手足口病预防控制指南(2009版)附件1 手足口病标本采集及检测技术方案
手足口病标本采集
手足口病样品的采集
一、样品采集生物安全的要求
手足口病采样器采样中避免污染对于人员和标本都是至关重要的，应采用防护措施，注意安全操作。
基本的安全要求如下：
采样戴手套
采样中尽可能穿防护服
污染的材料应先消毒后清洗或消毒后废弃
使用口罩、用于防止有传染力的可吸入病原
二、手足口病采样器材的要求：
拭子：应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做杆。
不能使用棉拭子收集标本。
标本采集管应包含3毫升病毒运输液
采样管：外螺旋口、耐－70℃冻存
采样液：无菌病毒保存液
三、手足口病采集的样品
核酸检验应在发病初期和急性期采样，因为此时病毒在体内大量繁殖，检出率高，病毒分类标本最好在发病1～2天内采取。
1.脑脊液、咽拭子、粪便或肛拭子或疱疹液内的粪便标本，用于病原检测。
粪便标本采集量5~8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
2．血清学检验
病人血清中特异性IgM抗体阳性，或急性期与恢复期血清IgG抗体有4倍以上的升高。
三、样品的储存和运送
所有呼吸道标本应保存在4℃，并尽快放置在-70℃。
如果没有-70℃度冰箱，标本应保存在4℃，但不应超过4天
手足口病病人样品采集、保存标准一览表
（1）采集新发或新入院病人的相关标本；
（2）样品采集时，如果标本需分装或分地检测，注意适当增加单份样品采集量；（3）采样时，做好样品登记工作，详细记录病人姓名、性别、年龄、发病时间、采样时间、主要临床表现、是否用药等信息，并注意和个案调查资料相匹配。
09年版手足口病防治指南
2009年手足口病防治指南[核心提示]怎样做好手足口病的预防工作呢？首先，要加强幼托机构的日常卫生管理，及时发现和隔离患者是预防和防止流行的主要措施。
平时要加强晨间检查，定期对毛巾、水杯、玩具、食具消毒，培养良好个人卫生，饭前便后要洗手，教室、居室要经常开窗通风，保持室内空气新鲜等。
其次，发生病人后要采取措施。
病人及时隔离治疗，一般隔离2周，对被病人接触污染过的毛巾、水杯、玩具、食具、便器等物品要予以消毒。
对病人的鼻咽分泌物、粪便也要消毒。
要加强晨间检查，对密切接触者加强医学观察，注意观察密切接触者有无发热、皮疹等情况，减少与其他班级并班的机会。
对所在班级要进行空气消毒，密切接触者可服用板兰根冲剂。
班级老师和保健老师一定要做好家访工作。
一、疾病概述手足口病（Hand, foot and mouth disease, HFMD）是由肠道病毒引起的传染病，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。
引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型（Cox A16）和肠道病毒71型（EV 71）最为常见。
该病的潜伏期为2～7天，传染源包括患者和隐性感染者。
流行期间，患者为主要传染源。
患者在发病急性期可自咽部排出病毒；疱疹液中含大量病毒，破溃时病毒溢出；病后数周，患者仍可自从粪便中排出病毒。
该病传播方式多样，以通过人群密切接触传播为主。
病毒可通过唾液、疱疹液、粪便等污染的手、毛巾、手绢、牙杯、玩具、食具、奶具以及床上用品、内衣等引起间接接触传播；患者咽喉分泌物及唾液中的病毒可通过飞沫传播；如接触被病毒污染的水源，亦可经水感染；门诊交叉感染和口腔器械消毒不合格亦是造成传播的原因之一。
人群对引起手足口病的肠道病毒普遍易感，感染后可获得免疫力。
手足口病标本采集方法(1)
手足口病标本采集方法
4.1 咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
4.2 鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。
上述两根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
4.3 鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。
将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小孩导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。
4.4 咽漱液：用10ml不含抗菌素的采样液漱口。
漱口时让患者头部微后仰，发“噢”声，让洗液在咽部转动。
然后将咽漱液收集于50ml无菌的螺口塑料管中。
无条件的可用平皿或烧杯收集咽漱液并转入10ml螺口采样管中。
中山二院手足口病报病、标本采集送检指引
中山二院手足口病报病、标本采集送检指引一、报病1.发现手足口病患者时，要在《中华人民共和国传染病报告卡》中“丙类传染病”一栏中填报，报告病例分“疑似病例”、“临床诊断病例”和“实验室诊断病例”，报告卡于24小时内送至院感办进行网络直报；若为幼托儿童或学生，报告卡上“工作单位”一栏需写明幼儿园或学校的名称、班级；2.发现重症病例，立即电话报告院感办，并在传染病报告卡“备注”栏中注明“重症”；发现聚集性病例，亦需先电话报告院感办。
二、标本采集送检（一）采样对象：重症或聚集性病例必须采样，轻型散发病例可不必采样送检。
（二）检测项目1.血清学检测（血清标本）2.病毒分离培养（采集粪便、咽拭子、疱疹液或脑脊液标本）3.病毒核酸检测（采集粪便、咽拭子、疱疹液或脑脊液标本）（三）采样方法1.血清标本：采集急性期（发病0~3d）和恢复期（发病14~30d）双份配对血清用于抗体检测。
静脉采血，干燥管3~5ml，血自凝后冷藏送检。
2.粪便标本：采集病人发病7日内的粪便标本5~8g，采集后立即放入采便管内。
3.咽拭子标本：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用专用采样棉签拭抹咽后壁和扁桃体部位，避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3~5ml保存液的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。
4.疱疹液：先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，可同时采集多个疱疹作为一份标本，迅速将棉签放入内装有3~5ml保存液的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。
脑脊液标本：出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本1.0~2.0ml，采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中。
（四）标本送检地点：广州市疾病预防控制中心收样室（24小时收样）地址：中山三路23号联系电话：83811820（五）标本送检要求：标本采集后须密封冷藏，立即送检，附上《手足口病例标本送检登记表》，由输送中心跟二线车送检。
中医药防治手足口病临床技术指南（2009年版）
中医药防治手足口病临床技术指南（2009年版）中医药防治手足口病临床技术指南（2009年版）（卫生部办公厅、国家中医药管理局办公室印发）手足口病是由多种肠道病毒引起的常见传染病，多见于婴幼儿，历年均有发生，中医药在临床实践中积累了一定的经验。
参照卫生部颁布的《手足口病诊疗指南（2008年版）》，在总结中医药治疗手足口病临床经验的基础上，结合今年部分地区患者的临床特点及中医药的使用情况，特制定本指南。
一、证治方案手足口病属于中医“温病”范畴，湿热疫毒经口鼻而入，发于手足，上熏口咽，外透肌肤，发为疱疹，并见发热、倦怠、恶心、便秘等症状；或邪毒内陷，出现高热、抖动、肢体痿软，甚则发生喘、脱，危及生命。
婴幼儿系稚阴稚阳之体，感受疫毒后，病情变化迅速，宜早发现，早治疗，防变证。
（一）普通型临床主要表现为：发热，口腔黏膜出现散在疱疹，手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹，疱疹周围可有红晕，伴咽痛、流涎，倦怠，纳差，大便多秘结，舌淡红或红，苔腻，脉数，指纹红紫。
治法：清热解毒，化湿透邪。
参考处方：金银花、野菊花、黄连、生石膏（先下）、知母、紫草、白茅根、青蒿、藿香、生甘草，药物用量根据患儿年龄、体重、病情等酌定。
用法：水煎分3—4次口服，或灌肠、直肠点滴。
加减：1．高热、抖动、易惊加羚羊角粉冲服；2．便秘加生大黄；3．咽喉痛加元参、板蓝根；4．咳嗽加杏仁、炙杷叶。
中成药：蓝芩口服液、小儿豉翘颗粒、清开灵口服液、黄栀花口服液、金莲泡腾片，也可选用炎琥宁注射液、痰热清注射液等。
（二）重型1．临床主要表现为：高热不退，汗少，疹出不畅，嗜睡易惊，呕吐，肌肉瞤动，或见肢体痿软、无力，甚则昏睡等，舌红，苔厚腻，脉细数，指纹紫暗。
治法：清热祛风。
参考处方：生石膏、生大黄、栀子、滑石（包煎）、寒水石、桂枝、生龙骨、生牡蛎、赤石脂、广地龙、全蝎、羚羊角粉（冲服），药物用量根据患儿年龄、体重、病情等酌定。
用法：水煎分3～4次口服，或可灌肠、直肠滴注。
手足口病预防控制指南(2009版)
手足口病预防控制指南(2009版)
卫生部
【期刊名称】《全科医学临床与教育》
【年(卷),期】2010(008)002
【摘要】@@ 手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病,是我国法定报告管理的丙类传染病.大多数患者症状轻微,以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状.
【总页数】4页(P125-127,133)
【作者】卫生部
【作者单位】
【正文语种】中文
【相关文献】
1.卫生部办公厅关于印发《手足口病预防控制指南(2009版)》的通知 [J],
2.手足口病预防控制指南(2008年版) [J],
3.卫生部发布手足口病预防控制指南将手足口病纳入法定传染病管理 [J], 中远
4.手足口病预防控制指南(2009版) [J],
5.《手足口病诊疗指南(2018版)》解读——手足口病的一般治疗与病因治疗 [J], 蒋荣猛;杨涛;邓慧玲;李兴旺;陈强;尚云晓;吴星东;杨巧芝;俞蕙;张婷
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《手足口病预防控制指南》
肠道病毒消毒方法
二、消毒方法的适用 （一）粪便：可用生石灰以1:1的比例与其搅拌均匀消毒。 （二）食、饮具：用250毫克/升有效氯含氯消毒剂溶液浸泡30分钟。 （三）生活用具、玩具、校舍、书籍：用500毫克/升含氯消毒剂溶液擦 拭消毒，作用时间30分钟，或用0.3%过氧乙酸作用60分钟，或用紫外线 灯直接照射30分钟。 （四）患者衣、被单：阳光下暴晒或煮沸20分钟或用500毫克／升有效氯 含氯消毒剂浸泡30分钟。 （五）盛放排泻物的容器：用500毫克／升有效氯含氯消毒剂浸泡120分 钟。 （六）饮用水：用1～3毫克/升有效氯含氯消毒剂如漂白粉、优氯净等作 用30分钟。 （七）灭蝇：可用5%氯氰菊酯（奋斗呐）、2.5%溴氰菊酯或其他杀虫剂， 按说明书使用。 （八）生活污水：用50毫克/升有效氯含氯消毒剂作用120分钟。 （九）垃圾：用1000毫克/升有效氯含氯消毒剂溶液喷雾作用120分钟。
托幼机构及小学
等集体单位的预防控制措施
ห้องสมุดไป่ตู้
1. 本病流行季节，教室和宿舍等场所要保持 良好通风； 2. 每日对玩具、个人卫生用具、餐具等物品 进行清洗消毒； 3. 进行清扫或消毒工作（尤其清扫厕所）时， 工作人员应穿戴手套。清洗工作结束后应立 即洗手； 4. 每日对门把手、楼梯扶手、桌面等物体表 面进行擦拭消毒；
实验室检测
如有重症病例，应尽量对所有重症病例进行标 本采集及实验室检测。 如有暴发疫情应采集全部病例的标本进行病原 检测。 采集标本时应同时收集病例的相关信息，填写 个案调查表。
标本采集种类、运输和保藏
（一）粪便标本 采集病人发病7日内的粪便标本，用于病 原检测。粪便标本采集量5～8g/份，采 集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立 即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温 冷冻保藏，需长期保存的标本存于－ 70℃冰箱。
手足口病标本采集技术方案
手足口病标本采集技术方案标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]手足口病标本采集技术方案一、采集标本的种类、保存和运输（一）粪便标本。
采集病人发病 3 日内的粪便标本，用于病原检测。
粪便标本采集量 5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4℃暂存 12 小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。
（二）咽拭子标本。
采集病人发病 3 日内的咽拭子标本，用于病原检测。
用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）15ml 外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。
4℃暂存在 12 小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。
（三）血清标本。
各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。
采集急性期（发病 0-7d）和恢复期（发病 14-30d）双份配对血清用于阐明和分析 EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。
静脉采集 3-5ml 全血，于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。
将血清于-20℃以下冰箱中冷冻保存。
（四）疱疹液。
在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。
先用 75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
附件1 手足口病标本采集及检测技术方案一、采集标本的种类、保存和运输（一）粪便标本。
采集病人发病3 日内的粪便标本，用于病原检测。
粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4℃暂存12 小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。
（二）咽拭子标本。
采集病人发病3 日内的咽拭子标本，用于病原检测。
用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml 保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。
4℃暂存并在12 小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。
（三）血清标本。
各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集EV71 和CV A16感染的手足口病患儿的双份血清。
采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CV A16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。
静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml 外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。
将血清置于-20℃以下冰箱中冷冻保存。
（四）疱疹液。
在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。
先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。
所采集标本4℃暂存立即（12h 内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
（五）肛拭子标本。
采集病人发病3日内的肛拭子标本，用于病原检测。
用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有3－5ml保存液（含5%牛血清细胞维持液）的15ml外螺旋的采样管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。
在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。
（六）尸检标本。
采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。
每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结 2 个，分别置于15ml-50ml 无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。
（七）脑脊液标本。
出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。
采集时间为出现神经系统症状后 3 天内，采集量为1.0-2.0ml。
采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h 内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
但EV71 感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到EV71病原。
临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。
标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室。
依照《人间传染的病原微生物名录》，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。
可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。
在送到省、地、市级CDC实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。
在上送标本的同时，需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》。
二、标本采集注意事项在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离到病毒即可诊断该病毒为病因。
用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，如含5%牛血清维持液。
用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。
为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。
不能立即检测的标本应冷冻保存。
对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。
标本保存液的配置见下表：保存液Eagle`s 液(MEM) 80.5ml3%L-谷氨酰胺200mM 1.0ml胎牛血清 5.0ml7.5%NaHCO3溶液 3.5ml青、链霉素10ml（各10000U/ml）三、实验室检测操作流程（一）病毒分离。
1.试剂配置（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：生长液（GM）维持液（MM）Eagle`s 液(MEM) 86.5ml 92.5ml3%L-谷氨酰胺200mM 1.0ml 1.0ml胎牛血清10.0ml 2.0ml7.5%NaHCO3溶液 2.5ml 3.5ml青、链霉素 1.0ml 1.0ml（各10000U/ml）（2）粪便标本和肛拭子的处理液完全PBS 液中加入P．S 溶液，终浓度为青霉素100 单位/ml，链霉素为100μg/ ml。
完全PBS 液的配置：取以下 1 份 B 液和 1 份 C 液加到8 份 A 液中即为完全PBS工作液。
A液：试剂品名加入量NACL 8.00gKCL 0.20gNa2HPO4(无水) 0.91gKH2PO4 0.12g用600～800ml蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至1000ml，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌，即为不完全PBS工作液（不含钙、镁离子）。
B液：溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。
C液：溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。
2．病毒分离细胞系许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CV A16）生长。
对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CV A16 等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系： RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。
HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。
3．标本的处理（1）粪便标本和肛拭子的处理操作步骤：1）在离心管上标记标本号；2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为2ml；4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－20℃；5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；7）在生物安全柜中将每1 份标本的上清液分别吸入2 个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理1次）；8）1 管粪便悬液冻存于－20℃作为备份，另1 管存于4-8℃以备接种。
（2）疱疹液标本的处理疱疹液标本通常直接用于RNA提取或病毒分离。
（3）脑脊液标本的处理脑脊液标本通常直接用于病毒分离。
（4）咽拭子标本的处理咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40 下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。
然后在4℃条件下，10000 rpm 离心20min，用上清接种到细胞上或直接提取RNA。
如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。
4．接种和观察（病毒分离）（1）通常使用８ml的斜面试管培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液1.5ml。
显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康、无污染的。
一个健康的单层细胞会在传代后48小时左右形成；（2）倒掉生长液（GM），换上1-1.2ml的维持液（MM）；（3）每一份标本需要同时接种 2 支RD 细胞和 2 支HEp-2 细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36℃。
（或者使用吸附的方法接种病毒：接种标本前，倒掉生长液（GM），每支试管接种0.2ml 的标本悬液，培养温度为36℃；吸附 1 小时后，换上1.5ml的维持液（MM）。
同样每份标本需同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞。
（6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+—4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+，<25%; 2+, 25%-50%; 3+, 50%-75%; 4+, 75%-100%）；（8）如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化（3+ CPE），然后储藏在－20℃以备二次传代；（9）第一代培养见可疑细胞病变时应继续传代，待细胞病变稳定出现后－20℃或－70℃冻存；（10）一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE 出现，将病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。
因二代病毒滴度高于一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定；（11）如果7d之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d。
（注意：同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培养物应单独传代）；（12）盲传两代后，仍然没有出现CPE的，则判定为阴性；（13）注意：如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。
取100μl 阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐1h后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应；（14）几个概念：A：毒性反应：如果在接种后1-2d 内细胞快速凋亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。
这些已接种标本的试管应在-20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。
如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中。
这时应被认为是第一代。
B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE 无法确定或根本无法出现。
重新取原始标本，用氯仿或抗生素处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。
C：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。
这时已接种标本的试管应在-20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察7-10d。
如果盲传两代后仍然没有产生CPE，那么认为这个标本是阴性的。
5．病毒分离结果解释RD 细胞支持HFMD 的主要病原体——CV A16 和EV71 等多种肠道病毒的复制，CV A16和EV71均能在RD细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。