酶的分离纯化
酶的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
酶的分离纯化
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五、抗体酶
五、抗体酶 （abzyme） ） 抗体酶本质上是免疫球蛋白， 抗体酶本质上是免疫球蛋白，但在易变区被赋予了 免疫球蛋白 酶的属性，所以又称“催化性抗体” 酶的属性，所以又称“催化性抗体”（catalytic antibody）。 ）。 抗原： 抗原：
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二、调节酶
• 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 • 调节酶分子中有活性区和调节区，其催化活力 调节酶分子中有活性区 调节区， 活性区和
可因与调节剂的结合而改变， 可因与调节剂的结合而改变，有调节代谢反应 的功能。 的功能。
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三、酶的纯度鉴定
酶产品质量评价中常使用比活力， 酶产品质量评价中常使用比活力， 比活力越高，纯度越高。 比活力越高，纯度越高。
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第七节 一些酶的名称及概念介绍
寡聚酶( ) 一 寡聚酶(oligoenzyme)
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 非催化部位 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 进而改变酶的活性状态， 进而改变酶的活性状态，这种现象称为别 构调节作用。 构调节作用。
别构激活作用 别构抑制作用
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三、同工酶
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酶的分离纯化讲解
第二节分离纯化步骤及方法
一、步骤
发酵产品
1、酶的提取
固液分离，破碎，抽 提，浓缩
2、初分离
3、 纯化
精制品
4结晶
保藏
酶分离纯化总体步骤
1、酶液的提取
（1）发酵液的固液分离 （2）细胞破碎
（1）发酵液的固液分离
❖ 常用的分离方法有离心和过滤。 ➢ 离心分离速度快，效率高，操作时卫生条件
转筒真空过滤器
II
1 2
4 III
6 7
5
3
a.转动盘
b.固定盘
I
1－转筒；2－滤饼；3－割刀；4－分配头；5－吸走滤液的真空凹槽； 6－吸走洗水的真空凹槽；7－通入压缩空气的凹槽I－过滤区； II－洗涤脱水区；III－卸渣区
（2）细胞破碎
❖ 按微生物细胞酶的分布分为三类 ❖ 细胞破碎是指通过物理、化学或生物的方法，
❖ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打 碎，然后再用10000r/min～20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织 的细胞打碎。
物理破碎
通过各种物理因素 的作用，使组织、 细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
冻结-融化法 压榨法 渗透压法 超声波破碎法
纯度要求 极高纯度（>99%）
高纯度（95%-99%）
一般纯度（<95%）
用途 医疗用途
理化性质研究
生产抗原
2、明确目标蛋白与主要杂质的性质
❖ 检测目标酶蛋白稳定条件，至少检测pH 值和离子强度两个条件。
❖ 了解目标酶和杂质的性质：分子大小、 等电点、溶解度等。
酶的分离纯化及活性测定
第五节酶的分离、纯化及活性测定1一、酶的分离、纯化•:一类由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用胞外酶生然后分到行作的酶，这类酶大多都是水解酶类。
•胞内酶:另一类酶在细胞内合成后在细胞内起催化作用的，这类酶数量较多。
的多2一般原则：般原则：防止强酸、强碱, 要求加入的化学试剂不使酶变性；在低温下操作，全部操作在低温0～4℃；在分离提纯过程中避免剧烈搅拌 在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂如少量EDTA 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈的烈”的手段。
3酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。
在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一第，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)。
4基本操作程序微生物、动物、选材植物加入提取液抽提胞内酶先破碎抽提先净化处理再沉淀法分离离子交析分离纯化换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等5（一）酶的抽提（）酶的抽提1、破碎细胞对于细胞外酶可用水缓冲液浸泡过对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过滤后，可得粗抽提液。
对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎，通常用匀浆器捣碎机，制成较易破碎，通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提液。
细菌细胞壁较厚，需用超声波、溶胞壁较声溶菌酶等抽提。
酶等提62、酶的抽提酶的抽提一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来。
抽提条件：提出来抽提条件⑴抽提溶的pH选择应该在酶的pH稳定，并离范围之内，并且最好远离等电点。
低温下抽提⑵低温下抽提（0～40C）7（二）酶的纯化（）酶的纯化抽提液中除含有所需有酶外，还含有其它大抽提液中除含有所需有酶外还含有其它大分子物质。
常用分离纯化的方法：①溶解度②电荷性质③大小或质量④亲和部位。
分离纯化一种酶的方法
分离纯化一种酶的方法分离纯化一种酶是生物工程领域的一个重要研究课题，有多种方法可以用来实现这一目标。
下面将介绍几种常用的分离纯化酶的方法。
1.固定相吸附色谱法固定相吸附色谱法是最常用的酶纯化方法之一。
在这种方法中，通过对酶进行吸附，然后使用缓冲溶液洗脱的方式分离纯化酶。
为了实现这一目标，可以选择一种适合酶吸附的固定相，例如亲和树脂、离子交换树脂或凝胶等。
通过在不同的条件下洗脱，可以逐步去除非目标蛋白质，最终得到纯化的酶。
2.亲和层析法亲和层析法是常用的可以选择性地与酶相互作用的方法。
在亲和层析法中，可以通过与酶相互作用的特定亲和剂将酶从复杂混合物中分离出来。
例如，可以根据酶与金属离子的亲和性，使用金属离子柱进行层析。
亲和层析法通常需要先对亲和剂进行固定，然后通过加载样品和适当的洗脱剂来纯化酶。
3.凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于酶的大小差异来分离纯化的方法。
这是一种较为简单的方法，适用于分离不同分子量的酶。
在凝胶过滤法中，通过将混合物通过一系列的凝胶分离层来分离不同大小的分子。
酶分子会在凝胶中被阻止，而较小的分子可以通过凝胶透析孔隙。
通过控制凝胶的孔隙大小，可以选择性地纯化酶。
4.电泳法电泳法是一种常用的酶分离纯化方法，尤其适用于具有不同电荷的酶。
在电泳法中，通过在电场中施加电压，根据不同酶的迁移速度将酶分离出来。
根据酶的等电点和电荷性质，可以选择凝胶电泳或者等电聚焦电泳来分离纯化酶。
电泳法的一个重要应用是SDS-PAGE，它从凝胶中获得酶的纯化和分析。
5.超滤法超滤法是一种可以根据酶的分子量选择性地分离纯化酶的方法。
在超滤法中，通过将混合物通过一系列合适孔径的滤膜，可以将酶与其他较小分子分离开来。
较大分子（包括酶）会被限制在滤膜上方，而较小分子则可以通过滤膜，从而实现分离纯化酶的目的。
综上所述，分离纯化酶的方法有很多种。
选择适用的方法取决于酶的性质、目标和需求。
常用的方法包括固定相吸附色谱法、亲和层析法、凝胶过滤法、电泳法和超滤法。
酶的分离纯化
超声波破碎法
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂
酶促破碎法
自溶法 加酶处理
G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充
分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。
2、按膜孔径或截留物质的大小：
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
膜
孔
径大
小
灰尘 细菌
膜
病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子
生物小分子 盐类 水
微滤（MF）
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子
选择性热变性法、选择性酸碱变性法、 选择性表面变性法
亲和层析、亲和电泳
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法 1、原理： 2、硫酸铵盐析的优点
优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
(25℃)
当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加 入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐 浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。
4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素
（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目 标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实 验确定。
（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。
第4章 酶的分离与纯化
equilibrium centrifugation）。
根据颗粒的密度不同而进行分离。
离心时，在离心介质的密度梯度范围内，
不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂
浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成
区带。
常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。
特点：
•介质的密度梯度范围包括所有待分离 物质的密度。 •适于分离沉降系数相近，但密度不同 的物质。
细胞粉碎机
匀浆机
（三）细胞破碎确认
1.直接测定破碎前后的细胞数：
破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；
破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。
2.测定导电率：
利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量， 估算破碎率。
三、酶的提取(extraction)
物理破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。 化学试剂可以改变细胞壁 或细胞膜的通透性，而使 细胞内物质有选择性的渗 透出来 通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
化学破碎
酶促破碎
高 压 细 胞 破 碎 机
JY92-II D超声波
质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出。
• 浓缩作用
• 纯化作用
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：
⑴中性盐沉淀（盐析法）
⑵有机溶剂沉淀
⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）
⑷等电点沉淀
⑸有机聚合物沉淀
（一）盐析沉淀法（改变离子强度）
1. 基本原理（盐溶和盐析）
向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可
酶的分离 纯化
（2-4）
若酶的总浓度用[E]t表示，那么 [E]= [E]t－[ES]，代入式（2-4）并整理得
（2-5）
由于酶的反应速度与[ES]成正比，所以
V = k3 [ES] 将（2-5）代入（2-6），得
（2-6）
（2-7）
第一节 酶促反应动力学
当底物浓度很高时，所有酶都与底物结合生成中间产物ES，则[E]t=[ES]。此时 反应速度达到最大Vmax，即
整理上式可得 Km= [S] 由此可以看出，Km的物理意义就是当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的 底物浓度，其单位与物质摩尔浓度单位相同，用mol/L表示。Km数值大小与酶的浓 度无关，是酶反应的特性常数。不同酶的Km值不同，且同一酶在不同的底物下，其 Km值也不同。米氏常数可由实验测得，也可用下面的公式求得：
Vmax= k3 [ES]= k3[E]t
（2-8）
（2-7）除以（2-8），并整理得
（2-9）
这就是米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation），又称为米氏方程，式中的 Km是一常数值，称为米氏常数。在特殊情况下，当v = Vmax时，米氏方程可转化为下 式：
第一节 酶促反应动力学
第三章 酶的分离纯化
酶分离纯化的目的
酶分离纯化的目的是使酶制剂 产品达到应用所需的纯度。
分离纯化过程包括3个基本步骤：
1 抽提 2 纯化 3 制剂
Crude product concentration versus selling price (Dwyer, 1984)
第一节 酶促反应动力学
对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度[S]下，反应速度（v）直接 与底物浓度[S]成正比；在高底物浓度[S]下，速度趋向于最大值（Vmax），此时反应速 度与底物浓度[S]无关（如图2-1）。
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第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。
一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1. 防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。
一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。
常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。
二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1. 细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。
2. 抽提3. 纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
1. 机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。
物理破碎法包括如下几种方法；1. 温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。
即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。
温度差破碎法对那些较脆弱易破的细胞破碎效果较好。
超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。
同时受细胞浓度、溶液粘度，pH值、温度以及离子强度等因素的影响，必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。
一般操作条件为：音频10kHz或20kHz；功率100、150W；温度0～10℃；pH4~-7；处理时间3 ～10min，最好间隔几次操作；细胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破碎。
超声波破碎在实验室应用具有简便、快捷、效果好等特点，特别适用于微生物细胞的破碎。
但要在大规模工业生产中应用，困难很多。
化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变而破坏的方法。
化学破碎法中，常用的化学试剂有：有机溶剂和表面活性剂。
在一定条件下，通过外加的酶或细胞自身存在的酶的作用，使细胞破碎的方法称为酶学破碎法。
第三节酶的抽提酶的抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。
一、酶抽提的主要方法二、酶提取过程中应注意事项根据酶提取时，所采用的溶剂或溶液的不同，酶抽提的方法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取，有机溶剂提取等。
1．盐溶液提取：大多数酶在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加，即盐溶，但盐浓度不能太高，否则溶解度反而降低，即盐析。
故：一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度控制在0.02—0.5mol/L。
例如：用固体发酵生产的麸曲中的α--淀粉酶，糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol ／L的氯化钠溶液或0.02～0.05mol／L的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用0.5～0.6mol／L的磷酸氢二钠溶液提取；有少数酶，如霉菌产生的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。
在酶的提取过程中，为了提高提取率并防止酶变性失活，须注意以下几点：1．温度：通常抽提温度应控制在0-10o C（0-4o C）。
对某些耐温的酶，如胃蛋白酶等，可适当提高抽提温度，在37o C下保温抽提，效果较好。
因为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提取。
第四节酶的纯化一、酶纯化的一般原则二、酶纯化中常用方法概述三、沉淀分离法四、离心分离法五、过滤与膜分离六、层析分离七、电泳分离八、酶的结晶九、浓缩与干燥十、酶纯化实例三、沉淀分离法沉淀分离是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离。
在酶的分离纯化中，经常采用此法。
沉淀分离的方法有很多，如盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等。
1．盐析沉淀法2．等电点沉淀法3．有机溶剂沉淀法4．复合沉淀法（选择性沉淀法）四、离心分离法离心是借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术，是酶的纯化过程中最为常用的一种方法。
进行离心分离时，应根据欲分离物质的大小，密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
1．离心机种类及用途2．离心方法选择3. 离心条件的确定五、过滤与膜分离1. 概述2. 粗滤3．膜分离技术六、层析分离1．概述2. 吸附层析3．离子交换层析4．分子筛凝胶层析5．亲和层析七、电泳分离1、电泳基本原理2、影响电泳因素3、主要电泳技术八、酶的结晶结晶是使溶质呈晶态从溶液中析出的过程，它是酶和蛋白质等生物大分子分离，纯化方法之一。
同时，结晶化合物也是生物大分子结构分析研究的材料。
1、蛋白质和酶结晶条件2、结晶方法九、浓缩与干燥浓缩与干燥都是使酶与溶剂（通常是水）分离的过程，是酶分离纯化过程中不可缺少的环节之一。
1. 浓缩2.干燥一、酶纯化的一般原则在酶的提取液中，不可避免地杂有其它小分子和大分子物质，其中，小分子杂质在相继的纯化步骤中一般会自然地除去；而大分子杂质包括有：核酸、粘多糖、其它蛋白质。
其中核酸和粘多糖易干扰后面的纯化、故最好预先除去。
核酸可加硫酸链霉素，聚乙烯亚胺，鱼精蛋白或MnCl2等，使之沉淀移去，也可使用核酸酶降解。
粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理。
余下就剩杂蛋白，而纯化的主要工作，也是较困难的工作，就是要将酶从杂蛋白中分离出来。
在进行酶与杂蛋白分离工作时，为获得较好的分离效果，应注意以下基本原则：二、酶纯化工作中常用方法概述现有的纯化方法都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异以及酶的生物特性为依据而建立的，主要有如下几类：1．根据溶解度建立的方法：盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀法及选择性沉淀法，等电点沉淀法等。
2．根据分子颗粒大小、重量差别建立的方法：离心法、凝胶过滤法、超过滤法。
1. 盐析沉淀法（1）盐析法的原理：根据球蛋白在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增加，表现为“盐溶”，而随着盐浓度继续升高，并超出某一上限时，其溶解度又会以不同速度下降，表现为“盐析”的这一特性，由于酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中，其溶解度存在差别而建立的一种纯化方法。
在盐析条件下，蛋白溶解度与溶液离子强度间有如下关系：b. 加固体（NH4）2SO4：当蛋白溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时，以加固体（NH4）2SO4为宜，加入量可查表，也可以下式计算：W = （g）式中：W：1升S1饱和度溶液提高到S2饱和度时，需加固体（NH4）2SO4的量（g）S2、S1：分别为需达到的和原来溶液的（NH4）2SO4饱和度，A、B：常数，与温度有关，0o C时，A=0.27、B=70720o C时, A=0.29、B=756（3）盐析时的pH控制：控制盐析pH可以提高纯化效果，一般盐析pH宜接近待纯化酶的等电点。
因为等电点时，蛋白质或酶的溶解度最低，有利于盐析。
另外，有些酶易与杂蛋白形成某种结合，从而干扰盐析，可控制pH<5或pH>9，使它们带相同电荷，以减少络合物形成，改善盐析效果。
（4）盐析时温度控制：盐析温度以4o C为宜。
此条件下酶溶解度低而稳定性强（5）盐析时的蛋白质浓度控制：蛋白质浓度是盐析时一个十分重要但又易被忽视的因素。
一般蛋白浓度<100ug/ml，盐析沉淀很难形成，而当200ug/ml<蛋白浓度<1mg/ml，沉淀虽能形成，但耗时，且回收率不高。
因此为获得较好的盐析效果，蛋白浓度应在1mg/ml以上。
b. 分级沉淀：由于各种酶及某蛋白在不同浓度的盐溶液中，溶解度不同，故可采用分级沉淀法将其逐渐剥离。
例如：兔肝SOD分离时，采用如下分的沉淀步骤：反抽提法为：先加（NH4）2SO4至50%饱和度，得沉淀，再将沉淀悬浮于42%饱和度（NH4）2SO4液中，溶解杂蛋白，而沉淀物即为RNA聚合酶。
反抽提法较一般分级沉淀法，具有一定的优越性：①许多蛋白质从溶液中析出较为容易，是非特异性的，而要溶解却有相当高的特异性，故反抽提法可以比较细致地除去杂蛋白。
②反抽提法提取，酶不易失活，可能是因为酶蛋白在非溶解状态较能抵御蛋白酶攻击的缘故。
2. 等电点沉淀法（1）等电点沉淀法原理：两性电解质在等电点时，溶解度最低，而不同的两性电解质是不同等电点，由此可将酶纯化。
3. 有机溶剂沉淀法（1）有机溶剂沉淀法原理：利用不同蛋白质在有机溶剂中溶解度不同而使之分离的方法为有机溶剂沉淀法。
沉淀原理如下：a.有机溶剂降低溶液的介电常数由于分子间的引力是与溶剂的介电常数成反比，而有机溶剂能降低溶液的介电常数，加入有机溶剂，蛋白质分子间引力增加，溶解度降低。
（3）温度控制：大多数蛋白质遇有机溶剂很不稳定，特别是在温度较高（室温）时，极易变性失效，故操作应在0o C以下进行。
有机溶剂必须先冷到-20o C—-15o C，并在搅拌下缓慢加入，沉淀析出后应尽快在低温下离心分离。
（4）pH控制：pH以接近目的酶的等电点为宜。
（6）有机溶剂沉淀法的优缺点a. 优点：沉淀易于分离，过滤，分辨率高，且有机溶剂易除去或回收，适用于食品工业用酶制剂的制备。
b. 缺点：易引起酶变性失活，故必须在低温下操作且析出沉淀要尽快分离，分离出的沉淀物应立即用水或缓冲液溶解，以尽量减少沉淀中有机溶剂的含量。
4．复合沉淀法（选择性沉淀法）（1）复合沉淀法原理：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀，再用适当方法将酶从复合物中重新析出，此即为复合物沉淀法。
（2）酶沉淀剂：能与酶形成复合物沉淀的物质称为酶（蛋白质）沉淀剂，常用的有单宁、聚丙烯酸等高分子聚合物。
聚丙烯酸（Polyalrylic acid，PAA）PAA+酶PAA-酶↓PAA-酶+Ca2+PAA-Ca2+↓+酶PAA- Ca2++SO42-CaSO4+PAA（可循环使用）1．离心机种类及用途（1）常速离心机：转速8000r/min，用于细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒的分离。
（2）高速离心机：转速10000～25000r/min，用于各种沉淀物、细胞碎片及较大细胞器的分离。