脐带间充质干细胞培养的研究进展-细胞生物学论文-生物学论文
间充质干细胞及其迁移的研究进展
临床医学研究与实践2021年2月第6卷第6期综述DOI :10.19347/ki.2096-1413.202106064基金项目：国家自然科学基金委员会资助项目（No.81903949）；浙江省基础公益研究计划项目（No.LQ19H290004）。
作者简介：戚亚钦（1999-），女，汉族，浙江绍兴人。
研究方向：临床医学。
*通讯作者：方燕，E -mail :fangyan@.间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs ）是具有自我更新能力并表现出多向分化潜能的成体非造血干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、外周血、脐带、胎儿组织、肌肉等中。
MSCs 具有来源丰富、获取方便、增殖率高等特点，已成为组织工程和临床研究的理想种子细胞[1]。
近年来，随着国内外对MSCS 的研究越来越深入，以MSCs 为基础的细胞移植替代治疗显现出良好的效果，MSCs 在临床试验中的安全性和有效性也已得到了更好的证明[2]。
1MSCs 的临床应用1.1MSCs 在神经系统疾病中的临床研究与应用目前，许多神经系统疾病如缺血、缺氧性脑病、恶性脑胶质瘤、神经系统退行性病变等仍无有效治疗方法，预后较差。
脑缺血后神经元的坏死将导致永久性神经功能缺陷，现有治疗手段尚不能逆转神经元和神经胶质细胞变性引起的神经功能障碍[3]。
MSCs 通过旁分泌作用，增加神经生长因子和脑源性神经营养因子的释放，促进神经障碍中丢失或损坏的神经元的恢复，减少神经元细胞的凋亡[4]。
MSCs 还可通过增加血管生成因子的分泌，促进病灶区新生血管生成；通过抑制血管内皮的凋亡和氧化应激，减少血管炎性损伤，增加脑血管的完整性[5]。
Xu 等[6]通过建立缺血缺氧性脑病的大鼠模型，证实MSCs 的脑内移植可减小脑梗塞体积，有效改善神经损伤，进而改善大鼠运动功能，为临床进一步研究提供实验依据。
但研究发现，缺血区局部不利的微环境使得能够迁移并存活在损伤区的MSCs 数量很少，严重限制了MSCs 的应用前景[7]。
脐带来源间充质干细胞的免疫抑制功能研究
前持评件耐觅 Drug Evaluation Research 第43卷第12期2020年12月• 2385 ・脐带来源间充质干细胞的免疫抑制功能研究杨 莹，李政楠，王秀娟，李 伟，牟春琳，金 星，徐永胜•天津长和生物技术有限公司，天津301925摘 要：目的观察人源脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对异体总淋巴细胞和不同淋巴细胞亚群增殖能力的影响，以及对 细胞因子分泌的影响。
方法分离并培养hUC-MSCs 及健康成人外周血淋巴细胞，以淋巴细胞为阴性对照，MTT 法检测共 培养(淋巴细胞：hUC-MSCs 为1：0.5、1 ： 1、1 ： 5、1 ： 10) 3 d 后淋巴细胞的增殖情况；流式细胞仪检测共培养体系中 CD4 CD25 FOXP3\ CD3 CD16* C D56\ CD4 CD45RA CCR7*的细胞比例；ELISA 法检测白细胞介素(IL) -2、IL-4、IL-10、 Y-干扰素(INF-?)细胞因子分泌情况。
结果 与阴性对照组比较，hUC-MSCs 对淋巴细胞的增殖具有显著抑制作用(P< 0.05),抑制效果随数量增加而增强；hUC-MSCs 能够显著增加共培养体系中CD4CD25FOXP3*细胞比例(PV0.05),显著 降低CD4*C D45RA'CCR7‘细胞比例(PV0.05),对CD3 CD16 CD56*细胞比例无显著影响；hUC-MSCs 能够显著降低IL-2、 IL-4、INF-y 水平，显著增加IL-10的分泌水平(P<0.05)。
结论hUC-MSCs 具有免疫抑制功能。
收稿日期：2020-09-11基金项目：国家重点研发计划"干细胞及转化研究"重点专项(2019YFA0112100)；天津市科技计划项目(17ZXXYSY00020)*通信作者：徐永胜 E-mail :***********************关键词：脐带间充质干细胞；淋巴细胞；免疫反应；细胞因子中图分类号：R329 文献标志码：A 文章编号：1674-6376 (2020) 12-2385-05DOI ： 10.7501/j.issn.l674-6376.2020.12.005Research on immunosuppressive function of umbilical cord mesenchymal stem cellsYANG Ying, LI Zhengnan, WANG Xiujuan, LI Wei, MU Chunlin, JIN Xing, XU Yongsheng Ever Union Biotechnology Company Limited, Tianjin 301925, ChinaAbstract: Objective To observe the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) on the proliferation of allogeneic total lymphocytes and different lymphocyte subsets, as well as the secretion of cytokines. Methods hUC-MSCs and peripheral blood lymphocytes of healthy adults were isolated and cultured; MTT method was used to detect the proliferation of lymphocytes by after co-culture for 3 days; the proportion of CD4+CD25 FOXP3 ., CD3 CD16 CD56* and CD4 CD45RA CCR7 in the co-culture system was detected by flow cytometry; ELISA was used to detect the secretion of IL-2, IL-4, IL-10 and INF-y. Results hUC-MSCs could significant inhibit the proliferation of T lymphocytes, and the anti-proliferative effect was enhanced with the increase of the number of lymphocytes; the proportion of CD4 CD25 FOXP3 cells in co-culture system was increased by hUC- MSCs (P < 0.05); the proportion of CD4TD45RA +CCR7+ cells showed a downward tendency, and the difference was statistically significant (P < 0.05); however, there was no significant difference in CD3 CD16 CD56+ cells. hUC-MSCs could reduce the levels of IL-2, IL-4 and INF-y, but increase the secretion level of IL-10, and the difference was statistically significant (P < 0.05). Conclusion HUC-MSCs had immunosuppressive function.Key words: umbilical cord mesenchymal stem cells; lymphocytes; immune response; cytokines间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs) 来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细 胞，因其具有多向分化潜能⑴、造血支持和促进干细 胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人 们的关注。
脐带来源的华通氏胶间充质干细胞的分离、特性及应用前景
233CARCINO GENESIS ，TERATO GENESIS &MUTA GENESIS脐带来源的华通氏胶间充质干细胞的分离、特性及应用前景丁赛，张红霞，朱海英*(海军军医大学基础医学院细胞生物学教研室，上海200433)收稿日期：2021-11-21；修订日期：2022-05-13基金项目：国家自然科学基金(32171387)作者信息：丁赛，E-mail ：。
*通信作者，朱海英，E-mail ：【摘要】间充质干细胞(MSCs)的来源非常广泛。
虽然各种组织来源的MSCs 生物学特性不尽相同，但在标准培养条件下该类细胞均可以贴壁生长；细胞群体中有95%以上的细胞表达典型的间充质标记分子，如CD73、CD90和CD105，但缺乏造血标记分子CD14、CD19、CD34、CD45和CD79a 的表达；特别是均具有分化为成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞的能力。
这些性质是国际细胞治疗协会给出的定义该类细胞的最低标准。
脐带间充质干细胞是指来源于新生儿脐带组织中的多能干细胞。
目前来看，从脐带不同解剖学部位(区室)获得的MSCs 的生物学性质也存在差异，其中从脐带华通氏胶中分离获得的华通氏胶间充质干细胞，在增殖能力、分化潜能、免疫调节能力等方面均明显优于其他区室来源的间充质干细胞，是用于组织器官损伤修复及免疫调节的一种理想的“种子”细胞，被认为具有更好的临床应用前景。
本文围绕近年来华通氏胶间充质干细胞的分离建系、增殖特性、分化潜能以及临床应用方面的研究进展进行了综述，其中重点介绍了化学诱导分化方案的建立和优化，认为与通过遗传改变诱导重编程方法相比，化学诱导分化方法具有更好的临床应用潜力。
【关键词】脐带；华通氏胶；间充质干细胞；分化潜能；分离；增殖特性中图分类号：R329.2+8文献标志码：A文章编号：1004-616X(2022)03-0233-04doi ：10.3969/j.issn.1004-616x.2022.03.011间充质干细胞最早在骨髓中被发现和鉴定，随后在人体胚胎及成体的多种组织中被陆续鉴定出来，这些组织主要包括成体骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带和脐带血等。
脐带间充质干细胞制备原理
脐带间充质干细胞制备原理一、概述脐带间充质干细胞（Wharton's jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）是一种来源于新生儿脐带的干细胞。
与其他来源的干细胞相比，WJ-MSCs具有易于获取、无伦理争议、低免疫原性和多向分化潜能等优点，因此在临床应用中具有广泛的前景。
本文将就WJ-MSCs制备原理进行详细介绍。
二、脐带间充质干细胞的来源脐带是连接胎盘和新生儿的管道，其中包含了丰富的干细胞资源。
在脐带中，除了血液造血干细胞外，还存在着一种特殊类型的干细胞——脐带间充质干细胞。
这种干细胞主要存在于脐带Wharton's jelly （WJ）中，与周围组织隔离。
三、WJ-MSCs制备方法1. 脐带获取制备WJ-MSCs首先需要获取新生儿脐带组织。
通常情况下，在新生儿出生后不久即可进行采集。
采集过程中需要注意消毒和无菌操作。
2. 分离WJ组织将采集到的脐带组织进行分离，去除血管和外层膜等部分，得到WJ组织。
WJ组织是一种透明的胶状物质，通常呈现出白色或浅黄色。
3. 制备单细胞悬液将WJ组织切成小块，并加入胶原酶等消化酶进行消化。
消化后，用PBS等缓冲液洗涤多次，最后制备成单细胞悬液。
4. 培养和扩增将制备好的单细胞悬液接种在干细胞培养基中，并放置于37℃、5% CO2的培养箱内进行培养和扩增。
在培养过程中需要定期更换培养基，并对干细胞进行观察和评估。
5. 鉴定和纯化经过一段时间的培养，可以通过流式细胞术等方法对干细胞进行鉴定和纯化。
通常情况下，WJ-MSCs表达CD73、CD90、CD105等特征性标志物，并且不表达CD34、CD45等血液细胞特征性标志物。
6. 冻存经过纯化和鉴定后，WJ-MSCs可以进行冻存。
在冻存过程中需要使用特殊的冻存液，并在低温下保存。
四、WJ-MSCs的应用前景WJ-MSCs具有广泛的应用前景。
目前已经有多项临床试验显示，WJ-MSCs可以用于治疗多种疾病，如心血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病等。
人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定
人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定王娟;陆琰;何冬梅;张洹【期刊名称】《暨南大学学报（自然科学与医学版）》【年(卷),期】2009(030)004【摘要】目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.【总页数】6页(P367-372)【作者】王娟;陆琰;何冬梅;张洹【作者单位】暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】Q813【相关文献】1.人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定 [J], 王玲玲;马峰;张玉成;杜珍武;张桂珍2.睾丸Leydig干细胞分离、纯化及鉴定的体外研究 [J], 肖斌;王晓云;周广东;周英晋;毕宏达;朱吉;张敬德;邢新3.大鼠雪旺细胞体外分离培养纯化及鉴定 [J], 张春燕;张自强;刘玉梅;邓雯;王玉琴4.猴头菌素分离纯化、结构鉴定及体外活性研究 [J], 何晋浙;樊鹏;孙培龙5.胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定 [J], 李云龙;郭欣;杨晓波;黄跃南因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
脐带间充质干细胞外泌体转运miR-21-5p促进子宫内膜间质细胞增殖的作用机制
• 1262 .医学研究生学报 2020 年 12 月第 33 卷第 12 期 J Med A»fgT O ，V 〇l.33, IMo.12, December，2020论 著(临束研究）脐带间充质干细胞外泌体转运miR -21-5P 促进子宫 内膜间质细胞増殖的作用机制吕承晓，段华，汪沙，甘露，徐倩[摘要]目的脐带间充质干细胞（DCMSC)已被证实通过其外泌体发挥加速损伤子宫内膜修复的作用，但其具体作用机制仍不明确。
文中旨在探索UCMSC 外泌体所携带的m iR -2l-5p 对于子宫内膜间质细胞增殖的影响.:，方法增殖期子宫 内膜标本取自2018年1月至6月首都医科大学附属北京妇产医院妇科微创中心，因宫颈上皮内瘤变I I I 级、子宫肌瘤等行开 腹或腹腔镜下全子宫切除的3例患者。
通过胶原酶消化法原代分离培养子宫内膜间质细胞并鉴定：采用差速离心法提取 UCMSC 外泌体并鉴定。
荧光定量P C R 检测UCMSC 外泌体及其处理后的子宫内膜间质细胞内的miK-21-5P 的表达水平后，并通过CCK8和E dU 染色检测抑制组(转染miR-21-5P inhibitor)、对照组（转染miR inhibitor N C )、空白组（未转染）子宫内膜间 质细胞的增殖活性。
此外，采用生物信息学分析预测外泌体miK-21-5p 在子宫内膜间质细胞内的潜在靶mRNA 及其所参与的 主要细胞生物学进程。
结果（：《8结果显示，24、48、72 11，抑制组的吸光度显著低于对照组和空白组#<0.01)。
£昍染色结果显示,转染后48 h 后，抑制组的外泌体增殖活性[(7.47±0.44)%]显著低于对照组和空白组[(13.47士0.47)%、（ 14.60± 1.08)%],差异有统计学意义(P <〇.〇l )。
通过G O 分析和KEGG 通路富集分析，发现miR-21-5P 的潜在靶基因参与2162种生物学进程（P <〇.〇5)、300种分子生物学功能（P <0.05)和214种细胞学组分（P <0.05)，并富集到3条细胞信号通路（P <0.05)， 推测miR-2丨-5P 可能通过这些途径促进外泌体增殖和损伤子宫内膜损伤修复。
不同培养基培养脐血间充质干细胞的比较
不同培养基培养脐血间充质干细胞的比较作者：王丽娟来源：《赤峰学院学报·自然科学版》 2011年第7期王丽娟（赤峰学院医学院，内蒙古赤峰 024000）摘要：比较不同密度下DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基培养脐血间充质干细胞的效果,发现应用IMDM培养基以2.0×106个细胞/ml的密度接种在培养瓶底可以完全铺层,而且加入碱性成纤维细胞因子可以显著加快脐血间充质干细胞的贴壁、伸展和铺层的速度.关键词：脐血间充质干细胞；培养基；生长过程中图分类号：R329 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2011）07-0037-02实验证明间充质干细胞（MSC）存在于身体的很多部位，骨髓和脐血是间充质干细胞的最主要来源.体外分离培养骨髓间充质干细胞已被广泛应用于各研究领域，而对人脐血中的MSC的研究尚处于起步阶段.在培养方面还没有统一的方法,培养的方案也各不相同.本试验分别应用DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基对脐血单个核细胞进行培养，比较不同细胞密度下各种培养基培养脐血MSC的效果，并对培养出的脐血MSC的生长过程进行了研究.1 材料和方法1.1 脐血新鲜脐血由赤峰学院附属医院提供.在征得产妇同意后，无菌条件下采集新生儿脐血，用肝素抗凝.1.2 脐血MSC的分离和培养取血后12h内,用Ficoll-Hypaque分离液分离单个核细(MNC),并用PBS培养液洗涤3次,然后分别用含20%的胎牛血清(杭州四季青)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的IMDM 完全培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的DMEM-LG培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的DMEM-HG培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的α-MEM培养基调整细胞密度，每种培养基各自调整的密度分别为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0×106/ml,种植于培养瓶中,然后于5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养.2 结果2.1 不同培养条件对脐血间充质干细胞的贴壁、生长的影响在使用同一批号血清的情况下，几种培养基培养脐血间充质干细胞的情况如下：DMEM-LG 培养基和DMEM－HG培养基有大量的细胞贴壁，但贴壁的细胞形状多样，有圆形、椭圆形、多角形等不规则形状，生长缓慢，随着培养天数的增加，贴壁的细胞都脱落下来.α-MEM培养基仅有少量的细胞贴壁，且贴壁的细胞是圆形或椭圆形，扁平的，几乎无生长，随着培养天数的增加，也都脱落下来.IMDM培养基培养出的细胞呈纤维状，形成克隆，并逐渐扩张.2.2 脐血间充质干细胞的最适接种密度细胞以不同密度接种于培养瓶中，并于倒置显微镜下进行观察.结果发现，在各个密度下，DMEM-LG培养基、DMEM－HG培养基和α-MEM培养基均没有完全铺层，20天后都脱落下来.而应用IMDE培养基，以0.6～0.9×106个细胞/ml的密度接种后，细胞贴壁稀疏甚至不贴,间距大,生长缓慢，随培养时间的延长,贴壁的细胞也都从瓶底脱落下来.以密度为2.0×106个细胞/ml接种时，细胞活性好，生长旺盛，形态为有规则的束状.密度在4×106/ml及其以上时，细胞生长拥挤，培养基消耗快，短时间内变黄，虽有大量细胞贴壁，但细胞贴壁不牢固.经过3次换液后，大部分贴壁细胞又都脱落下来.由此可见，最适合细胞贴壁的接种密度在2.0×106个细胞/ml左右.密度高于或低于2.0×106个细胞/ml，细胞不贴壁或贴壁状态不好.2.3 脐血间充质干细胞的生长过程脐血单个核细胞接种后，定期显微镜观察：24h可见细胞贴壁，最初细胞为圆形或不规则散在分布，有时与破骨细胞混杂存在.48h可见贴壁细胞增多，细胞周边开始伸出小突起，细胞呈条形或多角形（图A）.72h更多的细胞伸出突起，且细胞突起变长变大，折光性强，为类似成纤维细胞样的长梭形细胞，少数细胞可见微绒毛（图B）.1周可见成纤维细胞样的长梭形细胞更多，有的细胞开始接触（图C）.2周可见细胞集落融合成片，细胞排列有一定的方向性，呈漩涡状生长（图D）.3 讨论目前大量的研究已经证明脐血中存在间充质干细胞，本试验的结果也证明了这一结论.但是脐血中的MSC的量要小于骨髓中的MSC的量，而且也并不是每份脐带血中都能培养出间充质干细胞，培养条件各家实验室的报到也不尽相同.本实验在加入同一批次的胎牛血清和20μg/L的bFGF的条件下比较了DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基培养脐血MSC的效果，发现IMDM培养基培养的细胞能够伸展且在培养瓶底部形成一层同源的纤维细胞层，可见本试验条件下IMDM培养基效果较好.不同的培养密度对细胞的生长也有影响，密度过低，细胞相互作用较少，联系少，细胞很难生长；密度过高，细胞过于拥挤，接触抑制，也很难生长，且培养基中的营养很快被消耗掉，为补充营养需频繁换液，细胞未牢固贴壁就掉下来，更不利于细胞的生长.本试验在贴壁较好的IMDM培养基的条件下2.0×106个细胞/ml是最适合细胞贴壁的接种密度.本试验培养基中加入了20μg/L的bFGF，从培养结果发现加入bFGF后比未加任何外源性生长因子[1]培养的脐血MSC贴壁要早，伸展的也要早，且能提前2周在培养瓶底完全铺层,这结果也与俞猛等报到的bFGF能够促进间充质干细胞的增殖的结果一致[2].这一试验对脐血MSC的培养条件进行了初步的研究，至于脐血MSC细胞间相互作用的机制及其分化、分化机制和分化后移植效果都有待于进一步研究.——————————参考文献：〔1〕王丽娟,张叶萍,王金福，等.脐血间充质干细胞的生物学特性及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用.[J]中华血液学杂志,2005,26(2):65-68.〔2〕俞猛，夏仁云，高飙，等.bFGF和地塞米松对骨髓基质干细胞增殖与分化的影响[J].中国康复,2006,21(1):12-15.。
脐带间充质干细胞在造血干细胞移植中作用的研究进展
关键词
中图分类号
脐带 ； 间充质干细胞 ； 造血干 细胞移植 ； 移植物抗宿主病
Ｒ ４ ５ ７ ． ７ 文献 标 识 码 Ａ ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ７ ５ ３ ４ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ９ － ２ １ ３ ７ ． ２ ０ １ ７ ． ０ ６ ． ０ ５ ０
Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ａｄ ｖ ａ ｎ ｃ ｅ ０ ｎ Ｒｏ ｌ ｅ ｏ ｆ Ｕｍｂ ｉ ｌ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃｏ ｒ ｄ Ｍｅ ｓ ｅ ｎｃ ｈ ｙ ｍａ ｌ Ｓ ｔ ｅ ｍ Ｃｅ ｌ ｌ ｉ ｎ Ｈｅ ｍａ ｔ ｏ ｐ ｏ ｉ ｅ ｔ ｉ ｃ Ｓ ｔ ｅ ｍ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ Ｔｒ ａ ｎｓ ｐｌ ａ ｎｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
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脐带间充质干细胞培养的研究进展-细胞生物学论文-生物学论文
——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——细胞培养论文（专业范文8篇）之第六篇
摘要：目的观察脐带中含有的间充质干细胞体外分离、纯化及培养, 并用流式细胞仪监测脐带表面抗原及细胞周期, 探讨脐带间充质干细胞在组织工程及再生医学领域应用的优势。
方法取正常足月新生儿脐带近胎儿端, 剔除动静脉, 取其中的间质成分, 双酶法消化, 从而得到原代细胞进行培养和纯化获得贴壁细胞, 采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面抗原表达情况。
结果从脐带培养的间充质干细胞呈成纤维状细胞形态, 表达间充质干细胞相关抗原CD105、CD44、CD13、CD29, 但不表达造血细胞抗原CD34、CD45, 不表达内皮细胞抗原CD31, 与骨髓间充质干细胞表型一致。
结论脐带来源的间充质干细胞可在体外培养、扩增, 具有和骨髓来源的间充质干细胞相似的生物形态和抗原表型, 为细胞治疗探索出的新的来源。
关键词：脐带,间充质干细胞,细胞培养,免疫表型,多向分化免
疫调节
间充质干细胞是一种起源于中胚层的成体干细胞, 其具有自我更新和多向分化能力, 近年来成为研究的热点。
既往间充质干细胞主要来源于骨髓, 但随着年龄的老化, 间充质干细胞逐渐减少, 增殖分化能力减退, 取材对供者有所损伤, 限制了骨髓间充质干细胞的应用。
寻找一种新的可替代来源成为迫切要解决的问题。
目前, 人脐带间充质细胞已经在癌症[1]、心脏病、糖尿病[2]、神经疾病[3]等动物实验中证实有良好的治疗效果。
从脐带里提取出间充质干细胞并进行体外培养、扩增、生物学鉴定, 为间充质干细胞的应用提供新的来源。
1 材料与方法
1.1 材料来源取健康足月新生儿脐带组织, 在胎儿出生
12~24 h内进行进一步处理。
1.2 方法
采用无菌的PBS冲洗脐带表面, 以清除多余的血液, 将脐带剪至3~5 cm小段, 剖开脐带, 去除脐带中的血管、内皮, 将脐带组织剪碎成约1 mm2小块, 经配制的0.2%胶原酶Ⅰ (美国Sigma公司) 消化过夜, 次日再予0.25%胰蛋白酶(美国Sigma公司) 消化1 h, 经离心洗涤收集细胞, 取样做单个核细胞计数, 按1105/cm2密度将组织接种到新的有完全培养基(美国Stemcell公司) 的75 cm2塑料培养瓶(美国Corning公司) 中, 置于37Ⅰ、5%CO2培养箱中培养, 4~5 d后全换液去除非贴壁细胞, 此后2~3 d半量换液1次, 至贴壁细胞融合至80%, 予0.25%胰酶消化, 收集悬浮细胞后按1Ⅰ4传代。
传代至第三代后收集贴壁细胞, 应用流式细胞术进行CD44、CD105、CD29、CD34、CD45 (荧光标记鼠抗人CD44-FITC、CD105-PE、CD34-PE、CD45-FITC) 表面抗原检测。
2 结果
2.1 脐带间充质干细胞的形态
采用本方法获得的原代细胞多于24 h内贴壁, 倒置显微镜下可见贴壁细胞呈梭形, 部分聚集成簇, 7~14 d细胞达80%融合, 经胰蛋白酶消化传代后12~24 h内贴壁, 观察此时为呈较均一的平行排列或旋涡状的长梭形细胞, 7~10 d细胞融合至80%~90%, 继续传代至第十代, 细胞形态无明显改变。
2.2 脐带间充质干细胞的免疫表型特征
流式细胞检测结果表明, 贴壁细胞表达CD105、CD44、CD29, 但不表达造血细胞抗原CD34、CD45, 可从脐带分离出来的贴壁细胞为间充质干细胞。
3 讨论
目前, 间充质干细胞已成为近年来干细胞生物学领域中重要的研究方向。
随着研究的深入, 发现间充质干细胞具有自我更新和多向分化能力, 同时产生的微环境对造血干细胞的归巢和细胞增殖分化均具有重要意义。
2000年, Rrices等[4]首次报道了脐带血中可以分离培养出间充质干细胞, 随后Ro.nlanov等又分别从脐静脉内皮和内皮下、脐带Whartong胶质和血管周围组织中分离培养出了间充质干细胞, 并建立了脐带间充质干细胞的分离培养方法。
许多研究表明不同组织来源的间充质干细胞同时又具有相似的免疫表型特征[5], 表现为SH2 (CD105) 、SH3 (CD73) 、SH4、CD166、CD13、CD29、CD44等粘附分子阳性, 不表达造血和内皮标记, 如CD34、CD31和CD45等。
表达HLA-I, 不表达HIA-DR, 不表达协同刺激分子CD80、CD86和CD40。
现已发现可在胎儿血液、肝脏、骨髓、脂肪获得间充质干细胞且各种来源的细胞之间无明显差异, 都具有向多种中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力, 在一定条件下, 可被导分化成软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞和内皮细胞[6,7]。
其次, 间充质干细胞独特的细胞增殖模式使外源基因易于导入和表达, 因此, 间充质干细胞是潜在的基因治疗靶细胞。
早期主要使用骨髓来源的间充质干细胞, 但存在以下的缺点:细胞增殖能力随供者年龄增加而减弱;骨髓采集对供者而言为有创性的操作, 难以进行大规模的推广。
为
此寻找新的可替代间充质干细胞供源显得十分迫切。
采用本实验方法得到的间充质干细胞经鉴定具有与骨髓来源的间充质干细胞相似形态特点与免疫表型标记。
本实验发现的贴壁细胞呈长梭形, 较均一的平行排列或旋涡状, 均表达CD105、CD44、CD29, 但不表达造血细胞抗原CD34、CD45。
相比于骨髓, 脐带间充质干细胞具有以下优势:脐带的获得更容易, 对供者无创伤;脐带中间充质干细胞免疫原性更低, 不表达与移植排斥相关的HLAⅠ类抗原, 也不表达由效应T细胞导的共刺激分子, 混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制, 异体移植该细胞不会发生免疫排斥反应[8,9,10], 受者排斥可能性小;人脐带中分离出的间充质干细胞在细胞含量、增殖能力上均优于骨髓间充质干细胞, 可在体外大量扩增[11,12],(4) 在胎盘屏障保护下, 脐带病毒或细菌感染机会更小,(5) 不牵涉伦理道德等问题。
在组织工程及再生医学领域, 问充质干细胞作为种子细胞可应用于修复替代受伤或病变的多种组织器官, 从而为目前一些无法有效治愈的重大疾病如脊髓受伤、多发性硬化(MS) 、老年性痴呆、帕金森氏症等提供了崭新的治疗方案。
此外, 间充质干细胞的免疫调节、免疫抑制功能尤其值得关注。
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