实验20植物组织中游离氨基酸总量的测定
实验：植物体内游离脯氨酸含量的测定
实验：植物体内游离脯氨酸含量的测定摘要：本实验采用比色法对植物体内游离脯氨酸含量进行了测定。
首先将草莓叶片样品经过水浴加热提取液体，然后通过硫酸和丙酮的共同作用使游离脯氨酸转化为紫色的脯氨酸-丙酮复合物。
测定复合物的吸光度，通过标准曲线得出样品中的游离脯氨酸含量。
实验结果表明，草莓叶片中的游离脯氨酸含量为3.87μg/g。
引言：脯氨酸是一种非常重要的代谢产物，在植物生长和逆境适应中都扮演着重要角色。
在逆境胁迫下，植物体内会产生大量的脯氨酸，起到保护细胞膜和抗氧化等作用。
因此，对植物中脯氨酸的含量进行准确测定具有重要意义。
材料与方法：实验材料：草莓叶片样品、95%的乙醇、2%的硫酸溶液、5%的丙酮溶液、比色管、恒温水浴、分光光度计实验步骤：1.称取0.2g新鲜草莓叶片样品，加入10ml 95%的乙醇，放入恒温水浴中，60℃水浴1小时。
2.将提取液过滤，取上清液转移到10ml量筒中，用96%的乙醇补至刻度。
3.取出2ml的标准液注入比色管中，分别加入0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml的氢氧化钠溶液，用96%的乙醇补至刻度，充分混合。
4.在每个标准管中加入0.5ml的2%硫酸溶液和1ml的5%丙酮溶液，立即迅速搅拌均匀。
5.将每个标准管与草莓叶片提取液比色管同时放置于25℃的水浴中，15min后，分别测定其吸光度。
结果与分析：标准曲线绘制如图1所示，其中R2为0.998。
测得草莓叶片提取液的吸光度为0.287。
从标准曲线上查得对应的游离脯氨酸含量为3.87μg/g。
绘制标准曲线：游离脯氨酸含量/μg/mL 吸光度0 020 0.139100 0.664结论：本实验采用比色法测定了草莓叶片中游离脯氨酸的含量为3.87μg/g。
该方法操作简便、准确性高，可用于多种植物样品中脯氨酸含量的测定。
植物游离氨基酸测试
植物游离氨基酸测试我和朋友在花园里闲逛，看着那些郁郁葱葱的植物，朋友突然问我：“你说这些植物里面有多少我们不知道的秘密呢？”我笑了笑，“那可多了，就像植物里的游离氨基酸，就很神秘。
”朋友一脸疑惑，“游离氨基酸？那是什么东西？”我心里一动，想着终于可以把我知道的分享出来了。
“我给你说啊，这游离氨基酸对植物可重要了。
它就像是植物的小助手。
我以前做过相关的研究，在测试植物游离氨基酸的时候，那过程可复杂了。
”我沉浸在回忆里，“我得小心翼翼地采集植物样本，就像对待宝贝一样。
因为一不注意，样本受到污染或者损坏，那测试结果就全错了。
”朋友好奇地问：“那采集完了呢？”我回答道：“采集完了就得赶紧带回实验室，我那时候心里可紧张了，就怕在路上出什么岔子。
”“到了实验室，我要使用各种仪器设备。
那些仪器都很精密，我每次操作都不敢有丝毫马虎。
”我一边说一边用手比划着操作仪器的样子。
“我当时就想着，这每一个步骤都关系着能不能准确知道植物里游离氨基酸的情况，就像我肩负着一个重大的使命。
”朋友似乎被我的情绪感染了，“那你这么努力，最后得到结果的时候肯定很有成就感吧？”我点了点头，“是啊，当看到那些数据出来，就感觉自己像是揭开了植物的一层神秘面纱。
知道了这些游离氨基酸的含量和种类，就可以进一步了解植物的生长状态，是健康还是缺乏营养之类的。
”“而且啊，”我越说越兴奋，“这对农业、园艺方面都有很大的意义。
比如说，要是发现植物里游离氨基酸不够，我们就可以想办法补充，让植物长得更好。
”朋友也露出了恍然大悟的表情，“原来这小小的游离氨基酸有这么大的作用啊。
”我看着花园里的植物，充满感情地说：“是啊，每一株植物都像是一个小世界，我们探索得越多，就越能发现大自然的神奇。
”。
植物生理实验讲解内容
植物生理实验讲解内容实验一植物组织水势的测定（小液流法）1、原理（1）水分移动的总原则：从高水势到低水势。
当把植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中，水势越大，越易失水；水势越小，越易得水；因此，会出现三种情况：植物组织的水势＜外液的水势，组织吸水，外液（a）浓度变大植物组织的水势＞外液的水势，组织失水，外液（b）浓度变小植物组织的水势＝外液的水势，组织既吸水又失水，外液（c）水分保持动态平衡（2）据比重大小判断小液流的移动方向：为判断以上三种情况，把侵有组织的溶液进行着色，当把着色的a、b、c三种外液用针管以小液流法放回对应的原溶液中，也出现三种情况：当浓度变大的外液（a）放入原溶液中↓，说明植物组织的水势＜外液的水势当浓度变小的外液（b）放入原溶液中↑，说明植物组织的水势＞外液的水势当水分保持动态平衡的外液（c）放入原溶液中≈（不动），说明植物组织的水势＝外液的水势2、材料：毛果含笑叶；梧桐树叶；丁香花或牵牛花4、方法（选用CaCl2溶液为外液）思考题1、试述小液流法测定植物组织水势的原理。
测定中应注意什么？（1）遵照两个原理：①水分移动的总原则—从高水势到低水势。
②根据比重大小判断小液流的移动方向。
（2）测定中应注意：①取材时尽量避开叶脉和伤口、部位要一致、要迅速（以免失水），材料要混匀；②母液要均匀，不能颠倒顺序；③放小液流时不能用力过大；④观察液流方向要细心等]。
2、某组实验出现了小液流法↓↑↑↓↑的情况，请分析出现错误的可能原因。
最有可能出错的应是第四支试管。
出错的原因有以下可能：(1)在配制甲组试管溶液时，试管没有充分的摇匀；(2)在配制甲组浓度梯度溶液时，第四支试管溶液不准确，浓度过低；(3)用注射器在甲组试管中挤出小液滴时，用力过猛。
3、测定水势的方法有：小液流法；电导仪法；折射仪法。
实验二植物组织中游离氨基酸总量的测定——茚三酮显色法1.原理氨基酸(蛋白质)的游离-NH3可与水合茚三酮反应，生成蓝紫色的化合物；在一定范围内，颜色的深浅与游离氨基的含量成正比，因此，可用分光光度法测定其含量。
实验植物组织游离氨基酸总量测定柯上网材料
缩合生成Ruhemans紫。
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共热、微酸性
《植物生理生化实验A》
福建农林大学
24％
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《植物生理生化实验A》
仪器设备：
分光光度计； 电子天平； 恒温水浴；100ml容量瓶； 玻璃研钵；移液枪；20ml具塞刻度试管; 普通试管；三角 瓶；玻璃漏斗等。
谢等有一定意义 。
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测定意义：
《植物生理生化实验A》
作作作为为为福营施逆建农养肥境林品的生大学质生理的理指指指标标标 。。。。。。？
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目的要求：
《植物生理生化实验A》
1、了解植物体内氨基酸测定的意义； 2、了解氨基酸测定的方法； 34、、其掌进操握一茚步作三熟要酮练点分试;剂光显福光色建度法农计测林的定大游使学离用氨方基法酸。总量的基本原理及 5、比较不同萌发程度的水稻种子游离氨基酸总量的差异。
2．标准曲线的绘制及样品测定： 取10支20mL刻度试管，按下表进行操作。
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《植物生理生化实验A》
实验步骤：
表1 游离氨基酸标准曲线制作及样品测定
试管
试
编号
剂 (毫升)
样品提取液
标准氨基酸溶液 （5μg/ml）
无氨蒸馏水(ml)
水合茚三酮(ml) 0.1%抗坏血酸(ml)
什么要加入抗坏血酸溶液？
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《植物生理生化实验A》
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游离a-氨基酸含量的测定
• 目的与要求
• 实验的重点和难点
• 仪器和试剂 • 基本操作 • 实验原理 • 实验内容 •数据记录和处理 • 思考题
•注意事项
实验目的与要求
1、了解分光光度法测定游离氨基酸的原理与方法； 2、掌握分光光度计的使用。
重点和难点
分光光度计的使用与标准曲线的制作
仪器和试剂
抗坏血酸（滴）
氨基氮ug/管 吸光度
4
0
4
12.5
4
25.0
4
37.5
4Байду номын сангаас
50.0
4
62.5
摇匀后，将上述6支比色管置于80℃水浴槽加热
15分钟后用冷水冷却，再用缓冲液定容至25mL，摇匀。
3、样品含量的测定
从8号比色管移取1.00mL溶液于9号25mL比色
管，在分别加入3.00mL缓冲溶液、2.00mL茚三酮 溶液和4滴抗坏血酸，摇匀后置于80℃水浴槽加热 15分钟后用冷水冷却，再用缓冲液定容至25mL， 摇匀。以1号比色管溶液为参比液测出样品的吸光
实验内容
1、样品中游离a－氨基酸的提取： 称1.0g剪碎的新鲜蘑菇放入研钵中，加入2mL
蒸馏水，研磨成匀浆，再转入7号25mL比色管，然
后用6mL蒸馏水分三次洗涤研钵，分别转入7号比色 管，再置于80℃水浴槽加热10分钟后用冷水冷却，
再用蒸馏定容至25mL。摇匀后，过滤，将滤液置于
8号比色管以备用。
2、标准曲线制作： 在6支比色管中，按下表顺序与用量加入试剂：
比色管号 V标/mL V缓/mL V茚/mL 1 0 3.00 2.00 2 0.50 2.50 2.00 3 0.10 2.00 2.00 4 1.50 2.00 2.00 5 2.00 2.00 2.00 6 2.50 2.00 2.00
植物体内游离脯氨酸含量的测定
3
仪器与试剂：
1、实验试剂：
３%磺基水杨酸，甲苯，冰醋酸，人造沸石， 酸性茚三酮试剂（25g茚三酮溶于60ml冰醋酸和40ml 6mol/L磷酸中,加热（70℃）溶解。常温保存期24h，冰箱中保存 48h）， 标准脯氨酸溶液（10mg脯氨酸溶于100ml80％乙醇中，浓度 为100ug/ml）
材料在第一片新叶完全展开后分为两组，第一组作为对 照,继续浇灌1/2Hoagland溶液；第二组为NaCl处理组，浇灌 含0.8%NaCl的1/2Hoagland溶液;继续培养三天后，取地上部 分以备实0、0.5、1.0、5、10、20μg/ml 一系列浓度的标准溶液。取标准溶液各2ml，加入2ml３%磺 基水杨酸、１ml冰醋酸和３ml茚三酮试剂于加塞试管中，充 分混匀后在沸水浴中加热显色40min，冷却后加入４ml甲苯 盖好盖子充分震荡，待其静置分层后，吸取红色甲苯相，于 波长520nm测定OD值，以OD值为纵坐标，脯氨酸浓度 （ μg/ml ）为横坐标绘制标准曲线。
２、实验仪器：
天平，研钵，移液管，水浴锅，离心机，试管，722型分光 光度计
4
实验步骤：
1、准备实验材料
提前7-10天培养小麦材料并根据实验目的对其分组处理， 以备后用。
小麦种子黑暗中25℃下用蒸馏水浸泡24h,使其充分吸涨， 然后将吸涨的种子置于培养皿中黑暗25℃下萌发48h。将萌发 一致的种子播种于培养皿中,用1/2的Hoagland营养液培养.
6
3、NaCl胁迫对小麦脯氨酸含量的影响
分别取对照和ＮaCl处理的小麦幼苗的地上部分（芽鞘 和叶子）0.3g，用３%磺基水杨酸５ml研磨提取，匀浆移 至试管中，在沸水浴中提取10分钟，加入0.5g人造沸石充 分震荡，冷却后转移至离心管中，3000r/min离心10min， 取上清液待测。
常用作物生理指标测定方法
SOD,POD,CAT,MDA,可溶性蛋白用同一提取液。
磷酸缓冲液配制：A液（Na2HPO40.2M）:Na2HPO4.2H2O=35.61g(或Na2HPO4.12H2O=71.64g)定容1000MLB液（NaH2PO4 0.2M）:NaH2PO4.H2O=27.6g(或NaH2PO4.2H2O=31.21g)定容到1000ml130mmol/l甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml0.75mmol/l氮蓝四唑（NBT）溶液：称0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存0.1mmol/LEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml0.02mmol/l核黄素溶液：取0.00753g核黄素定容至1000ml避光保存反应液组成水：磷酸：Met：NBT：EDTA-Na2：FD=5：30：6：6：6：6150ml反应液的组成是水12.7ml+磷酸（0.05M，PH=7.8）76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA=Na215.25ml+FD15.25mlSOD：称取0.2g鲜样，加1ml磷酸缓冲液（0.05mol/L PH=7.8），冰浴研磨，研磨后再加入1ml缓冲液倒入离心管定容，平衡后低温（0-4℃）10000rpm离心后10min冷藏保存。
取相同型号的试管，加入50μl上清液（2支对照管加缓冲液），分别加3ml反应液（），其中一支对照放于暗处，其余在4000lux下反应20-30min（温度高时时间短，温度低时时间长）后再560nm下进行比色。
计算公式：SOD总活性（units.g-1FW）=(Ack-A)*V/Ack*0.5*W*a(V酶液总体积2ml，w样品重=0.2g，a测定是的酶液体积=0.05ml)POD：取上清液20μl加入比色杯中（对照加磷酸），加3ml反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每个1min读1次（读0，1，2，3min）的OD值。
植物体内游离脯氨酸含量的测定
目的意义植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。
因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。
本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。
一、酸性茚三酮法（一）原理植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。
该产物在515nm 有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。
因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。
除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。
（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。
2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。
3. 试剂：（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。
现用现配。
（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。
（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。
（三）操作步骤1. 标准曲线制作：（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。
（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。
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实验20植物组织中游离氨基酸总量的测定
茚三酮显色法氨基酸是组成蛋白质的基本单位也是蛋白质的分解产物。
植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输。
所以测定植物组织中不同时期、不同部位游离氨基酸的含量对于研究根系生理、氮素代谢有一定意义。
一、原理氨基酸与茚三酮共热时能定量地生成二酮茚胺。
该产物显示蓝紫色称为Ruhemans 紫。
其吸收峰在570 nm 而且在一定范围内吸光度与氨基酸浓度成正比。
氨基酸与茚三酮的反应分两步进行第一步氨基酸被氧化形成CO 2 、NH 3 和醛茚三酮被还原成还原型茚三酮第二步所形成的还原型茚
三酮与另一个茚三酮分子和一分子氨脱水缩合生成二酮茚–二酮茚胺Ruhemans 紫反应式如下在一定范围内反应体系颜色的深浅与游离氨基的含量成正比因此可用分光光度法测定其含量。
二、实验材料、试剂与仪器设备一实验材料各种植物组织。
二试剂1. 水合茚三酮试剂称取0.6 g 再结晶的茚三酮置烧杯中加入15 mL 正丙醇搅拌使其溶解。
再加入30 mL 正丁醇及60 mL 乙二醇最后加入9 mL pH5.4 的乙酸–乙酸钠缓冲液混匀贮于棕色瓶置4 ℃下保存备用10 d 内有效。
2. 乙酸–乙酸钠缓冲液pH 5.4 称取乙酸钠54.4 g 加入100 mL 无氨蒸馏水在电炉上加热至沸使体积蒸发至60 mL 左右。
冷却后转入100 mL 容量瓶中加30 mL 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀
释至100 mL 。
3. 标准氨基酸称取80 ℃下烘干的亮氨酸46.8 mg 溶于少量10 异丙醇中用10 异丙醇定容至100 mL 。
取该溶液5 mL 用蒸馏水稀释至50 mL 即为含氨基氮5 μ g/mL 的标准氨基酸
溶液。
4. 0.1 抗坏血酸称取50 mg 抗坏血酸溶于50 mL 无氨蒸馏水中随配随用。
5. 10 乙酸。
三仪器设备分光光度计分析天平研钵容量瓶试管移液管水浴锅三角瓶漏斗。
三、实验步骤1. 样品制备取新鲜植物样品洗净、擦干并剪碎、混匀后迅速称取0.5 1.0 g 于研钵中加入5 mL 10 乙酸研磨匀浆后用蒸馏水稀释至100 mL 。
混匀并用干滤纸过滤到三角瓶中备用。
2. 制作标准曲线取6 支20 mL 刻度试管按表27 – 1 操作。
表27-1 制作游离氨基酸标准曲线各试剂量及操作程序试剂管号1 2 3 4 5 6 标准氨基酸mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无氨蒸馏水mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 水合茚三酮mL 3.0
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 抗坏血酸mL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 每管含氮量μ
g 0 1 2 3 4 5 加完试剂后混匀盖上大小合适的玻璃球置沸水中加热
15 min 取出后用冷水迅速冷却并不时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去当呈现蓝紫色时用60 乙醇定容至20 mL 。
混匀后用1 cm 光径比色皿在570 nm 波长下测定吸光度以吸光度为纵
坐标以含氮量为横坐标绘制标准曲线。
3. 样品测定吸取样品滤液1.0 mL 放入20 mL 干燥试管中加无氨蒸馏水1.0 mL 其他步骤与
制作标准曲线相同。
根据样品吸光度在标准曲线上查得含氮量。
四、结果计算按下式计算样品中氨基态氮的含量。
式中C ——从标准曲线上查得的氨基态氮含量μg 。
V T ——样品稀释总体积mL 。
V S ——测定时样品体积mL 。
W ——样品鲜重g 。
思考题1. 茚三酮与所有氨基酸的反应产物颜色都相同吗为什么2. 抗坏血酸在测定中的作用是什么【附注】1. 茚三酮重结晶的方法合格的茚
三酮应该是微黄色结晶若保管不当颜色加深或变成微红色必须重结晶后方可使用。
其方法如下5 g 茚三酮溶于15 mL 热蒸馏水中加入0.25 g 活性炭轻轻摇动溶液太稠时可适量加水30 min 后用滤纸过滤滤液置冰箱中过夜后即可见微黄色结晶析出用干滤纸过滤再用1 mL 蒸馏水洗结晶一次置于干燥器中干燥后贮于棕色瓶中。
2. 茚三酮与氨基酸反应所生成的Ruhemans 紫在1 h 内保持稳定故稀释后尽快比色。
3. 空气中的氧干扰显色反应的第一步。
以抗坏血酸为还原剂可提高反应的灵敏度并使颜色稳定。
但由于抗坏血酸也可与茚三酮反应使溶液颜色过深故应严格掌握加入抗坏血酸的量。
4. 反应温度影响显色稳定性超过80 ℃溶液易褪色可在80 ℃水浴中加热并适当延长反应时间效果良好。
5. 谷物籽粒等含蛋白质的样品可用酸水解法将蛋白质水解后用本法测定水解液中的氨基酸含量可计算出样品蛋白质含量。