实验一 蛋白质及氨基酸的显色反应(验证)
鉴定Trp
偶氮反应
咪唑基、 鲜红色物质生成 鉴定His、Tyr 酚核
试剂和器材
一、试剂 1.蛋白质溶液：取5mL蛋清，用蒸馏水稀释至
100mL，搅拌均匀后，用纱布过滤。 2.0.1%茚三酮乙醇溶液：称取0.1g茚三酮，溶
于100mL95%乙醇。临用前配制。 3.尿素粉末 4.1%硫酸铜溶液 5.10%氢氧化钠溶液和20%氢氧化钠溶液 6.0.5%苯酚溶液
实验一 蛋白质及氨基酸的 显色反应
主讲:张丽霞
Department of life science
实验一、 蛋白质及氨基酸的显色反应
目的和要求
1、学习和了解常用的几种鉴定蛋白质与氨基 酸的方法。 2、进一步认识氨基酸是蛋白质的基本组成单 位。
Ⅰ、双缩脲反应 (Biurea reaction)
管号
１
0
0.3％ 蛋白质 20％ α －萘 NaClO 现象
精氨 溶液 NaOH 酚
记录
酸
0
5
5
3
6
２
0
5
0
5
3
6
３
5
0
0
5
3
6
Ⅴ、乙醛酸反应 (AdamkiewicaHopkins-Cole reaction)
原理 在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生
成紫色物质，反应机理尚不清楚，可能是一分
酚 4
2 鸡蛋清液
4
4
2
加入NaOH 后现象变
化
3 指甲
少许 20
4 头发
少许 20
Ⅳ、坂口反应 (Sakaguchi reaction
原理
在次溴酸钠或次氯酸钠存在的条件下，许多含 有胍基的化合物 能与α-萘酚发生反应生成红色 物质。在20种氨基酸中唯有精氨酸含有胍基，所 以只有它呈正反应。
生成的氨被次溴酸钠或次氯酸钠氧化生成氮。 该反应中过量的次溴酸钠或次氯酸钠是不利的，因 其能进一步缓慢氧化，使产物破裂分解，引起颜色 消失。但加入适量尿素可破坏过量的次溴酸钠。
二、取另一支试管，加1mL卵清蛋白溶液和10%氢
氧化钠溶液2mL，摇匀，再加1%硫酸铜溶液两滴，
随加随摇，观察紫玫瑰色的出现。
Ⅱ、茚三酮反应 (Ninhydrin reaction)
原理:
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成 黄色物质外，所有的α-氨基酸及一切蛋白 质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该 反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化， 产生CO２、NH3和醛，而水合茚三酮被还原 成还原型茚三酮；第二步是所生成的还原 型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩 合生成有色物质。
操作步骤
取2支试管，分别加入0.3%组氨酸溶液和纯鸡 蛋清各4滴，再各加入新配制的重氮试剂8滴摇 匀，加入2滴20%氢氧化钠溶液，再摇匀。过几 分钟，观察颜色的形成，一般出现樱桃红色。
Байду номын сангаас
偶氮反应
试剂 （滴） 管号
0.3％
组氨酸 （滴）
鸡蛋清 （滴）
偶氮试剂 20％ 现象记录 NaOH溶 液
在蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基易发 生上述反应，而苯丙氨酸不易硝化，需加少 量浓硫酸催化才能呈明显的正反应。皮肤、 指甲、头发等遇浓硝酸变黄即为这一反应的 结果。
操作步骤:
一、取一支试管加4滴0.5%苯酚溶液，再加浓 硝酸2滴，观察黄色出现，冷却后逐滴加入10% 氢氧化钠溶液，观察颜色转变为橙色。
二、在一小片滤纸上滴上一滴0.5%的甘氨酸 溶液，风干后，再在原处滴0.1%的茚三酮 乙醇溶液一滴，在微火旁烘干显色，观察 紫红色斑点的出现。
Ⅲ、黄色反应 (Xanthoproteic reaction)
原理
凡是含有苯环的化合物都能与浓硝酸作用 产生黄色的硝基苯衍生物。该化合物在碱性 溶液中进一步转化成深橙色的硝醌酸钠。
Department of life science
该反应灵敏度达 1：250 000。因此常用于定 量测定精氨酸的含量和定性鉴定含有精氨酸的蛋白 质。
操作步骤
取3支试管，分别加入1mL蒸馏水、0.3%精 氨酸溶液和蛋白溶液，各加20%氢氧化钠溶液5 滴，1%α-萘酚酒精溶液3滴，次氯酸钠溶液6滴， 摇匀，放置片刻，观察出现的颜色。
坂口反应
试剂 H2O （滴）
7.浓硝酸和浓硫酸(A.R.) 8.0.1%茚三酮水溶液 9.0.3%精氨酸溶液、0.3%组氨酸溶液、0.5%甘氨酸 10.纯鸡蛋清 11.1%α-萘酚乙醇溶液，临用时配制 12.冰醋酸 13.20%明胶溶液 14.次氯酸钠溶液 15.重氮试剂： 溶液 A：溶解5g亚硝酸钠于1 000mL水中。 溶液 B：溶解5g对氨基苯磺酸于1 000mL水中。溶解
3.本次实验有的试剂具强腐蚀性和刺激 性，操作时要多加小心。
思考题
1.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应 呈阴性结果，此时可对水解程度作出什么结论?
2.能否用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在? 3.白明胶对乙醛酸反应呈阴性，为什么?
实验一 蛋白质及氨基酸的 显色反应
主讲:张丽霞
子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝
相似的物质。色氨酸在浓硫酸中与一些醛类反
应也形成有色物质。很多人用含有少量醛杂质
的冰醋酸或芳香醛等进行此反应。
操作步骤
向试管中加数滴蛋白质溶液，再加冰醋酸 (常含 有少量乙醛酸或醛类)约1mL并混匀倾斜试管，谨 慎地沿着管壁加浓硫酸(AR)约1mL，使其重迭，且 勿使二者混合。静置后，观察在两液界面上出现 的红紫色环，于水浴中微热，可加快色环形成。
后，再加入5mL浓硫酸。 A、B溶液分别保存于密闭瓶内。需用时，以1：1的比
例混合。
二、器材
1.试管及试管架 2.水浴锅 3.酒精灯 4.量筒(10mL) 5.滤纸片 6.烘箱
实验注意事项：
1.本次实验内容繁多，请严格按步骤操 作，并做好实验报告。
2.本次实验是定性实验，各种实验的现 象都可能发生，要细心观察。
二、取一支试管加蛋白质溶液4滴及浓硝酸2滴， 由于强酸的作用，开始蛋白质形成白色沉淀， 小火加热，则沉淀变为黄色，冷却，逐滴加入 10%氢氧化钠溶液，颜色由黄色转变成深橙黄 色。
三、剪少许指甲或头发放入试管中，加入数滴 浓硝酸，观察颜色变化。
黄色反应
管号 材料
量（滴)
浓硝酸 （滴） 现象
1 0.5％苯
1
4
8
2
2
4
8
2
反应名称 反应基团 反应产物及现象
用途
双缩脲反应
肽键
Cu—双缩脲络合物 （兰紫色）
茚三酮反应 α-氨基酸
兰紫色
黄色反应 坂口反应
苯环、Trp、 黄色硝醌酸生成 Tyr
胍基 玫瑰红色产物生成
乙醛酸反应 吲哚环 中间生成兰紫色环
测蛋白质含量 和鉴定蛋白质 水解 是否完全 测AA含量、检 验AA及蛋白质 鉴定Trp、Tyr
用20%的白明胶作乙醛酸反应。观察结果。
乙醛酸反应
试剂 （滴） 管号
1
白明胶
蛋白质溶 冰醋酸 液（滴） （ml）
5
1
浓硫酸 （ml）
1
现象记录
2
1
1
3
5
1
1
Ⅵ、偶氮反应 (Azo reaction)
原理 偶氮化合物 (偶氮试剂)与酚核或咪唑环结合产生
有色物质。它与酪氨酸和组氨酸反应的产物分别 为红色和樱桃红色。含有酪氨酸和组氨酸的蛋白 质也有此反应。
蛋白质和多肽都有双缩脲反应，但有双缩 脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。此反 应所产生颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比， 而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。
操作步骤
一、取少量尿素结晶，放入干燥试管中，用微火 加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停 止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后， 加10%NaOH溶液约1mL，振荡混匀，再加入 1%CuSO４溶液1滴，振荡之。观察出现的粉红颜 色。避免添加过量硫酸铜，生成的蓝色氢氧化 铜能掩盖粉红色。
此反应的适宜pH为5-7。该反应十分灵敏， 1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能显示 反应，是一种常用的氨基酸定量方法。
操作步骤
一、取2支试管分别加入蛋白质溶液和0.5%甘 氨酸溶液1mL，再加0.5mL0.1%茚三酮水溶 液混匀，在沸水浴中加热1-2min，观察颜 色由粉色变成紫红色再变蓝。
原理:
双缩脲反应:在碱性条件下，双缩脲与二价铜 离子作用，生成紫红色配合物的反应。当加热至 180℃左右时，两分子尿素缩合脱去一分子氨，生 成双缩脲。在肽和蛋白质分子中具有肽键，其结 构与双缩脲类似，也能发生此反应，生成蓝紫色 或紫红色的配合物。该反应常用于蛋白质的定性 或定量测定。
紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：
实验1 蛋白质及氨基酸的呈色反应
实验一 蛋白质及氨基酸的呈色反应一、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 二、实验原理1. 双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。
2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。
3.苯环的黄色反应Tyr TrpPhe+少量浓硫酸+浓硝酸黄色 4. 乙醛酸的反应：检测Trp 或含Trp 蛋白质的反应。
当Trp 与乙醛酸和浓硫酸在试管中滴加时，产生分层现象，界面出现紫色环。
主要是由于蛋白质中的吲哚环作用。
5. 偶氮反应偶氮化合物都含有-N=N-这样结构，通常作为染料。
()↓--→+--+Pb COO NH Pb COOH N H 2222Pr Pr 三、实验步骤1. 双缩脲反应(biuret reaction)取1支试管，加乳蛋白溶液（蛋清：水= 1：9）约1ml 和10%NaOH 约2ml ，摇匀，再加1%CuSO4溶液2滴，随加随摇。
观察现象，记录。
2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction)（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液（蛋清：水= 1：9）和甘氨酸溶液1ml ，再各加0.5ml0.1%茚三酮，混匀，沸水浴中加热1-2分钟，观察颜色是否由粉红色变紫红色再变蓝色。
（2）在一块小滤纸上滴1滴0.5%的甘氨酸溶液，风干后再在原处滴1滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察是否有紫红色斑点的出现。
3.苯环的黄色反应向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
鸡蛋清溶液（蛋清：水= 1：9）4. 乙醛酸的反应：向3个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
蛋白质溶液（蛋清：水= 1：20）向3个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
显色反应实验报告
一、实验目的1. 理解显色反应的基本原理和实验方法；2. 掌握常见显色反应的实验操作和现象；3. 学习显色反应在分析化学中的应用。
二、实验原理显色反应是指在化学反应过程中，某些物质与特定试剂发生反应，产生具有明显颜色变化的反应。
显色反应广泛应用于分析化学、生物化学、药物分析等领域。
本实验主要介绍几种常见的显色反应及其原理。
1. 双缩脲反应：蛋白质分子中含有肽键，其结构与双缩脲相似，在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色化合物。
2. 茚三酮反应：氨基酸或含有游离氨基的蛋白质的水解产物与茚三酮水溶液共热，产生蓝紫色化合物。
3. 黄色反应：苯酚与FeCl3反应，生成黄色络合物。
4. 考马斯亮蓝反应：蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料结合，形成蓝色络合物。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：试管、酒精灯、试管架、烧杯、移液管、滴定管等。
2. 试剂：蛋白质溶液、氨基酸溶液、尿素、10%氢氧化钠溶液、1%硫酸铜溶液、茚三酮试剂、苯酚、FeCl3溶液、考马斯亮蓝G-250染料等。
四、实验步骤1. 双缩脲反应：（1）取少量蛋白质溶液于试管中，加入10%氢氧化钠溶液1ml，再加入1%硫酸铜溶液4滴，观察现象。
（2）取少量尿素结晶，放在干燥试管中，用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。
2. 茚三酮反应：（1）取少量氨基酸溶液于试管中，加入茚三酮试剂1ml，共热，观察现象。
（2）取少量蛋白质溶液于试管中，加入茚三酮试剂1ml，共热，观察现象。
3. 黄色反应：（1）取少量苯酚溶液于试管中，加入FeCl3溶液1ml，观察现象。
（2）取少量蛋白质溶液于试管中，加入FeCl3溶液1ml，观察现象。
4. 考马斯亮蓝反应：（1）取少量蛋白质溶液于试管中，加入考马斯亮蓝G-250染料1ml，观察现象。
（2）取少量氨基酸溶液于试管中，加入考马斯亮蓝G-250染料1ml，观察现象。
五、实验结果与分析1. 双缩脲反应：蛋白质溶液与硫酸铜溶液反应后，产生紫红色沉淀。
大学生物化学实验
生物化学实验安排实验一蛋白质及氨基酸的呈色反应一、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、实验原理1. 双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。
2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。
3.苯环的黄色反应Tyr+ 浓硝酸黄色TrpPhe+少量浓硫酸+浓硝酸黄色4. 乙醛酸的反应：检测Trp或含Trp蛋白质的反应。
当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中滴加时，产生分层现象，界面出现紫色环。
主要是由于蛋白质中的吲哚环作用。
5. 偶氮反应偶氮化合物都含有-N=N-这样结构，通常作为染料。
6. 醋酸铅反应()↓--→+--+Pb COO NH Pb COOH N H 2222Pr Pr三、实验步骤1. 双缩脲反应(biuret reaction)取1支试管，加乳蛋白溶液（蛋清：水= 1：9）约1ml 和10%NaOH 约2ml ，摇匀，再加1%CuSO4溶液2滴，随加随摇。
观察现象，记录。
2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction)（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液（蛋清：水= 1：9）和甘氨酸溶液1ml ，再各加0.5ml0.1%茚三酮，混匀，沸水浴中加热1-2分钟，观察颜色是否由粉红色变紫红色再变蓝色。
（2）在一块小滤纸上滴1滴0.5%的甘氨酸溶液，风干后再在原处滴1滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察是否有紫红色斑点的出现。
3. 苯环的黄色反应向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
鸡蛋清溶液（蛋清：水= 1：9）4. 乙醛酸的反应：向3个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
蛋白质溶液（蛋清：水= 1：20）5. 偶氮反应向3个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
茚三酮呈色反应实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除茚三酮呈色反应实验报告篇一：实验三蛋白质及氨基酸的呈色反应实验三蛋白质及氨基酸的呈色反应一、实验目的1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、实验内容对蛋白质及氨基酸的双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等颜色及沉淀反应进行定性确定。
三、实验操作（一）双缩脲反应1、实验原理当尿素加热到180℃左右时，两个分子的尿素缩合可放出一个分子氨后形成双缩脲，双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的红色配合物，此呈色反应称为双缩脲反应。
由于蛋白质分子中含有多个肽键，其结构与双缩脲相似，故能呈此反应，而形成紫红色或蓝紫色的配合物。
此反应常用作蛋白质的定性或定量的测定。
2、试剂(1)尿素(2)10%naoh溶液(3)1%cuso4溶液(4)蛋白质溶液：将鸡蛋清用蒸馏水稀释10~20倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用。
3、操作（1）取少许结晶尿素放在干燥试管，微火加热，则尿素开始熔化，并形成双缩脲，释放的氨可用湿润的红色石蕊试纸鉴定。
待熔融的尿素开始硬化，试管内有白色固体出现，停止加热，让试管缓慢冷却。
然后加10%naoh溶液1ml和1%cuso42~3滴，混匀后观察颜色的变化。
（2）另取一试管，加蛋白质溶液1ml、10%naoh溶液2ml 及1%cuso42~3滴，振荡后将出现的紫红色与双缩脲反应所产生的颜色相对比。
（二）茚三酮反应1、实验原理除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮作用生成黄色物质外，所有α-氨基酸与茚三酮发生反应生成紫红色物质，最终形成蓝紫色化合物。
1︰1500000浓度的氨基酸水溶液即能发生反应而显色。
反应的适宜ph为5~7。
此反应目前广泛地应用于氨基酸定量测定。
2、试剂蛋白质溶液（同前）；0.5%甘氨酸；0.5%茚三酮水溶液3、操作取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液各1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴加热2~3分钟，观察颜色变化。
蛋白质、氨基酸、糖的鉴别试验及其比较
蛋白质1.由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。
蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。
2.双缩脲反应biuret reaction：蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用形成紫色络合物的呈色反应。
在540nm 波长处有最大吸收。
可用于蛋白质的定性和定量检测。
紫色络合物分子结构式在碱性溶液（NaOH）中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与铜离子（Cu2+）作用，形成紫色络合物（该物质的分子结构式见图），该反应即双缩脲反应。
双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。
一般分子中含有两个氨基甲酪基（即肽键：-CO-NH-）的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。
注：除-CO-NH-有此反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。
双缩脲反应的鉴定由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。
使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。
双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。
干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如Tris缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。
配制双缩脲试剂的注意事项双缩脲试剂由NaOH溶液（0.1g/mL）和CuSO4溶液（0.01g/mL）配制而成，配制比例为5:1。
但是双缩脲试剂不用现配现用，这是与斐林试剂不同的地方之一！蛋白质检测方法比较糖分的鉴别实验1.Fehling试验生药的水浸液加Fehling试剂，于沸水浴加热数分钟，若有还原性糖类成分存在，则产生砖红色氧化亚铜沉淀。
生化实验整理
1. 氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、实验目的✓ 了解层析技术的一般原理✓ 掌握纸层析的方法和原理，学会分析未知样品的氨基酸成分二、实验原理➢ 层析法亦称色谱法，是利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到分离的目的➢ 固定相：是由层析基质组成的，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用➢ 流动相：是在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体。
柱层析中一般称为洗脱液，薄层层析时称为展层剂➢ 分配系数：是指在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比例，常用K 来表示，它是层析中分离纯化物质的重要依据➢ 迁移率：是指在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用R f 来表示分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件，差异越大，分离效果越理想➢ 层析根据不同的标准可以分为多种类型：如按固定相基质的形式不同可分为纸层析、薄层层析和柱层析；按流动相的形式不同可分为液相层析、气相层析和超临界层析；按分离的原理不同可分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等➢ 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。
有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。
溶质在滤纸上的移动速度用R f 值表示：在一定条件下，某种物质的R f 值是常数。
R f 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关❖ 氨基酸显色反应——茚三酮反应原理：所有的α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质，除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质该反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成CO 2、NH 3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮结合另一分子水合茚三酮和氨缩合生成有色物质f R三、实验器材大试管及塞子，大头针，三角薄层喷瓶，毛细管，吹风机，层析滤纸（新华一号），分液漏斗四、实验材料与试剂扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物氨基酸混合液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸的混合液（各组份浓度均为0.5%）显色剂：0.1%水合茚三铜正丁醇溶液五、实验操作➢取层析滤纸（20×2cm）一条，在纸的一端距边缘3cm处用铅笔划一直线，取其中点作为原点。
实验4 氨基酸
实验4 氨基酸、蛋白质的主要化学性质一、目的要求用实验方法验证氨基酸、蛋白质的主要化学性质，增强感性认识。
二、原理α-氨基酸和蛋白质均含有α-氨基酰基R—CH—C—的结构，故都能与水合| ||NH2 O茚三酮作用生成兰紫色物质。
OC O HCC O H O +R C H C O O HN H2OCC H O HCO+N H3pH5100℃+R C H O C O2++N H3O CC H O H C +OH O CCH O COOCC CO OCCCON+3H2OOCC CO OCCCNO N H4CCCOOCCCON-+（蓝紫色）水合茚三酮N H3脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应不释放氨而直接生成黄色化合物。
蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故在碱性环境中能与硫酸铜结合成紫红色的络合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中若存在含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸等，当其与浓硝酸共热时，则变成黄色，这就是黄蛋白反应，若再继续加碱则颜色转变成橘黄色。
若蛋白质分子中具有含硫氨基酸如半胱氨酸、蛋氨酸等，则与碱及醋酸铅共热时，分解而产生硫离子，后者遇铅盐即生成黑色硫化铅沉淀。
蛋白质胶体是亲水胶体，若除去其质点上的水膜和电荷，蛋白质粒子则凝聚析出，这就是蛋白质的沉淀作用，使蛋白质胶体沉淀的方法有多种，常用的有下列几种：1、盐析法：加中性盐或硫酸铵等电解质试剂于蛋白质溶液中，这些电解质离子的水化能力比蛋白质强，可以夺去蛋白质粒子外围的水膜，并且蛋白质粒子外围的双电层又受到了压缩，也就是使其所带的电荷削弱，蛋白质胶体粒子由于失去两种使自己稳定的因素而沉淀。
2、有机溶剂的沉淀作用：水溶性的有机溶剂如乙醇、丙酮等，它们与水的亲和力大于蛋白质，因此能破坏蛋白质粒子的水膜，而使其沉淀析出。
3、生物碱试剂的沉淀反应：生物碱沉淀剂如三氯醋酸、若味酸、鞣酸等都能与蛋白质阳离子结成不溶性的盐而沉淀析出。
4、重金属离子的沉淀作用：某些重金属离子，如Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等，能与蛋白质阴离子结合成不溶性盐类而沉淀析出。
最新实验一 蛋白质及氨基酸的显色反应(验证)
操作步骤:
一、取一支试管加4滴0.5%苯酚溶液，再加浓 硝酸2滴，观察黄色出现，冷却后逐滴加入10% 氢氧化钠溶液，观察颜色转变为橙色。
紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：
蛋白质和多肽都有双缩脲反应，但有双缩 脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。此反 应所产生颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比， 而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。
操作步骤
一、取少量尿素结晶，放入干燥试管中，用微火 加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停 止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后， 加10%NaOH溶液约1mL，振荡混匀，再加入 1%CuSO４溶液1滴，振荡之。观察出现的粉红颜 色。避免添加过量硫酸铜，生成的蓝色氢氧化 铜能掩盖粉红色。
二、在一小片滤纸上滴上一滴0.5%的甘氨酸 溶液，风干后，再在原处滴0.1%的茚三酮 乙醇溶液一滴，在微火旁烘干显色，观察 紫红色斑点的出现。
Ⅲ、黄色反应 (Xanthoproteic reaction)
原理
凡是含有苯环的化合物都能与浓硝酸作用 产生黄色的硝基苯衍生物。该化合物在碱性 溶液中进一步转化成深橙色的硝醌酸钠。
管号
１
0
0.3％ 蛋白质 20％ α －萘 NaClO 现象
精氨 溶液 NaOH 酚
记录
酸
0
5
5
3
6
２
0
5
0
5
3
6
３
5
0
0
5
3
6
Ⅴ、乙醛酸反应 (AdamkiewicaHopkins-Cole reaction)
生物化学实验
2008—2009 学年度第 一 学期
开课单位 课程名称 授课班级 任课教师
水产学院 生物化学实验 养殖 0713 韩芳
试验一蛋白质显色反应和氨基酸纸层析
（一） 蛋白质的显色反应
一、 目的要求： 1、 理解蛋白质具有双缩脲反应。 2、 理解蛋白质和α--氨基酸均能与茚三酮作用产生有色化合物。 3、 了解氨基酸、蛋白质的某些侧链功能基团能发生黄色反应、米伦氏反应
二、教学方法和教学学时： 1、教学方法：学生操作实验，教师指导。 2、教学学时：4 学时。
三、实验内容： 以桔络、作实验样品，用 10 倍量的 1%盐酸抽提（研磨），制得 50ml 抽
提液；用 1%盐酸作空白液。脉动和鲜橙多饮料，离心后的6—二氯酚靛酚滴定法测定该抽提液或样品液中 VC 的含量。
六、思考题
1．常用蛋白质的提取方法有哪些？各有何优缺点？
2．考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定
量法？
3．如何正确使用分光光度计？
七、作业：完成实验报告。
实验四 还原糖和总糖含量的测定（3，5-二硝基水杨酸比色法）
一、目的要求：
1、掌握用硝基水杨酸比色法测定样品中总糖和还原糖含量。
（1）标准曲线的制作
取 6 支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。
管号
12345 6
蛋白质标准液（ml）
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水（ml）
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
考马斯亮蓝 G-250 试剂（ml）
55555 5
蛋白质含量（μg）
0 20 40 60 80 100
（二） 氨基酸的纸层析法分离
氨基酸分离鉴定中显色剂为什么不能用茚三酮水溶液
氨基酸分离鉴定中显色剂为什么不能用茚三酮水溶液茚三酮根很多种氨基酸都显示紫色没办法分离鉴定呀茚三酮使氨基酸显色原理α氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色，最终为蓝色物质。
脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。
该反应可广泛用于各种氨基酸的定性或定量测定。
阿尔法氨基酸与水合茚三酮一起加热，经氧化脱氨变成相应的阿尔法酮酸，酮酸进一步脱羧变成醛，水合茚三酮被还原成还原成还原型茚三酮。
在弱酸性溶液中，氨、还原型茚三酮，和另一分子水合茚三酮反应，缩合成蓝紫色物质。
注意事项（1）被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.05～0.8之间，各组分之Rf值相差最好能大于0.05，以免斑点重叠。
（2）溶剂系统中任一组分与被分离物之间不能起化学反应。
（3）被分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。
本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱，如图3.2所示。
注意事项（1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。
（2）第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化，影响层析效果。
（3）整个实验操作应戴手套进行。
思考题1．酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？2．为什么展层时要用两种溶剂系统？性质：又称比移值。
是色谱法中表示组分移动位置的一种方法的参数。
定义为溶质迁移距离与流动相迁移距离之比。
在一定的色谱条件下，特定化合物的R f值是一个常数，因此有可能根据化合物的R f值鉴定化合物请问薄层层析时，Rf值在什么范围时，分离效果比较准我帮你查了相关书籍结合我的实验经验，薄层层析采用硅胶G-CMC板，通用展开系统：无水乙醇-苯（1：4）；苯-氯仿（1：3）；丙酮-甲醇（1：1）。
先用无水乙醇-苯（1：4）展开，Rf值如果>0.8，改用苯-氯仿（1：3），若Rf值如薄层层析时为甚麼Rf值要在0.2~0.8之间Rf值的大小与样品的结构、性质、溶剂系统等有关薄层层析时Rf值要在0.2~0.8之间主演是考虑的经济性，在效果比较好的情况下保持展开剂的用量少蛋白质的性质实验From： Update：2006-12-01【目的和要求】1. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。