细胞的破碎与分离包涵体
(整理)包涵体的分离纯化.
包涵体的纯化和复性总结（二）关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
包涵体的复性总结
包涵体的复性总结关于包涵体的复性是一个令人头疼的问题,已经成为生物制药的瓶颈,包涵体的复性前期准备工作尤为重要,关于包涵体的处理一般包括这么几步:菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化,实验内容比较庞杂、繁琐。
一、菌体的裂解菌体的破碎方法很多:高速组织捣碎、玻璃匀浆器匀浆、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法。
无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,不同的菌体蛋白需要加入不同的抑制剂:二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,而且应该在破碎的同时多加几次;另外,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使用这些条件时都要适合于目的物质的提取。
在实验室研究多采用超声波处理法和匀浆器匀浆法。
二、包涵体的洗涤通常的洗涤方法一般是难以洗干净的,包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂,如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强,在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜。
根据不同的菌体选用与之相应的洗涤液,比如:2 M尿素+50mm Tris-HCl+0.2 mM NaCl +1%Triton x-100+2mmEDTA PH8.0,再用缓冲洗涤一次。
此外,刚处理完的包含体好溶解,冷冻后难溶解,且溶解时间和比例都会加大。
三、包涵体的溶解强的变性剂如尿素、盐酸胍,是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂,可以破坏蛋白内的疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。
包涵体纯化方法及包涵体蛋白制备
包涵体纯化方法及包涵体蛋白制备重组蛋白在大肠杆菌、酵母、哺乳动物中的表达可分为三种形式：胞外分泌表达、胞内可溶性表达和胞内不溶性表达（即产物以包涵体形式存在）。
以包涵体形式存在的重组蛋白是无生物活性的，需要进行复性处理，然后再进行分离纯化。
包涵体纯化与传统生物大分子的分离纯化方法相似，即以分子的等电点、溶解性、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等特征为基础进行纯化。
一、常用的包涵体纯化方法1. 金属亲和层析该方法主要利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和金属离子之间的相互作用来进行蛋白纯化。
我们在载体构建时可以加上一些亲和性标签（如His标签、GST标签、Flag标签等），以便采取亲和纯化的方式纯化蛋白。
利用Ni2+和6×His tag之间的亲和性，通过在蛋白的N端或C端加上6～10个组氨酸，在一般或变性条件下借助它与Ni2+螯合柱的紧密结合能力，采用咪唑洗脱，或降低PH使组氨酸充分质子化，使其不再与Ni2+结合，从而分离纯化出带有6×His tag的融合蛋白，纯度通常能达到90%以上。
2．离子交换层析离子交换层析是根据在一定pH条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离的方法。
常用的离子交换剂有羧甲基纤维素（阳离子交换剂，弱酸型）和二乙基氨基乙基纤维素（阴离子交换剂，弱碱型）。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，需要通过提高洗脱液中的盐浓度等措施将其洗脱下来。
根据蛋白质结合能力不同，洗脱的速度会存在差异，通常结合较弱的蛋白质先被洗脱。
反之，阳离子交换基质会结合带有正电荷的蛋白质，可以通过提高洗脱液的PH或增加洗脱液中的盐浓度将蛋白洗脱下来。
3．凝胶过滤层析凝胶过滤层析通常又称为分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状达到分离和纯化的目的。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
此方法的优点在于层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷并且吸附力弱，可较广的温度范围内进行。
生化工艺——第二章细胞破碎
²
第二节
细胞壁的破碎
一、珠磨破碎 破碎原理：利用在高速搅拌作用下， 破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相 被破碎。 互磨擦碰撞而受剪切力被破碎。 破碎作用遵循一级动力学定律： 破碎作用遵循一级动力学定律：
1 ln = kt 1− x
特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低， 特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力； 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。
1 − x = exp( − kt )
影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广； 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大， 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大，多 在实验室使用。 在实验室使用。
细胞壁的破碎方法总结
方法 机 械 法 技术 原理 效果 成本 举例 动物组织及 动物细胞 匀浆法（片型） 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器 劈碎 研磨法 超声波法 细胞被研磨物 磨碎 用超声波的空 穴作用使细胞 破碎 适中 适中 适中 便宜 适中 昂贵 细胞悬浮液 小规模处理 细胞悬浮液 大规模处理
匀浆法（孔型） 匀浆法（孔型） 须使细胞通过 的小孔， 的小孔，使细 胞受到剪切力 而破碎 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠 或铁珠捣碎
总结 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠 磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机适用范围较广，可用于酵母和细 菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.
三、超声波破碎 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用， 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生 使细胞破碎。 极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 ²
包涵体解决办法
2 ）包涵体的分离蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可用Triton-X100/ EDTA 或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。
（1）试剂与配制①洗涤液I：0.5 % Triton X -10010 mmol / L EDTA (pH 8 .0 )溶于细胞裂解液中。
②2×凝胶电泳加样缓冲液。
（2）细胞裂解混合物12 000g 离心，15 min ,4 ℃；弃上清，沉淀用9×洗涤液l 悬浮；室温放置5 min ; 12 000g 离心15 min ,4 ℃；吸出上清，用1 00 μL 水重新悬浮沉淀；分别取10 μL上清和重新悬浮的沉淀，加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS-PAGE 。
3 ）包涵体的溶解和复性（1）试剂与配制①缓冲液I：1 mmol / L PMSF8mol /L 尿素10 mmol / L DTT溶于前述裂解缓冲液中。
②缓冲液Ⅱ：50 mmol / L KH2PO41 mmol / L EDTA (pH 8 .0 )50 mmol / L NaCI2 mmol / L 还原型谷胱甘肽1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽③KOH 和HCI 。
④2×凝胶电泳加样缓冲液。
（2）用100 μL 缓冲液I 溶解包涵体；室温放置lh ；加9×缓冲液Ⅱ，室温放置30 min ，用KOH 调pH 到10.7 ；用HCI 调至pH 8 .0 ，在室温放置至少30 min ; 1000g 离心，15 min ，室温；吸出上清液并保留，用100 μL 2×凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀；取10 μL 上清，加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液，与20 μL 重新溶解的沉淀进行SDS-PAGE 。
四、注意事项（1）不同的大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分。
《生化分离工程》思考题及答案
《生化分离工程》思量题及答案第一章绪论1、何为生化分离技术？其主要研究那些内容？生化分离技术是指从动植物组织培养液和微生物发酵液中分离、纯化生物产品的过程中所采用的方法和手段的总称。
2、生化分离的普通步骤包括哪些环节及技术？普通说来，生化分离过程主要包括 4 个方面：①原料液的预处理和固液分离，常用加热、调 PH、凝结和絮凝等方法；②初步纯化(提取)，常用沉淀、吸附、萃取、超滤等单元操作；③高度纯化(精制)，常选用色谱分离技术；④成品加工，有浓缩、结晶和干燥等技术。
3、生化分离工程有那些特点，及其重要性？特点： 1、目的产物在初始物料(发酵液)中的含量低； 2、培养液是多组分的混合物，除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物(几百上千种)、培养基成份、无机盐等； 3、生化产物的稳定性低，易变质、易失活、易变性，对温度、pH 值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感； 4、对最终产品的质量要求高重要性：生物技术产品普通存在于一个复杂的多相体系中。
惟有经过分离和纯化等下游加工过程，才干制得符合使用要求的产品。
因此产品的分离纯化是生物技术工业化的必需手段。
在生物产品的开发研究中，分离过程的费用占全部研究费用的 50％以上；在产品的成本构成中，分离与纯化部份占总成本的 40~80％；精细、药用产品的比例更高达 70~90％。
显然开辟新的分离和纯化工艺是提高经济效益或者减少投资的重要途径。
5、为何生物技术领域中往往浮现“丰产不丰收”的现象？第二章预处理、过滤和细胞破碎1、发酵液预处理的目的是什么？主要有那几种方法？目的：改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速率；出去大部份可溶性杂质，并尽可能使产物转入便于以后处理的相中(多数是液相)，以便于固液分离及后提取工序的顺利进行。
：①加热法。
升高温度可有效降低液体粘度，从而提高过滤速率，常用于粘度随温度变化较大的流体。
控制适当温度和受热时间，能使蛋白质凝结形成较大颗粒，进一步改善发酵液的过滤特性。
包涵体的提取实验报告
一、实验目的1. 学习包涵体蛋白的提取方法。
2. 掌握包涵体蛋白的纯化技术。
3. 了解包涵体蛋白的分离和鉴定。
二、实验原理包涵体是细菌在表达外源蛋白时，由于蛋白折叠错误而形成的无活性蛋白聚集体。
本实验通过裂解细菌细胞，提取包涵体蛋白，然后对其进行纯化、分离和鉴定。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）BL21(DE3)pLysS大肠杆菌菌株，含有待表达的外源蛋白基因。
（2）裂解缓冲液：50 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM EDTA。
（3）蛋白上样缓冲液：50 mM Tris pH 6.8，2% SDS，10% β-巯基乙醇，0.1% 亮蓝R250。
（4）SDS-PAGE凝胶制备试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、SDS、甘氨酸等。
（5）电泳设备：垂直电泳仪、电泳槽、电源等。
（6）层析设备：层析柱、层析板、紫外检测仪等。
2. 实验仪器：（1）超声波破碎仪（2）离心机（3）恒温水浴锅（4）移液器（5）微量移液器（6）紫外分光光度计（7）凝胶成像系统四、实验步骤1. 菌株培养与诱导表达（1）将BL21(DE3)pLysS大肠杆菌菌株接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜。
（2）将过夜培养的菌液按1:100比例接种于LB液体培养基中，37℃培养至OD600约为0.6。
（3）加入IPTG诱导剂，使终浓度为0.5 mM，37℃培养4小时。
2. 包涵体蛋白的提取（1）将诱导表达的菌液在冰浴中冷却30分钟。
（2）将菌液以5000 rpm离心10分钟，收集菌体。
（3）将菌体用裂解缓冲液重悬，超声破碎45秒，重复两次。
（4）以10000 rpm离心30分钟，收集上清液。
3. 包涵体蛋白的纯化（1）将上清液加入等体积的蛋白上样缓冲液，煮沸5分钟。
（2）以10000 rpm离心5分钟，收集沉淀。
（3）将沉淀用蛋白上样缓冲液重悬，加入SDS-PAGE凝胶制备试剂，混匀。
4. 包涵体蛋白的分离与鉴定（1）制备SDS-PAGE凝胶，按照分子克隆上的配方，采用变性不连续凝胶电泳。
酶生产的下游工艺—细胞破碎
胞外产物 浓缩 初步分离 高度纯化
制剂 产品
复性
工作任务（一）细胞壁的结构及组成
工作任务（一）细胞壁的结构及组成
各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 物
壁厚 /nm
层次
主要 组成
革兰氏阳 性细菌
15 ~ 50
革兰氏阴性 放线
细菌
菌
10 ~ 13 同G+
酵母菌 100 ~ 300
霉菌 100 ~ 250
单层
肽聚糖 (40% ~
90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
多层
肽聚糖 (5% ~ 10%)
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%) 磷脂 蛋白质
多层
多层
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
珠磨机主体：立式和卧式圆筒型腔体。一般，卧
高
式比立式珠磨破碎效率高：因为立式机中向
速
上流动的液体在某种程度上会使研磨珠流态
珠
化，从而降低其研磨效率。
磨
研磨珠：玻璃(密度为2.5g／cm3)或氧化锆(密度
法
为6.0 g／cm3)微球(粒径约0.1～10mm)，填充
率为80％～85％。
工作任务（二）细胞壁的破碎
高 速 珠 磨 法
原理：细胞和极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合， 珠子之间及珠子与细胞之间互相剪切、碰撞，促使细胞 壁破裂，释放内含物。
工作任务（二）细胞壁的破碎
细胞破碎方法
生产厂商:
瑞士WAB
公司
高
德国西门子
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由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其 强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
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11
细胞破碎
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12
细胞破碎
1.珠磨法（Bead mill）
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13
细胞破碎
高压匀浆器
阀座
阀杆 撞击环 阀杆
3)导电率测定法
细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相， 使导电率上升。
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破碎率的测定
0.05%美蓝染可编色辑pp结t 果
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基因工程包涵体的纯化
基因工程菌培养液不同表达形式的前处理
胞外分泌型表达：离心,收集液相→浓缩→纯化。 胞内表达：
胞内可溶性表达：离心,收集菌体→细胞破碎→离心，收 集上清→纯化
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包涵体表达形式的优点
➢ 在一定程度上保持表达产物的结构稳定; ➢ 能避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集; ➢ 简化外源基因表达产物的分离操作; ➢ 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白
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包涵体表达形式的缺点
以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须 通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因 而具有生物活性）的目标蛋白。 体外复性蛋白质的成功率相当低， 一般不超过 30% 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。
形成原因：
表达量过高、过快
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外源蛋白在大肠杆菌中的积累
蛋白 人胰岛素 β -丙酰胺酶
γ-人体干扰素
凝乳酶原 牛生长激素 β -内酰胺酶 人胰岛素原
产物占菌体总蛋白/%
50% 20% 25%
>30%
5%~26%
外源蛋白的积累 形成包涵体 在细胞间区 形成包涵体 形成包涵体 形成包涵体 形成间区包涵体 形成包涵体
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包涵体的纯化方法
收集菌体细胞 细胞破碎
包涵体的洗涤
目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性
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包涵体获得 几种常见的工艺路线(一)
机械破碎 (高压匀浆、高速珠磨）
离心提取包含体
加变性剂溶解
除变性剂复性
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包涵体获得 几种常见的工艺路线（二）
机械破碎
膜分离获得包涵体
3
细菌细胞壁结构
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4
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back6
酵母细胞壁结构
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一、细胞壁的组成和结构
微生物 革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌 酵母菌
霉菌
壁厚/nm
20-80
10-13
100-300
100-250
层次
单层
多层
多层
多层
主要组 成
肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%）
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包涵体的分离和蛋白质复性
细胞的破碎与分离
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1
概述
➢很多生化产物存在于细胞内(胞内产物)
➢细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非 分泌型成分的基础。
胞内物
分离
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2
概述
药物名称
胰岛素
人生长激素 （HGH）
α--干扰素
宿主 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌
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用途 治疗糖尿病
治疗侏儒病
治疗毛状细胞白血 病和卡波济肉瘤
压力控制手轮
APV Manton Gaulin 高可压 编辑p匀pt 浆器针型阀结构简图 14
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细胞破碎
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀
锥型阀 球型细胞破碎阀
高压匀浆器各种 可编辑阀 ppt 型设计
16
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细胞破碎
超声破碎法（Ultrasonication
在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象 （cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。 空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的 冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪 切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。
胞内周质表达：离心,收集菌体→低浓度溶菌酶或渗透压 冲击等溶解目标物→离心,收集上清液→纯化。
不溶性包涵体：离心,收集菌体→细胞破碎→离心,收集 沉淀→包涵体洗涤→目标蛋白变性溶解→复性→纯化。
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包涵体的分离和蛋白质复性
包涵体：
指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性 的固体颗粒 。
缺点： 通用性差；
时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。
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物理破碎方法
➢渗透压冲击 ➢冻融法
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破碎率的测定
1. 破碎率的测定
1)直接测定法
采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。
2)目的产物测定法
将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的 产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得 的标准数值比较，计算其破碎率。
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18
正常人耳能听到的声音的频率范围
次声
超声
20Hz
20000Hz
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20
细胞破碎
撞击破碎
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化学破碎方法
➢酸碱法 ➢表面活性剂 ➢有机溶剂
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化学破碎方法
化学渗透法优点：
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质 如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍 滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进 一步提取。
加变性剂溶解包含体
除变性剂复性
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35
1）包涵体的洗涤
细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，
还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖 等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分 子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的 弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除 去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达 产物为原则。
肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质
葡聚糖
多聚糖
（30-40%） （80-90%）
甘露聚糖 脂类
（30%） 蛋白质
蛋白质
（6-8%）
脂类
（8.5-
13.5%）
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8
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9
细胞破碎机理图
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10
细胞破碎
细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构 越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及 革兰氏阳性细菌的坚固；