。
就要进行转化了。
这一步就像是给这些细胞送去了新玩具，兴奋得不得了。
把细胞和DNA一起放到农杆菌中，轻轻搅拌，别太猛，怕把小家伙们给搅晕了。
静置一段时间后，它们就会开始接受这些新基因，像在参加一场欢迎会一样。
农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备
1、划平板，单克隆培养
2、挑单克隆于5ML LB培养基中，摇到饱和（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，15min
4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作
5、每100ul分装于冷冻管中，液氮速冻后，-70℃保存
农杆菌转化
1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min
2．37℃热激5min
3. 加1mlLB，28℃培养3-4h
3. 8000rpm/min去上清，200ulLB悬浮，涂板吹干
农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载体抗性。
（GV3101）
庆大霉素40mg/ml （0.4g/10ml）；利福平50mg/ml DMSO溶解
200ml LB + 200ul母液
农杆菌转植物
1.植物去顶三天后转化，转前一天交足水
2.摇菌OD600=1.2~1.6 （先小摇后，取200ul大摇200ml）
3.室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中（200ml/转化）
每1000ml渗透培养基：1/2 MS 2.42g；蔗糖50g；MES 0.5g；用1M KOH调PH到5.8/5.7，定容到1000ml，加10ul 1mg/ml6-BA，加200ul silwet l-7，混匀，将菌液悬浮，OD=0.8左右。
不得低于0.7.
4.将菌液倒入大平皿中，植株浸泡20s盖上白盆，过夜后揭开正常培养。
农杆菌感受态制备
-可编辑修改-
。
THANKS !!!
致力为企业和个人提供合同协议，策划案计划书，学习课件等等 打造全网一站式需求
欢迎您的下载，资料仅供参考
-可编辑修改-
。
版本一 1.1 农杆菌感受态细胞的制备 1.1.1. 取-70℃保存的 EHA105 于含 50μg/ml 链霉素平板划线，28℃培养。 1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM 液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养 12-16 hr。 1.1.3. 取 2ml 菌液转接于 100ml YM 液体培养基中，28℃220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。 1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心 5min,去上清液。 1.1.5. 加入 10ml 预冷的 0.1M 的 CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置 20min。4℃5000rpm 离心 5min，去上清。 1.1.6. 加入 4ml 预冷的含 15%甘油的 0.1M 的 CaCl2 溶液，轻轻悬浮。 1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌 Eppendorf 管中，每管 200μl 冻存于-70℃。 1.2. 双元载体转化农杆菌 EHA105 取 1μg 左右的质粒 DNA 加入到 200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴 30min，-70℃放 置 10min 。再在 37℃水浴 5min 或 42℃水浴 1min，接着冰浴 2min，加入 800mlYM 液体培养 基 28℃，175rpm 摇培 3hr 后涂在含 50μg/ml Kanamycin 的 YM 平板上。28℃培养到形成单 菌落。 其中 YM 可以用 LB 代替 ，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。 版本二 普通农杆菌感受态制备与转化： 1. 挑单菌落于 2ml YEP 培养基（含 Rif20mg/ml）中 28℃过夜活化。 2. 取 2ml 过夜菌液接种于 50ml YEP 培养基中 28℃生长至 OD600 约等于 0.5 左右（4hr）。 3. 5k rpm 离心 5 分钟。 4. 在 10ml 0.15M NaCl 中悬浮细胞。 5. 5 krpm 离心 5 分钟，悬浮细胞于 20ml 冰预冷的 CaCl2。 如不是马上使用，可以将之按 200ul 分装储存于-80℃待用。 6. 加 1ug DNA 于 200ul 感受态细胞中，冰上放置 30 分钟。 7. 液氮中冷冻 1 分钟。 8. 37℃水浴溶化细胞。 9. 加 1ml YEP 培养基，28℃摇床培养 2-4hr（低速）。 10. 离心 1 分钟，悬浮细胞在 100ul YEP 培养基中。 11. 涂板，28℃培养 2-3 天。
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤
一、目的及要求了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
二、实验原理在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。
三、实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/ml0.15 N NaCl，高压灭菌。
20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；3. 5000rpm, 离心5min；4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。
农杆菌感受态细胞的制备
农杆菌感受态细胞的制备实验一农杆菌感受态细胞的制备［目的及要求］了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
［实验原理］在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl 2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。
［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。
利福平（Rif）储液：50mg/ml20mM CaCl2，高压灭菌。
［实验步骤］1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；4、加入1000μl 20mM CaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；25、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500μl预冷的20mMCaCl，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃2保存备用。
农杆菌感受态细胞的制备与转化
实验五、农杆菌感受态细胞的制备与转化
01
实验目的：学习农杆菌感受态细胞的制备和转化原理。
02
实验要求：掌握农杆菌的特点及真核表达载体结构及应用。
03
技术应用：高等植物（双子叶植物或单子叶植物）转 基因鉴定基因功能 ，包括过表达（诱导型或组成型），RNAi等。
04
试剂： YEB液体培养基（液体和固体），Kan（卡那霉素），Rif（利福平）； CaCl2(预冷)；NaCl；50%无菌甘油 。
02
实验材料： 农杆菌GV3101菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300
01
农杆菌简介： 第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的。
01
菌种：根癌农杆菌和发根农杆菌，二者均属革兰氏阴性菌，对双子叶植物侵染广泛，在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
02
实验原理：
双元表达载体系统主要包括两个部分：
2.双元表达载体系统
双元表达载体
双元表达载体中Ti质粒pCAMBIA1300 的结构
1
2
3
4
5
农杆菌感受态细胞的制备流程
将10l构建好的质粒DNA加入200 l 农杆菌感受态细胞中，混匀；
01
冰浴30min，液氮迅速冷冻3-5min，37℃水浴无抗）YEB培养基，28℃振荡培养4h（选作）；
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如NPTII基因以及Lac Z基因等。 双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
农杆菌感受态的制备方法
农杆菌感受态细胞制备第一天晚至第三天晚： 1）取-80℃保存的GV3101于含50μg/ml 利福平的LB （千分之一的利福平）平板划线，28℃培养（一般要两天）。
注意：划线的时候要少沾一点原菌株，不必等到菌株融化就可轻轻沾一点，一定要少量，然后轻轻地划在板上。
挑得太多不容易长出单菌落，如果太用力也容易伤到菌株。
第三天下午或晚： 2) 挑取单菌落接种于灭菌的50ml 新管子加10ml 50μg/ml （千分之一）利福平的LB 液体培养基中，200rpm 28℃振荡培养12-16 hr （过夜可以）。
注意：管子最好用灭菌过的报纸包一下，摇菌时。
第四天早： 3) 取1-2ml （按1:50或者1:100的比例）菌液转接于含有50μg/ml （千分之一）利福平的100ml LB 液体培养基中（用500 ml 的三角瓶来摇菌28℃，200rpm 振荡培养至OD 600=0.5）。
注意：摇菌的过程可能需要3-4小时，要随时监控菌的浓度，可以平行的摇两瓶，其中一瓶用来测浓度，避免污染；并且为了保证检测菌液与未检测菌液的一致性，平行的两瓶菌液，最好来源于同一个50 ml 管子的菌液。
摇菌的过程中可以预先把NaCl 置于冰上预冷。
4) 转移菌液到新的灭过菌的50 ml 离心管中，冰上30min ； 5) 4℃，5000rpm 离心5min 。
6) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干，可以用预冷的NaCl 快速冲洗一遍。
7) 加入10ml 预冷的0.15M 的NaCl 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min 。
注意：要用5ml 枪调到3ml 挡，轻轻抽打。
8) 4℃，5000rpm 离心5min 。
9) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干。
10）加入2 ml 预冷的含15%甘油的20mM 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。
注意：要用1ml 枪轻轻抽打。
11）按200ul 的量分装到1.5 ml 无菌Eppendorf tube 中，液氮速冻，-80℃保存，一般不要存放超过2-3个月。
农杆菌感受态制备
版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70 C保存的EHA105于含50用/ml链霉素平板划线，28 C培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM液体培养基中，220rpm 28 C振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM 液体培养基中，28 C 220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCI2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min °4C 5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendof管中，每管200 M冻存于-70 C。
1.2.双元载体转化农杆菌 EHA105取1⑷左右的质粒 DNA加入到200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴30min , -70 C放置10min。
再在37 C水浴5min或42 C水浴1min，接着冰浴 2min，加入800mlYM 液体培养基 28 C, 175rpm 摇培3hr后涂在含50旧/ml Kanamycin 的YM平板上。
28 C培养到形成单菌落。
其中 YM 可以用LB代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCI2 0.01Tris-HCI （7.0）0.01 DTT ）替代。
版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml ）中28 C过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于 50ml YEP培养基中28 C生长至 OD600约等于0.5左右（4hr ）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCI 中悬浮细胞。
5. 5 krpm 离心5分钟，悬浮细胞于 20ml冰预冷的CaCI2。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
农杆菌感受态制备
Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
版本一？农杆菌感受态细胞的制备？℃保存的E H A105于含50μg/m l链霉素平板划线，28℃培养。
？℃振荡培养12-16h r。
？℃220r p m振荡培养至O D600=。
？
？
℃5000r p m离心5m i n，去上清。
？
？
℃。
？.双元载体转化农杆菌E H A105？取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。
再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml K a n a m y c i n的Y M平板上。
28℃培养到形成单菌落。
其中 YM 可以用LB 代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（（） DTT）替代。
版本二？
普通农杆菌感受态制备与转化：？
1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
？
2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于左右
（4hr）。
？
3. 5k rpm离心5分钟。
？
4. 在10ml NaCl中悬浮细胞。
？
5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
？
如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80℃待用。
？
6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。
？
7. 液氮中冷冻1分钟。
？
8. 37℃水浴溶化细胞。
？
9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。
？
10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。
？
11. 涂板，28℃培养2-3天。
版本三？
农杆菌感受态细胞的制备？
1.挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5ml LB液体培养基 (含50mg/L STR)中，28℃、200r/mim培养过夜。
？
2.取2ml培养物于LB液体培养基 (含50mg/L STR) 中继续培养，直至OD800 为左右。
？
3.将培养物置冰浴中30min，4℃、5000r/min、离心5min，弃去上清液。
？
4.用10ml冷的L NaCl悬浮菌液。
？
℃、5000r/min，离心5min，弃去上清液。
？
6.用1ml冷的CaCl2 (20mmol/L)悬浮，分装成50μl／管，液氮中冷冻后至-80℃保存。
？
农杆菌感受态细胞的制备：？
1.试剂配制：solution1 ： Rbcl 100mM？
50mM？
K-Acetate 30mM？
10mM？
Glycerol 15% 15ml，定容至100ml。
？
pH=，121度，高压灭菌30min。
？
solution2： Rbcl 10mM？
K-Acetate 10mM？
75mM？
Glycerol 15% 15ml，定容至100ml。
？
pH=，121度，高压灭菌30min。
？
2.农杆菌感受态细胞的培养：？
15-20ml无抗生素的LB培养基，用牙签挑取农杆菌放入小三角瓶中，28度120转震荡培养过夜。
（注意牙签和小三角瓶均需灭菌）？
3.制备感受态农杆菌：把已培养过夜的小三角瓶中的农杆菌分装到小离心管中，室温下，4，000g，离心10min。
弃去上清，每管加 solution1，用手指弹管底部，以使菌体悬浮。
冰上放置15mim-2h。
4度，4，000g，？
离心10min。
取出后放在冰上，弃去上清，每管加 solution2，用手指弹管底部，以使菌体悬浮，冰上放置15mim。
分装感受态农杆菌，每管可分装3-4管。
用液氮速冻后至-80℃冰箱中保存。
版本四？
1) 从新鲜YEP（5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，10g/L酵母浸出物，10g/L琼脂，50mg/L利福平，）平板上挑取农杆菌 LBA4404的单菌落，接种于5ml液体YEP 培养基（含50mg/L利福平）中，28℃ 200r/min振摇培养过夜。
？
2) 取1ml菌液接种于50ml液体YEP培养基（含50mg/L利福平）中扩大培养，28℃ 200r/min振摇培养至OD600为。
？
3) 冰浴30min，4℃ 5000r/min离心收集菌体，重悬浮于10ml L NaCl溶液中。
？
4) 再次4℃ 5000r/min离心收集菌体，重悬浮于1ml 20mmol/LCaCl2溶液中，按200µl/管分装。
制备好的感受态细胞若不立即使用，液氮速冻1min 后，放于-70℃冰箱保存，半年内使用。
版本五？
YEB培养基（用于农杆菌培养及感受态制备）？
蛋白冻（peptone） 5g/L？
蔗糖（sucrose） 5g/L？
牛肉膏（Beef extract） 1g/L？
酵母提取物（Yeast extract） 5g/L？
硫酸镁（MgSO47H2O） L？
固体培养基加%琼脂粉，高压灭菌。
？
农杆菌电击感受态制备？
方法一？
1、挑取单菌落于YEB振荡过夜28℃培养。
？
2、以1:200接种于400～500mlYEB培养基中（2000ml三角瓶中），摇菌至～，冰浴10min。
？
3、 2000g， 4℃离心10mi后弃上清，用预冷的10％甘油重悬沉淀。
？
4、 3000g，4℃离心10min弃上清，用回流甘油重悬沉淀后集中在一管中。
？
5、 3000g，4℃离心10min弃上清，用回流甘油重悬沉淀。
？
6、 50μl分装一管，－70℃保存。
？
方法二？
1、 O/N culture in 10ml of YEB/Rif 100+Str 100 at 28℃;？
2、1:100 dilution→grow till OD600=～,on ice 30 min;？
3、 Pellet at 6000rpm for 20min in precooled centrifuge, then resuspend with 1 Vol of precooled H2O;？
4、 Pellet at 6000rpm for 20min, then resuspend with Vol of precooled H2O;？
5、 Pellet at 6000rpm for 20min, then resuspend with 1/50 Vol of precooled 10% glycerol;？
6、 Pellet at 6000rpm for 20min, then resuspend with 1/500 Vol of precooled 10% glycerol;？
7、 Aliquot 80μl.？
农杆菌化学感受态制备？
1、挑取单菌落于YEB振荡过夜28℃培养；？
2、 1:50接种于50mlYEB培养基中200rpm28℃培养至OD600=；？
3、 5000rpm 4℃离心5min，弃上清后加入10ml预冷的 NaCl悬浮细胞；？
4、 5000rpm 4℃离心5min，弃上清后加入1ml预冷的20mM CaCl2悬浮细胞；？
5、每管200μl分装后－70℃保存或置冰浴中24小时内使用。