免疫亲和纯化和免疫沉淀
(完整版)免疫沉淀法原理及操作
免疫沉淀法是一种将蛋白质视为抗原，并利用抗体与之进行特异性结合的特性研究蛋白质间交互作用的生物技术。
这项技术可以从含有不同蛋白质的样品中，分离和浓缩出特定蛋白质，即纯化蛋白质，比如沈涛等在研究骨肉瘤细胞中ArgBP2的表达和定位中就用到这项技术来纯化ArgBP2蛋白。
其原理是在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于sepharose beads上的proteinA/G，与细胞中有目的蛋白结合，就形成一种免疫复合物，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。
然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。
免疫沉淀的操作过程主要分三个阶段：第一步是制备抗原溶液，任何抗原溶液均可作为免疫沉淀的材料来源，一般采用细胞或组织制备的裂解物；第二阶段是对裂解物进行预处理，免疫沉淀要求抗原的纯度尽可能高，用不与待检抗原结合的非特异性抗体预处理，可以从抗原溶液中除去非特异性结合蛋白；最后阶段是免疫复合物的形成与纯化，即在预处理过后的裂解物中加入特异性抗体形成免疫复合物，然后将免疫复合物经蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖或聚丙烯酰胺微珠等固相基质进行纯化。
蛋白A和蛋白G对抗体的Fc段有较高的亲和力。
蛋白A/G与抗体结合后，通过洗涤微珠即可除去未结合的蛋白，剩下与基质结合的即是纯化的抗原抗体复合物。
具体步骤可以如下进行：（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000r/min离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μｇ相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 r/min速度离心 5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μｌ的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
蛋白质谱解析互作蛋白样本：从样本到结果的全面分析
蛋白质谱解析互作蛋白样本：从样本到结果的全面分析在生物制药领域，蛋白质相互作用是许多生物过程的基础，也是药物研发中的重要环节。
为了深入了解互作蛋白质的功能和调控机制，科学家们采用蛋白质谱解析技术，这是一种强大的工具，可以帮助我们全面分析互作蛋白样本，从而推动生物制药领域的发展。
图1。
1. 互作蛋白样本的重要性。
互作蛋白质参与调节细胞内的生物学过程，包括信号转导、代谢调控和基因表达等。
了解互作蛋白样本的组成和结构对于揭示生物学过程的分子机制至关重要。
这些样本可能包含数百至数千个蛋白质，而且它们之间的相互作用复杂多样，需要高效准确的分析方法。
2. 样本制备：关键的第一步。
样本制备是互作蛋白质谱鉴定的关键步骤。
有效的样本制备可以降低假阳性结果的产生，并增加蛋白质的检测率。
常用的样本制备方法包括免疫沉淀、亲和纯化和交叉链接等技术。
在样本制备过程中，需要注意对蛋白质的合适保护，防止样本中蛋白质的降解和损伤。
3. 质谱分析：揭示蛋白质相互作用的关键。
蛋白质质谱是解析互作蛋白样本的主要方法。
其中，质谱仪是核心设备，能够将样本中的蛋白质分离并进行精准的质量测量。
常用的质谱方法包括质谱-质谱（MS/MS）技术，它可以通过分析碎片离子来识别蛋白质的氨基酸序列，从而推断蛋白质的结构和功能。
近年来，高分辨率质谱技术的发展极大提高了蛋白质鉴定的准确性和灵敏度。
4. 数据分析：从海量数据中获取有价值信息。
蛋白质谱鉴定产生的数据庞大且复杂，需要进行精细的数据分析。
这一步骤涉及数据库搜索、定量分析和功能注释等多个方面。
通过将鉴定的蛋白质与数据库中已知蛋白质进行比对，可以快速确定样本中蛋白质的身份。
进一步，通过蛋白质定量分析，可以评估不同样本之间蛋白质的表达差异，发现可能的生物标志物。
此外，功能注释可以帮助我们理解蛋白质在细胞中的作用和相互作用网络。
5. 互作蛋白质谱在生物制药领域的应用。
互作蛋白质谱在生物制药领域具有广泛的应用。
免疫共沉淀和免疫沉淀
免疫共沉淀和免疫沉淀
“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的结合蛋白，进行小规模的蛋白质亲和纯化的实验。
将蛋白通过微珠（纯化介质）进行富集。
免疫沉淀根据检测的目的可以分为免疫沉淀、免疫共沉淀(Co-IP)、染色质免疫沉淀(ChIP)和RNA免疫沉淀(RIP)。
免疫共沉淀分析(Co-IP)是免疫沉淀的延伸，基本的技术都是采用目标抗原特异性的固相化抗体；但IP的目标是纯化单一抗原，而Co-IP旨在分离抗原及与抗原结合的蛋白质或配体，主要用于蛋白-蛋白相互作用检测。
如果样品溶液中存在与靶蛋白相互作用的目的蛋白,也会被一同捕获及纯化得到,通过SDS-PAGE、Western 和质谱等方法鉴定与靶蛋白结合的蛋白。
染色质免疫沉淀(ChIP)用于鉴定基因组中与靶蛋白(如转录
因子和组蛋白)结合的区域。
将蛋白质与DNA暂时交联固定并剪切DNA,目标蛋白与核酸序列一起被沉淀后通过高通量测序、Southern和PCR等方法进行DNA鉴定。
确定与靶蛋白结合的DNA 片段。
RNA免疫沉淀(RIP)原理与ChIP相似,与靶蛋白结合的RNA被沉淀后,用高通量测序、RT-PCR或Northern等方法对沉淀进行RNA 鉴定。
随着技术的发展,目前磁性微粒已经取代琼脂糖成为免疫沉
淀的首选方法,由于磁性微粒明显小于琼脂糖,因此可以与更多的抗体结合,纯化是可以使用磁力架进行,避免了离心分离可能导致的抗原-抗体结合的破坏,避免了检测目的的损失。
上述各种免疫沉淀的异同总结如下:。
免疫分离方法
免疫分离方法
免疫分离方法是一种利用抗体与特定抗原结合的原理，从混合物中分离出所需物质的技术。
这种方法在生物医学研究、临床诊断、生物制药等领域得到广泛应用。
以下是一些常见的免疫分离方法：
●免疫沉淀：免疫沉淀是通过抗体与抗原结合，形成抗原-抗体复合物，然后利用沉淀剂
（如蛋白A/G琼脂糖、蛋白G磁珠等）将复合物沉淀下来，从而实现对目标蛋白或细胞的分离。
●免疫层析：免疫层析是利用抗体与抗原结合后，将混合物通过一个具有特定抗体的柱
子，从而分离目标物质。
这可以是亲和层析、离心层析等不同形式。
●免疫电泳：免疫电泳结合了免疫技术和电泳技术，通过电场作用，将抗原-抗体复合物
沿着电泳方向迁移，实现目标物质的分离。
●流式细胞术：流式细胞术利用荧光标记的抗体与细胞表面的抗原结合，通过流式细胞
仪分析和分选细胞。
这种方法常用于分离不同细胞亚群，以及分析表面标记的蛋白表达。
●ELISA（酶联免疫吸附测定法）：ELISA是一种通过固定在固体表面的抗原，然后使用酶
标记的抗体来检测特定抗体或抗原的方法。
ELISA可以用于分离和检测溶液中的蛋白质。
●磁珠免疫分离：利用抗体修饰的磁珠，使其能够特异性地结合目标抗原或细胞，然后
通过外加磁场将目标物质从混合物中分离出来。
这些免疫分离方法在实验室和临床研究中都发挥着重要的作用，有助于从复杂的生物样本中高效地提取和纯化特定的生物分子。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
免疫沉淀(IP)常见问题分析
根据推荐量使用抗体，并根据实验结果优化抗体的用量.
靶蛋白没有从珠子上洗脱下来
确定使用正确的洗脱液并保证洗脱液的强度和pH值是适用于靶蛋白的
抗体没有和免疫吸附的珠子结合
根据抗体的亚型确定所用珠子是否合适（参照IP的方法部分）
所用裂解缓冲液不适合
根据说明书确定该抗体检测的是变性还是天然蛋白；然后保证所用裂解液是恰当的（参照IP的方法部分）
在免疫沉淀过程中蛋白降解了
保证标本裂解时使用新鲜配制的蛋白抑制剂
抗体洗脱过多
靶蛋白中含有过多的洗脱抗体
降低抗体用量；在进行IP前将抗体交联到珠子上；使用梯度glycine缓冲洗脱液.
洗脱液中检测不到靶蛋白
标本中无靶蛋白表达，或者表达量非常低
根据蛋白表达资料确定检测标本中有靶蛋白的表达。如果蛋白表达水平很低，可以考虑增加裂解物的用量，但这样会增加非特异性结合。因此建议在进行IP前先对裂解物进行预纯化
所用抗体纯度不够
使用亲和纯化的抗体，有限预吸附过的抗体
抗体用量过多导致非特异性结合
确认推荐的抗体用量，减少抗体用量
细胞数过多/裂解物中蛋白含量过高导致洗脱液中含有大量非特异性蛋白
减少细胞/裂解物用量，推荐使用10-500ug细胞裂解物
非特异性蛋白结合抗体
减少上样量。也可以在进行IP前将裂解物和珠子预孵育从而达到预纯化裂解物的目的。也有人使用和抗体来源及Ig亚型相同的无关抗体对裂解物进行预纯化
问题
可能原因解决办法高景吸取了不溶于去污剂中的蛋白（沉淀）
离心后立刻吸取上清，如果发生了重悬，则需要再次离心
洗涤不完全
在洗涤过程中将试管盖好盖子，倒转混匀几次保证洗涤充分后再离心
免疫沉淀（IP）技术
免疫沉淀（IP）技术展开全文免疫沉淀是利用固定在磁珠等固相支持物上的特异性抗体对抗原的小型亲和纯化的方法。
在对细胞裂解液分离蛋白的检测方法中，免疫沉淀技术的应用最为广泛。
什么是免疫沉淀技术（IP）？免疫沉淀是基于传统亲和纯化方法开发的，在含有目的抗原的细胞裂解液中加入特定的抗体以及Protein A-Beads （预先将Protein A 固定结合在磁珠上），根据抗原与抗体、Protein A与抗体的FC的特异性，形成“抗原-抗体-Protein A-Beads”复合物，清洗离心后去除溶液中未结合的杂蛋白，最终检测是否存在目的蛋白。
与传统的柱式亲和纯化相比，免疫沉淀的目标是仅分离足够用于Western Blot或其他检测方法检测的蛋白质。
通常可以将已处理和未处理的样品进行比较，从而评估目标蛋白的相对量。
在免疫沉淀实验中，用于检测的抗体可以是预固定的，或者是游离的。
通常，预固定抗体法更适用于IP，但是，当目标蛋白浓度较低、抗体与抗原的结合亲和力较弱的情况下，可以使用游离的抗体形成免疫复合物，效果会比较好。
免疫沉淀固相物质的选择对于小型特定蛋白和蛋白复合物的分离，磁珠可实现结合能力、得率、可重复性、纯度和成本节约之间的平衡。
当进行手动和自动化标准IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和pull-down反应并立即用于后续检测分析时，磁珠是最佳选择。
利用强力磁力架可将磁珠定位到孵育管的侧壁，使其不阻碍细胞裂解物抽吸。
磁性分离不需要离心，所以不会导致抗体-抗原结合破坏和目标蛋白损失现象。
当需要纯化大量目标蛋白用于下游分析，且特异性抗体较易获得，琼脂糖树脂纯化较为适用。
表1:琼脂糖树脂和磁珠的比较对比指标琼脂糖树脂（Agarose Resin）磁珠（Magnetic Beads）结合能力多孔海绵状结构，表面积-体积比大，抗体结合率高磁珠直径小，表面光滑无孔，结合率偏低得率抗体在洗涤过程中易流失温和洗涤条件，抗体不易流失可重复性完全移除缓冲液可能破坏树脂磁珠可以完全吸附在分离管壁，不会被破坏纯度孵育时间较长，需要预纯化相互作用完全发生在磁珠外表面，不需预纯化操作性存在大量手动操作，时间长分离不需要离心，可同时操作多个样本免疫沉淀的类型最简单的免疫沉淀可用于分离单个蛋白（抗体的靶抗原）以研究其特性、结果、表达、活化或修饰状态。
免疫共沉淀中的igg
免疫共沉淀中的igg
免疫共沉淀是一种实验技术，用于寻找或证实蛋白质间的相互作用。
在免疫共沉淀实验中，IgG（免疫球蛋白G）通常被用作亲和纯化目标蛋白的抗体。
以下是免疫共沉淀中的IgG的一般流程和相关信息：
1.抗体选择：在免疫共沉淀中，通常会选择与目标蛋白相互作用的抗体。
这些抗体可以是单克隆或多克隆抗体，而它们所对应的IgG则是作为这些抗体的亚型。
2.交叉链接：在一些情况下，可以使用交叉链接剂将IgG抗体与其结合的蛋白质牢固地交联在一起。
这有助于稳定蛋白质复合物，并减少后续步骤中的失真。
3.免疫沉淀：抗体与细胞提取物中的目标蛋白相互作用后，使用适当的方法将抗体-蛋白质复合物与免疫磁珠或其他类型的支持物质结合，从而沉淀下来。
4.洗涤：沉淀的复合物经过多次洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质和其他细胞提取物中的污染物。
5.洗脱：使用适当的缓冲液或其他洗脱方法，将沉淀下来的蛋白质复合物从支持物质上洗脱下来。
6.分析：洗脱物可以用于进一步的分析，例如Western blot、质谱分析等，以确定共沉淀的蛋白质。
IgG在这个过程中充当了关键的角色，它通过特异性地结合目标蛋白，帮助将其从复杂的混合物中沉淀下来。
因此，研究员
在设计免疫共沉淀实验时需要仔细选择合适的IgG抗体，以确保高效、特异性的共沉淀过程。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
盐析沉淀法 是最古老而又经典的蛋白质纯化 分离技术。由于方法简便、有效、不损害蛋白 抗原活性等优点，至今仍被广泛原理
因为蛋白质是亲水性大分子，所以在水溶液中有双电 层结构的水合膜，来保证分子的溶解度平衡并稳定存在。 当加入盐时，盐会电离成离子态，离子的电性破坏了蛋白 质的双电层的水合膜结构，从而使其沉降，析出。
凝胶过滤(分子筛层析)图示1
凝胶过滤(分子筛层析)图示2
离子交换层析柱
亲和层析
是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子 间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。 例如抗 原和抗体（免疫亲和层析）、 酶和酶抑制剂（或配 体）、酶蛋白和辅酶、激素和受体等之间有一种特殊 的亲和力，在一定条件下，它们能紧密地结合成复合 物。如果将复合物的一方固定在不溶性载体或共价结 合在一种惰性的微珠上，则可从溶液中专一地分离和 提纯另一方。与上述其他纯化方法相比，亲和层析能 产生相当高的纯化作用。另外，此法的优点是迅速， 有时仅一步即可达到纯化的目的。
生物工程下游技术：一般包括产物（一般为蛋白质） 的预处理及分离纯化；产品的成型加工和质量监控等一 系列单元操作和过程中的主要技术,其中生化产物及发 酵产物的分离纯化是其核心内容。下游技术是生物工程 重要组成部分,是生物高科技技术实现产业化的关键， 如：酶工程 , 发酵工程等（提取干扰素、胰岛素和酶 等）。
免疫亲和纯化技术
亲和纯化(affinity purification)是基 于目标分子与固定化配体的特异性 相互作用(如：抗原-抗体)。亲和技 术可用来从混和物中分离特定分子。 捕获目标分子用于相互作用研究, 或 从反应体系中去除某一成分。
免疫亲和纯化原理
免疫亲和纯化是一种分离各种生物大分子最有效的方法
免疫亲和纯化和免疫沉淀技术
20010年4月
亲和层析及沉淀的用途
亲和层析及沉淀被认为是分离纯化酶及 蛋白质的强有力的技术手段，这种方法可 以较经济有效地使用配基，能够大规模、 快速、特异性地分离、纯化酶及蛋白质。
蛋白质的功能
蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能 的执行者，担负着生物催化、物质运输、运 动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功 能。
免疫亲和纯化的关键：高亲和力与容易洗脱的优 化组合。
常见错误是将低亲和力和容易洗脱等同看待。
蛋白质分离纯化
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混 合物之中分离纯化出所需要得到的目的蛋白质的 方法。蛋白质分离纯化技术是当代生物产业和生 命科学研究当中的核心技术。该技术难度和成本 均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游 蛋白质分离纯化当中。
生物工程上游技术:是理论的研究, 技术的开发等, 如：基因工程、蛋白质结构和功能研究等。
7、不能用于定量测定。
免疫亲和纯化技术发展历史：最早是将抗体作为一种结合剂 用于免疫亲和纯化，根据其自身交联产生大量多聚体和不 溶性基质原理收集抗原。随后利用抗体与惰性微珠共价结 合，虽然这是一种简单的结合，但抗体的许多反应性因缺 乏定位作用或抗体的过量结合而丧失。通过研究发现，抗 体与蛋白A和蛋白G微珠共价连接后更容易与抗原结合。将 具有良好抗原结合特性且来源广泛的各种单克隆抗体制成 免疫亲和层析柱，已成为一种最适用和有效的纯化方法。 亲和层析技术最先是由Cuatrecasas等人建立（1968年）。 BCX2003P2.PPT
影响免疫亲和层析纯化效果的因素
抗原初始相对浓度（即纯度）：是决定最终产物纯度 极为重要的因素。
抗原与抗体的亲和力：是免疫亲和纯化层析过程中最 麻烦的问题。高亲和力抗体（>10-8 mol/L)能在1 h以内 达到有效的分离，而低亲和力的抗体(﹤10-6 mol/L）即 使在高浓度时也不能结合溶液中的全部抗原。使用针 对同一抗原多个表位的多克隆抗体以增强亲和力的方 法固然可结合较多的抗原，但增加了洗脱的困难性。 只有当所需的最终产物为变性蛋白时，才选用识别多 个表位的抗体。
蛋白质分离纯化的意义
①从生物材料中分离制备蛋白质，研究其结构与功能，对 于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意 义。
②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需 要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦 芽糖、糊精以及糖浆等。
③ 医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。 ④ 基因工程的需要：DNA合成酶、RNA逆转录酶等。
加入浓酸和浓碱是不行的，苛性的环境将使蛋白质变性。
凝胶过滤和离子交换层析
凝胶过滤又称凝胶柱层析、分子筛层析，利用微孔凝 胶，将不同分子量的成分分离。离子交换层析是利用一 些带离子基团的纤维素或凝胶，吸附带相反电荷的蛋白 质，将蛋白质按带电荷不同或量的差异分成不同的组分。 这两种层析如能共同应用或者反复应用其中的一种，皆 可将某一蛋白质从一复杂的组分中纯化出来。
超速离心 是分离亚细胞及蛋白质大分子的有效手
段，往往是进一步纯化的第一次过筛。超速离心又分 差速离心和梯度离心。用超速离心或梯度离心分离和 纯化抗原只是一种根据蛋白的比重特点分离的方法， 除个别成分外，极难将某一抗原成分分离出来。目前 仅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲状腺球蛋 白等，以及一些比重较轻的抗原蛋白如载脂蛋白A、B 等。对于大量的中、小分子量蛋白质，多不适宜用超 速及梯度密度离心作为纯化手段。
特点： 1、高纯化率，通常为常规纯化的1,000-10,000倍以上。 2、由于内在的背景限制，如目标抗原量非常稀少，需与其他方法结 合才能获得均质性产物。 3、快速纯化抗原，层析柱常可重复使用。可按照不同规模进行，半 天内即可完成。 4、不仅适用于纯化抗原，也可用来分离经过初步纯化的抗体，乃至 所有能与相应配体有效结合的生物分子。 5、抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性，能大量分离天 然状态或近似天然状态的抗原。 6、需要适当纯化的抗体，不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析， 但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠 。