干细胞提取和分离方法总结
一种胚胎干细胞的提取和分离方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910873703.8(22)申请日 2019.09.17(71)申请人 广州北斗生物科技有限公司地址 510700 广东省广州市黄埔区瑞和路39号G1座224至226、G2座224至226号(72)发明人 朱瑜 (51)Int.Cl.C12N 5/0735(2010.01)C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种胚胎干细胞的提取和分离方法(57)摘要本发明公开了一种胚胎干细胞的提取和分离方法，包括如下步骤：S1、切除哺乳动物的卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床；S2、发育4-6天后，由子宫冲取胚泡进行培养，结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；S3、ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代，获得胚胎干细胞样集落。
本发明采用组织培养法提取和分离胚胎干细胞，通过将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落，解决了现有的胚胎干细胞分离方法难度高，容易损伤细胞，影响胚胎干细胞分离的问题。
权利要求书1页 说明书3页CN 112522182 A 2021.03.19C N 112522182A1.一种胚胎干细胞的提取和分离方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、切除哺乳动物的卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床；S2、发育4-6天后，由子宫冲取胚泡进行培养，结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；S3、ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代，获得胚胎干细胞样集落。
2.根据权利要求1所述的一种胚胎干细胞的提取和分离方法，其特征在于：所述步骤S1中取小鼠3-5天的囊胚。
干细胞提取和培养的实用技巧和建议
干细胞提取和培养的实用技巧和建议干细胞是一类具有自我更新和多分化潜能的特殊细胞，对于生命科学研究和医学应用具有重大意义。
干细胞的提取和培养是干细胞研究的基础工作，在实验室中有着重要的地位。
本文将给出一些关于干细胞提取和培养的实用技巧和建议，希望能对正在进行相关研究的科研工作者有所帮助。
一、干细胞提取的技巧和建议1.选择合适的样本：干细胞的来源多种多样，可以从胚胎、成体组织以及体液等多个渠道获取。
在选择样本时，需要根据自己的研究方向和实验要求来确定合适的来源。
同时，注意样本的获取方式需要符合伦理规范，尽量避免伤害动物或人体。
2.有效的细胞分离方法：干细胞通常以混合细胞群的形式存在于样本中，为了提取纯度较高的干细胞，需要采用有效的细胞分离方法。
常见的方法包括流式细胞术、磁珠分离和显微操纵等，选择合适的方法可以提高细胞分离的效率和纯度。
3.培养条件的优化：提取到的干细胞需要在体外培养中继续生长和扩增，为此，需要针对不同类型的干细胞优化培养条件。
确保培养基的成分和浓度适宜，相应的生长因子和细胞因子能够为干细胞提供必要的生长和分化信号。
4.维持干细胞的干性特性：干细胞的一个特点是具有自我更新和多向分化的能力。
在培养过程中，需要采取一系列措施来维持干细胞的干性特性。
例如，添加适量的抑制剂，调整培养基中的成分，以及维持细胞接触的方式等。
二、干细胞培养的技巧和建议1.培养器具和环境的准备：在进行干细胞培养前，需要对培养器具和环境进行彻底的清洁和消毒。
确保培养皿、培养箱和其他实验室设备无菌，避免细菌和霉菌等污染对干细胞生长的影响。
2.细胞传代的控制：在干细胞的长期培养中，细胞传代是不可避免的。
然而，过多的细胞传代会导致细胞老化和凋亡，影响干细胞的生理状态和功能。
因此，需要控制细胞传代的次数，同时选择合适的传代方法，以保持干细胞的长期稳定生长。
3.培养基的配制和补充：培养基的成分和浓度对干细胞的生长和分化起着重要的作用。
脂肪干细胞的提取及鉴定
脂肪干细胞的提取及鉴定一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。
取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。
2、实验用品:2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
干细胞提取与分离技术的操作方法探讨
干细胞提取与分离技术的操作方法探讨干细胞是具有自我更新和分化为多种细胞类型能力的一类细胞。
它们具有广泛的研究和应用潜力，可以在组织工程、再生医学、药物筛选等领域发挥重要作用。
而要进行干细胞研究和应用，首先需要从不同来源进行提取和分离。
本文将探讨干细胞提取与分离技术的操作方法。
一、干细胞来源干细胞可以从多种来源提取，主要包括胚胎干细胞和成体干细胞。
1. 胚胎干细胞：胚胎干细胞通常来源于早期胚胎。
其提取方法需要从人类或动物胚胎中获取内细胞团，并通过培养和分化来产生干细胞系列。
胚胎干细胞具有全能性和自我更新的能力，但伦理和法律问题限制了其应用范围。
2. 成体干细胞：成体干细胞存在于成熟组织中，主要包括骨髓干细胞、脂肪干细胞、间充质干细胞等。
它们可以通过简单的操作从人体或动物体内提取，并进行培养和扩增。
成体干细胞具有较低的自我更新和分化能力，但其来源方便，成熟度高，不涉及伦理问题，因此在临床实践中具有更广泛的应用前景。
二、胚胎干细胞的提取与分离技术胚胎干细胞的提取与分离技术是在胚胎试管受精或核移植技术的基础上进行的。
下面将介绍其中两种常见的方法：1. 胚胎细胞团培养法：这是最常用的胚胎干细胞提取方法之一。
首先，从早期胚胎中取出内细胞团，然后在细胞培养基中进行培养和扩增。
在特定培养条件下，内细胞团中的干细胞逐渐分化和增殖，最终形成胚胎干细胞系列。
2. 核移植法：核移植法通过取出早期胚胎或体细胞核，将其注入到无核的胚胎干细胞中，形成合子。
随后，合子会在适当的培养条件下分裂和扩增，最终产生具有相同基因组的胚胎干细胞。
三、成体干细胞的提取与分离技术与胚胎干细胞相比，成体干细胞提取与分离技术更加便捷和成熟。
以下是两种常见的成体干细胞提取方法：1. 骨髓提取法：这是提取骨髓干细胞的最常用方法。
首先，从骨髓中采集样本，通常选择在骨盆或其他骨骼丰富的部位进行。
提取后的骨髓样本经过处理，将其中的骨髓间充质干细胞分离出来。
干细胞提取方法与技巧
干细胞提取方法与技巧干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，具有广泛的应用前景，被广泛研究和应用于生物医学领域。
为了有效地提取干细胞，研究人员发展了多种提取方法和技巧。
本文将介绍几种常用的干细胞提取方法及其相关技巧。
一、初级培养法初级培养法是一种常见的干细胞提取方法，适用于无需大量提取的情况。
该方法的步骤如下：1. 细胞准备：收集组织样品，将其分解为细胞悬液。
2. 培养基配制：根据所需提取的干细胞类型，选择适当的培养基并加入适量的细胞因子。
3. 细胞培养：将细胞悬液加入培养基中并进行培养，在适当的培养条件下促进干细胞分化与增殖。
4. 细胞分离：通过倒置显微镜观察，使用悬液中的细胞管控探测器将干细胞从其他细胞中分离出来。
5. 干细胞纯化：将分离出的干细胞用干细胞培养基培养并纯化，去除其他非干细胞杂质。
二、流式细胞术流式细胞术是一种常用的干细胞提取方法，利用细胞的免疫表型可以从复杂的细胞混合物中识别并分离干细胞。
其步骤如下：1. 细胞样品准备：提取组织样品并制备单细胞悬液。
2. 细胞标记：将单细胞悬液与特定的细胞表面标记物结合，可通过免疫磁珠或荧光标记等方法实现。
3. 流式细胞术分选：使用流式细胞术仪器进行细胞分选，根据标记物的不同发射光强度，将目标干细胞从混合物中分选出来。
4. 干细胞的检验与分离纯化：将目标干细胞从其他细胞中纯化出来，根据需要采取不同的分离纯化方法。
三、单细胞测序法单细胞测序法是一种快速有效的干细胞提取方法，可在单个细胞层面进行分析，帮助揭示不同类型干细胞的功能和特性。
其具体步骤如下：1. 单细胞捕获：通过微流控装置将单个细胞捕获和固定在特定位置。
2. 细胞裂解：采用细胞裂解酶对细胞进行裂解，释放出细胞内的RNA和DNA。
3. RNA/DNA扩增：使用逆转录酶和DNA聚合酶对捕获的RNA和DNA进行逆转录和扩增。
4. 测序准备：将扩增的RNA/DNA片段进行文库建立准备，包括文库构建、PCR扩增等步骤。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
干细胞的分离和应用
干细胞的分离和应用干细胞是一种特殊的细胞，它可以随时分化成各种类型的细胞，为人类带来了巨大的生物医学和临床应用前景。
干细胞分离和应用是干细胞研究的重要内容，也是实现干细胞临床应用的先决条件。
干细胞分离是干细胞研究的关键步骤之一。
目前，分离干细胞的主要方法有三种：手工选取法、细胞排序法和负选择法。
手工选取法是最古老的分离方法，指的是在显微镜下用手工选取干细胞。
由于这种方法受技术水平和操作难度的限制，所选取的细胞也存在很大的不确定性，因此已经逐渐淘汰。
细胞排序法是一种可行性较高的干细胞分离方法。
具体步骤是将干细胞和非干细胞按照表面标志分别染色，然后将细胞流在细胞排序仪中进行分离。
这种方法可以比较准确地筛选出干细胞，但仍然存在一定的误差和侵袭性。
负选择法是目前最有效的干细胞分离方法之一。
该方法采用反向分离的原理，通过去除非干细胞而获得干细胞。
由于这种方法不依赖于细胞的表面标志，因此通用性较高，分离效率也较高。
干细胞的应用领域非常广泛，可以涉及到人体的多个系统和器官。
例如，干细胞可以用于再生医学，通过干细胞的分化和增殖来修复或替代受损组织和器官。
这种应用目前已经在临床中得到验证，取得了显著的治疗效果。
此外，干细胞还可以用于药物筛选和工业化生产。
干细胞具有高度的可塑性和繁殖能力，可以大量生产基因和生物药物，为药物研发和生产提供了重要的技术手段。
综合而言，干细胞的分离和应用是干细胞研究的重要方向。
不断深入研究干细胞的分子机制和生理功能，以及探寻更加安全有效的干细胞分离和应用方法，将有望为人类带来更多诸如再生医学、药物研发和工业化生产等领域的巨大贡献。
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干细胞提取和分离方法总结
干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型能力的细胞，因其在再生医
学和疾病治疗方面的巨大潜力而备受关注。
干细胞的提取和分离是开展干细胞研究的关键步骤，本文将总结几种常用的干细胞提取和分离方法。
1. 胚胎干细胞提取和分离
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)具有广泛的分化潜能，可以分化为体
内所有的细胞类型。
目前，主要有两种方法用于胚胎干细胞的提取和分离：体外受精和体细胞核移植。
- 体外受精方法：该方法从捐赠人体内获取受精卵，通过体外培养获得兔囊胚，并将兔囊胚的内质体提取出来，形成胚胎干细胞系。
这种方法可以大规模获取胚胎干细胞，但受到伦理等因素的限制。
- 体细胞核移植方法：该方法通过将一个成体细胞的细胞核移植到一个空卵子中，得到克隆胚胎。
然后从克隆胚胎中提取胚胎干细胞。
这种方法可以避免使用受精卵，但技术难度较大且效率较低。
2. 间充质干细胞提取和分离
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)存在于骨髓、脐带血、脂肪组织
等多种组织中，具有自我更新和多向分化能力。
提取和分离间充质干细胞的方法主要有以下几种：
- 骨髓采集法：该方法通过穿刺骨髓髓腔，用针收集骨髓组织，然后经过干细
胞分离和纯化得到间充质干细胞。
这种方法具有高效、简便的优点，但操作有一定难度。
- 脐带血提取法：该方法通过脐带血采集脐带中的干细胞，经过干细胞分离和
纯化得到间充质干细胞。
相较于骨髓采集法，脐带血提取法更为简单和无创，但提取的间充质干细胞数量和质量较低。
3. 诱导多能干细胞提取和分离
诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是通过使用转录因子或化学物质将成熟的体细胞重新编程为干细胞的一种方法。
主要有两种方法用于诱导多能干细胞的提取和分离：细胞外基质和转录因子。
- 细胞外基质法：该方法在细胞培养基内添加适当的细胞外基质，提供合适的
生长环境，帮助细胞重新获得干细胞特性。
细胞外基质法相对较简单，但效果较差。
- 转录因子法：该方法通过转染细胞的DNA，引导细胞在特定条件下分化为干
细胞。
转录因子法的效果较好，但操作复杂且成本较高。
综合以上方法可以看出，不同类型的干细胞提取和分离方法各有优缺点。
胚胎
干细胞的提取和分离方法受到伦理等因素的限制，但具有较高的分化潜能；间充质干细胞提取和分离方法相对简便，但提取的干细胞数量和质量有限；诱导多能干细胞提取和分离方法为重编程经济、无伦理争议，但成本和操作复杂。
随着技术的不断发展，未来可能会出现更加高效和可行的干细胞提取和分离方法，进一步推动干细胞研究在再生医学领域的应用。