第二章-细胞的分离与破碎-1
S R R max
高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细 胞的破碎，料液细胞浓度可达到20％左右。 团状和系状菌易造成高压匀浆器堵塞，一般 不宜使用高压匀浆法。高压匀浆操作的温度 上升约2～ 3℃／10MPa，为保护目标产物的 生物活性，需对料液作冷却处理，多级破碎 操作中需在级间设置冷却装置。因为料液通 过匀浆器的时间很短，通过匀浆器后迅速冷 却，可有效防止温度上升，保护产物活性。
胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等。 随着重 组DNA技术发展，许多有重要价值的生物产品应运而生， 如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等，基因在宿主细胞内克 隆表达成为基因工程产品，其中许多存在于胞内。
分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得 以释放，才能进一步提取。
细胞的结构
细菌细胞外层结构
微生物 壁厚 /nm 层次
细菌 革兰氏阳性 革兰氏阴性 20～80 单层 肽聚糖 (40%～90%) 多 糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%～4%) 10～13 多层 肽聚糖 (5%～10%) 脂蛋白 脂多糖 (11%～22%) 磷 脂 蛋白质
酵母菌 100～300 多层 葡聚糖 (30%～40%) 甘露聚糖 (30％) 蛋白质 (6%～8%) 脂 类 (8.5%～13.5%)
梯度 离心
1. 两种区带离心法均事先在离心管中用某种 低分子溶质(如蔗糖、甘油等溶液)调配好密 度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液 后进行离心操作。 2. 区带离心的密度梯度一般可用蔗糖配制。 事先调配不同浓度(密度)的蔗糖溶液，然后 在离心管中依浓度从大到小层层加入即可。 将一定浓度的蔗糖溶液经一定时间的高速 离心后可制成连续的蔗糖密度梯度。 3. 区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大 分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限Leabharlann 生产型高压均质细胞破碎机 ：
细胞破碎仪有一个数个往复运动的柱塞，物
料在柱塞作用下进入可调节压力大小的阀组中，
经过特定宽度的限流缝隙（工作区）后，瞬间失 压的物料以极高的流速（1000-1500米/秒）喷出， 碰撞在碰撞阀组件之一的冲击环上，产生三种效 应：空穴效应、撞击效应、剪切效应。经过这三
种效应处理过后，物料粒径可均匀细化到100nm以
形成分被过滤介质截留，在介质表面形成滤饼。
滤液的透过阻力来自两个方面，即过滤介质和 介质表面不断堆积的滤饼。 2. 提高过滤速度和过滤质量是过滤操作的目标。 由于滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素，因
此在过滤操作以前，一般要对滤液进行絮凝或
凝聚等预处理。改变料液的性质，降低滤饼的
阻力。
过滤设备
针式过滤器
离心沉降速度
离心设备的一个重要技术指标是其所能达到的离心
力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量
离心程度的参数，用Z表示
Z
4 N r
2 2
g
式中，r为离心半径，即从旋转轴心到沉降颗粒的距 离，N为离心机的转数(s-1) 。
离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，因 此，将式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs 为 2 2 2 2 d P ( S L ) N r s 9 L
3、溶液中核酸构象的研究
：单链DNA双链DNA 蛋白质 双链DNA RNA 4、核酸的制备 氯化铯密度梯度超离心
超螺旋 DNA
经染料-氯化铯密度梯 度超离心后，质粒DNA 及各种杂质的分布
离心分离设备
1. 离心机是生化实验室及生化工业广泛使用 的分离设备。实验室用离心机以离心管式 转子离心机为主，离心操作为间歇式。 2. 工业离心分离设备中，较为常用的有管式 和碟片式两大类。
珠磨机的种类很多，处理规模跨度很宽，从实验
规模的组织捣碎机，到工业规模的高速珠磨机。
如WAB公司的Dyno Mill KD45C型最大搅拌速度 为1450rpm(圆周线速度20m/s)，破碎室体积45L。 珠磨机连续操作时，兼具破碎和冷却双重功能，
珠磨法
(Bead mill)
水平搅拌式珠磨机
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃珠、石英砂、氧 化锆等研磨剂(直径＜1mm﹞一起快速搅拌或研磨，研磨剂、 珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞受到研磨剪切和 撞击而破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子 被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产 生的热量采用换热冷却带走。
蛋白质的沉降系数
物质 细胞色素 C 肌红蛋白 胰蛋白酶 尿酶酶 卵白蛋白 α -淀粉酶 血红蛋白 伴刀豆蛋白 A(四聚体) IgG IgM 相对分子质量 12 400 16 900 28 000 32 000 45 000 50 000 64 550 102 300 150 000 900 000～1 000 000 沉降系数 S w0 , 20 / S 1.18 2.04 2.5 2.7 3.7 4.5 4.1～4.5 6.0 6.0～7.8 18～20
主要菌体和细胞的离心分离
菌体、细胞 大肠杆菌 酵母 血小板 红血球 淋巴球 肝细胞 大 小 /μ m 2～ 4 2～ 7 2～ 4 6～ 9 7～ 12 20～ 30 离心力 实验室 1 500g 1 500g 5 000g 1 200g 500g 800g 工业规模 13 000g 8 000g — — — —
膜分离介质，微滤分离等
过滤操作
对具体过滤处理的不同对象，应根据下列因素，选 取合适的过滤设备：(1)料液的粘度、腐蚀性；(2)固态悬 浮物的粒度、浓度以及变形性等；(3)目的产物是液体部 分还是悬浮固体等。
过滤速度
1. 过滤操作一般以压力差为透过推动力，只靠重 力不能达到足够大的透过速度。过滤操作中固
目的、需低温操作等特点，细胞破碎器采用了
特殊的结构设计。细胞的机械破碎主要有。
高压匀浆
高压匀浆又称高压剪切破碎。高压匀浆器的
破碎原理是：细胞悬浮液在高压作用下从阀
座与阀杆之间的环隙高速(可达到450m/s)喷
出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击 作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击 力和剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器 的操作压力通常为50-70MPa。
出液口
内装微孔滤膜 进液口
微孔滤膜滤器
2.2.2.3 常用过滤设备 生化分离中，工业规模过滤设备主要有加压叶滤机、板框过 滤机、旋转真空过滤机。
过滤板
1钮
滤框
2钮
洗涤板
3钮
板框式压滤机装置及滤板与滤框的构造
板框式过滤机：适用于要求滤饼较干的场合，不适用于含
挥发性有毒物质或有生物危害的场合。
加压叶滤机
2.2 细胞破碎
生物产物可能存在于细胞壁、细胞膜、细胞
质以及线粒体、核糖体、内质网和高尔基体等细
胞器中。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜
受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释
放其中的目标产物。
胞外产物：微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大 多数小分子代谢物、胞外酶、抗生素、多糖等，直接进行 固液分离，即可进行滤清液的分离。 胞内产物： 某些目的产物不能分泌到细胞外，留在细
或
s
dr dt Sr
2 . N
离心分离法
• 差速离心 • 区带离心
差速离心分级
1. 差速离心(Differential centrifugation)是生化工业
中最常用的离心分离方法。以菌体细胞的收集 或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作 的一种特殊情况，即为一级分级分离。 2. 操作中，根据实际物料的特点(目标产物和其他
g
d p ( S L )g
2
18 L
d 上式为球形粒子的Stokes沉降速度， p 、 s、 L 和 g 分别表示粒径、固体颗粒密度、液 体密度和重力加速度， g 为重力沉降速度， L 为液体粘度。
菌体和动植物细胞的重力沉降虽 然简便易行，但菌体细胞体积很小， 沉降速度很慢。因此，实用上需使菌 体细胞聚并成较大凝聚体颗粒后进行 沉降操作，提高沉降速度。
于实验室水平。
密度梯度离心（density gradient）
生物大分子及颗粒的沉降不仅 决定于它的大小，而且也取决于 它的密度。颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大 的颗粒沉降的快，并且每种蛋白 质颗粒沉降到与自身密度相等的 介质密度梯度时，即停止不前， 最后各自在离心管中被分离成独 立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分 步收集。常用的介质有蔗糖、氯 化铯等。
预处理--细胞的分离与破碎
2.1 细胞分离
• 重力沉降 • 离心沉降 • 过滤
重力沉降
重力沉降是化工过程中常用的气固、 液固和液液分离手段，在生化分离过程 中亦有一定程度的应用。
以液固沉降为例，重力沉降过程中固体颗粒受 到重力、浮力和摩擦阻力的作用。考虑球形的 固体颗粒，则当浮力、摩擦阻力和重力达到平 衡时，固体颗粒匀速沉降，沉降速度为
离心沉降
• 离心类别 • 离心沉降速度 • 离心分离法
• 离心分离设备
离心机的种类和适用范 围
低速离心机 转 速 / rpm 离心力 / g 适 用 范 围 细 胞 细胞核 细胞器 蛋白质 2 000～ 6 000 2 000～ 7 000 适用 适用 — — 高速离心机 10 000～ 26 000 8 000～ 80 000 适用 适用 适用 — 超离心机 30000～ 120000 100000～ 600000 适用 适用 适用 适用
区带转子
分析转子
各种转子
管式离心机
碟片式离心机
过滤
• 过滤速度 • 过滤设备
2.2.2 过滤
采用合适的多孔性过滤介质， 可以过滤截留菌体、细胞和碎片等 悬浮液中的固体离子。 织物状介质，棉花、石棉、蚕丝、
麻、羊毛及各种人造纤维与金属丝等
高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细 胞的破碎，料液细胞浓度可达到20％左右。 团状和系状菌易造成高压匀浆器堵塞，一般 不宜使用高压匀浆法。高压匀浆操作的温度 上升约2～ 3℃／10MPa，为保护目标产物的 生物活性，需对料液作冷却处理，多级破碎 操作中需在级间设置冷却装置。因为料液通 过匀浆器的时间很短，通过匀浆器后迅速冷 却，可有效防止温度上升，保护产物活性。
胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等。 随着重 组DNA技术发展，许多有重要价值的生物产品应运而生， 如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等，基因在宿主细胞内克 隆表达成为基因工程产品，其中许多存在于胞内。
分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得 以释放，才能进一步提取。
细胞的结构
细菌细胞外层结构
微生物 壁厚 /nm 层次
细菌 革兰氏阳性 革兰氏阴性 20～80 单层 肽聚糖 (40%～90%) 多 糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%～4%) 10～13 多层 肽聚糖 (5%～10%) 脂蛋白 脂多糖 (11%～22%) 磷 脂 蛋白质
酵母菌 100～300 多层 葡聚糖 (30%～40%) 甘露聚糖 (30％) 蛋白质 (6%～8%) 脂 类 (8.5%～13.5%)
梯度 离心
1. 两种区带离心法均事先在离心管中用某种 低分子溶质(如蔗糖、甘油等溶液)调配好密 度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液 后进行离心操作。 2. 区带离心的密度梯度一般可用蔗糖配制。 事先调配不同浓度(密度)的蔗糖溶液，然后 在离心管中依浓度从大到小层层加入即可。 将一定浓度的蔗糖溶液经一定时间的高速 离心后可制成连续的蔗糖密度梯度。 3. 区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大 分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限Leabharlann 生产型高压均质细胞破碎机 ：
细胞破碎仪有一个数个往复运动的柱塞，物
料在柱塞作用下进入可调节压力大小的阀组中，
经过特定宽度的限流缝隙（工作区）后，瞬间失 压的物料以极高的流速（1000-1500米/秒）喷出， 碰撞在碰撞阀组件之一的冲击环上，产生三种效 应：空穴效应、撞击效应、剪切效应。经过这三
种效应处理过后，物料粒径可均匀细化到100nm以
形成分被过滤介质截留，在介质表面形成滤饼。
滤液的透过阻力来自两个方面，即过滤介质和 介质表面不断堆积的滤饼。 2. 提高过滤速度和过滤质量是过滤操作的目标。 由于滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素，因
此在过滤操作以前，一般要对滤液进行絮凝或
凝聚等预处理。改变料液的性质，降低滤饼的
阻力。
过滤设备
针式过滤器
离心沉降速度
离心设备的一个重要技术指标是其所能达到的离心
力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量
离心程度的参数，用Z表示
Z
4 N r
2 2
g
式中，r为离心半径，即从旋转轴心到沉降颗粒的距 离，N为离心机的转数(s-1) 。
离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，因 此，将式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs 为 2 2 2 2 d P ( S L ) N r s 9 L
3、溶液中核酸构象的研究
：单链DNA双链DNA 蛋白质 双链DNA RNA 4、核酸的制备 氯化铯密度梯度超离心
超螺旋 DNA
经染料-氯化铯密度梯 度超离心后，质粒DNA 及各种杂质的分布
离心分离设备
1. 离心机是生化实验室及生化工业广泛使用 的分离设备。实验室用离心机以离心管式 转子离心机为主，离心操作为间歇式。 2. 工业离心分离设备中，较为常用的有管式 和碟片式两大类。
珠磨机的种类很多，处理规模跨度很宽，从实验
规模的组织捣碎机，到工业规模的高速珠磨机。
如WAB公司的Dyno Mill KD45C型最大搅拌速度 为1450rpm(圆周线速度20m/s)，破碎室体积45L。 珠磨机连续操作时，兼具破碎和冷却双重功能，
珠磨法
(Bead mill)
水平搅拌式珠磨机
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃珠、石英砂、氧 化锆等研磨剂(直径＜1mm﹞一起快速搅拌或研磨，研磨剂、 珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞受到研磨剪切和 撞击而破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子 被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产 生的热量采用换热冷却带走。
蛋白质的沉降系数
物质 细胞色素 C 肌红蛋白 胰蛋白酶 尿酶酶 卵白蛋白 α -淀粉酶 血红蛋白 伴刀豆蛋白 A(四聚体) IgG IgM 相对分子质量 12 400 16 900 28 000 32 000 45 000 50 000 64 550 102 300 150 000 900 000～1 000 000 沉降系数 S w0 , 20 / S 1.18 2.04 2.5 2.7 3.7 4.5 4.1～4.5 6.0 6.0～7.8 18～20
主要菌体和细胞的离心分离
菌体、细胞 大肠杆菌 酵母 血小板 红血球 淋巴球 肝细胞 大 小 /μ m 2～ 4 2～ 7 2～ 4 6～ 9 7～ 12 20～ 30 离心力 实验室 1 500g 1 500g 5 000g 1 200g 500g 800g 工业规模 13 000g 8 000g — — — —
膜分离介质，微滤分离等
过滤操作
对具体过滤处理的不同对象，应根据下列因素，选 取合适的过滤设备：(1)料液的粘度、腐蚀性；(2)固态悬 浮物的粒度、浓度以及变形性等；(3)目的产物是液体部 分还是悬浮固体等。
过滤速度
1. 过滤操作一般以压力差为透过推动力，只靠重 力不能达到足够大的透过速度。过滤操作中固
目的、需低温操作等特点，细胞破碎器采用了
特殊的结构设计。细胞的机械破碎主要有。
高压匀浆
高压匀浆又称高压剪切破碎。高压匀浆器的
破碎原理是：细胞悬浮液在高压作用下从阀
座与阀杆之间的环隙高速(可达到450m/s)喷
出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击 作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击 力和剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器 的操作压力通常为50-70MPa。
出液口
内装微孔滤膜 进液口
微孔滤膜滤器
2.2.2.3 常用过滤设备 生化分离中，工业规模过滤设备主要有加压叶滤机、板框过 滤机、旋转真空过滤机。
过滤板
1钮
滤框
2钮
洗涤板
3钮
板框式压滤机装置及滤板与滤框的构造
板框式过滤机：适用于要求滤饼较干的场合，不适用于含
挥发性有毒物质或有生物危害的场合。
加压叶滤机
2.2 细胞破碎
生物产物可能存在于细胞壁、细胞膜、细胞
质以及线粒体、核糖体、内质网和高尔基体等细
胞器中。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜
受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释
放其中的目标产物。
胞外产物：微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大 多数小分子代谢物、胞外酶、抗生素、多糖等，直接进行 固液分离，即可进行滤清液的分离。 胞内产物： 某些目的产物不能分泌到细胞外，留在细
或
s
dr dt Sr
2 . N
离心分离法
• 差速离心 • 区带离心
差速离心分级
1. 差速离心(Differential centrifugation)是生化工业
中最常用的离心分离方法。以菌体细胞的收集 或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作 的一种特殊情况，即为一级分级分离。 2. 操作中，根据实际物料的特点(目标产物和其他
g
d p ( S L )g
2
18 L
d 上式为球形粒子的Stokes沉降速度， p 、 s、 L 和 g 分别表示粒径、固体颗粒密度、液 体密度和重力加速度， g 为重力沉降速度， L 为液体粘度。
菌体和动植物细胞的重力沉降虽 然简便易行，但菌体细胞体积很小， 沉降速度很慢。因此，实用上需使菌 体细胞聚并成较大凝聚体颗粒后进行 沉降操作，提高沉降速度。
于实验室水平。
密度梯度离心（density gradient）
生物大分子及颗粒的沉降不仅 决定于它的大小，而且也取决于 它的密度。颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大 的颗粒沉降的快，并且每种蛋白 质颗粒沉降到与自身密度相等的 介质密度梯度时，即停止不前， 最后各自在离心管中被分离成独 立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分 步收集。常用的介质有蔗糖、氯 化铯等。
预处理--细胞的分离与破碎
2.1 细胞分离
• 重力沉降 • 离心沉降 • 过滤
重力沉降
重力沉降是化工过程中常用的气固、 液固和液液分离手段，在生化分离过程 中亦有一定程度的应用。
以液固沉降为例，重力沉降过程中固体颗粒受 到重力、浮力和摩擦阻力的作用。考虑球形的 固体颗粒，则当浮力、摩擦阻力和重力达到平 衡时，固体颗粒匀速沉降，沉降速度为
离心沉降
• 离心类别 • 离心沉降速度 • 离心分离法
• 离心分离设备
离心机的种类和适用范 围
低速离心机 转 速 / rpm 离心力 / g 适 用 范 围 细 胞 细胞核 细胞器 蛋白质 2 000～ 6 000 2 000～ 7 000 适用 适用 — — 高速离心机 10 000～ 26 000 8 000～ 80 000 适用 适用 适用 — 超离心机 30000～ 120000 100000～ 600000 适用 适用 适用 适用
区带转子
分析转子
各种转子
管式离心机
碟片式离心机
过滤
• 过滤速度 • 过滤设备
2.2.2 过滤
采用合适的多孔性过滤介质， 可以过滤截留菌体、细胞和碎片等 悬浮液中的固体离子。 织物状介质，棉花、石棉、蚕丝、
麻、羊毛及各种人造纤维与金属丝等
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第2章 细胞分离与破碎
BIOSEPARATION ENGINEERING
另外，向含菌体的料液中加入聚丙 另外，向含菌体的料液中加入聚丙 烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝 烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝 剂，可使菌体之间产生架桥作用而 形成较大的凝聚颗粒。 形成较大的凝聚颗粒。 凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降， 凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降， 而且还可以在过滤分离中大大提高 过滤速度和质量。 过滤速度和质量。当培养液中含有 蛋白质时． 蛋白质时．可使部分蛋白质凝聚而 同时过滤除去。 同时过滤除去。
1）对滤液进行絮凝或凝聚预处理，改变料液性质 2）在料液中加入助滤剂（如硅藻土）
2 细胞破碎
概述： 概述：
BIOSEPARATION ENGINEERING
许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞 外的培养液中，而保留在细胞内。 外的培养液中，而保留在细胞内。 这类生物产物需用上节所述方法收集菌体或细 胞后，进行细胞破碎(cell disruption)，使目 胞后，进行细胞破碎 ， 标产物选择性地释放到液相中。 标产物选择性地释放到液相中。 破碎的细胞或其碎片利用上节所述的固液分离 方法(主要是离心法 除去后， 主要是离心法)除去后 方法 主要是离心法 除去后，上清液用于进一 步的分离纯化。 步的分离纯化。
BIOSEPARATION ENGINEERING
1.3 过滤
利用薄片形多孔性介质(如滤布)截留固液悬 浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法 过滤是一种膜分离法
BIOSEPARATION ENGINEERING
滤液的透过阻力主要来自于：过滤介质和介 质表面堆积的滤饼 滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素 提高过滤速度方法：
BIOSEPARATION ENGINEERING
细胞破碎和生化分离技术-PPT
缺点: A、影响因素多,细胞种类、浓度和 处理时间、探头材料和形状; B、有效能量得利用率低; C、产热大,需控温; D、不易放大,仅应用于实验室规模 得细胞破碎。
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法得作用机理不尽相同,有各自得适用范围 (包括菌体细胞、细胞发酵液得特性)和处理规模(实验室或工 业用)
碟片式离心机
• 就是在管式离心机得基础上发展起来得,在转鼓中加入了 许多重迭得碟片,缩短了颗粒得沉降距离,提高了分离效 率。
• 就是生物工业中应用最为广泛得一种离心机 • 有一个密封得转鼓,内装十至上百个锥顶角为60-100゜锥
形碟片。 • 碟片间得距离一般为0、5-2、5mm。
碟片式离心机工作原理
浓度。 • 微滤技术有着广泛应用和众多得优点。
微滤得操作模式
• 无流动操作模式和错流过滤操作模式
微滤设备
• 板框式膜过滤器 • 管式膜过滤器 • 中空纤维式膜分离器 • 螺旋卷式膜分离器
离心技术
• 一、离心分离得基本原理 • 二、离心机得类型 • 三、离心方法 • 四、离心条件得确定 • 五、影响离心效果得主要因素与控制
心机 • 据设备结构特点分:管式、蝶式、螺旋式……
离心机得种类与用途
按速度和离心力: 1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g 以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离; 2、高速(冷冻)离心机 1×104～2、5×104rpm,相对离心力104～ 105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离; 3、超速离心机 转速2、5～8×104rpm,相对离心力5×105g;用于 DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化;检测纯度;沉降系数 和相对分子量测定等。
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法得作用机理不尽相同,有各自得适用范围 (包括菌体细胞、细胞发酵液得特性)和处理规模(实验室或工 业用)
碟片式离心机
• 就是在管式离心机得基础上发展起来得,在转鼓中加入了 许多重迭得碟片,缩短了颗粒得沉降距离,提高了分离效 率。
• 就是生物工业中应用最为广泛得一种离心机 • 有一个密封得转鼓,内装十至上百个锥顶角为60-100゜锥
形碟片。 • 碟片间得距离一般为0、5-2、5mm。
碟片式离心机工作原理
浓度。 • 微滤技术有着广泛应用和众多得优点。
微滤得操作模式
• 无流动操作模式和错流过滤操作模式
微滤设备
• 板框式膜过滤器 • 管式膜过滤器 • 中空纤维式膜分离器 • 螺旋卷式膜分离器
离心技术
• 一、离心分离得基本原理 • 二、离心机得类型 • 三、离心方法 • 四、离心条件得确定 • 五、影响离心效果得主要因素与控制
心机 • 据设备结构特点分:管式、蝶式、螺旋式……
离心机得种类与用途
按速度和离心力: 1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g 以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离; 2、高速(冷冻)离心机 1×104～2、5×104rpm,相对离心力104～ 105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离; 3、超速离心机 转速2、5～8×104rpm,相对离心力5×105g;用于 DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化;检测纯度;沉降系数 和相对分子量测定等。
《生化分离工程》教案
第三章 细胞的分离与破碎
第三节 细胞破碎
1固-液分离设备及其特点（重点）（35min）
2细胞破碎概述细胞壁的结构和化学组成（10min）
3常用的细胞破碎方法（重点）及其原理（难点）、机械破碎法所用设备（30min）
4细胞破碎率的测定（5min）
5细胞破碎研究方向（5min）
6小结及思考题（5min）
3滤饼的重量比阻rB
教后小结
学生对絮凝以及凝聚概念有清楚的理解，对发酵液的预处理基本掌握。
教案1
课时安排
4学时
教学次序
第3次课
授课题目
第二章细胞分离与破碎
第三节细胞破碎
1固-液分离设备
2细胞破碎概述细胞壁的结构和化学组成
3常用的细胞破碎方法及其原理、机械破碎法所用设备
4细胞破碎率的测定
5细胞破碎研究方向
2.严希康著，《生化分离工程》，化学工业出版社，北京，2001年2月
3.孙彦著，《生物分离工程》，化学工业出版社，北京，2005年3月
4.欧阳平凯，胡永红著，《生物分离原理及技术》，化学工业出版社，北京，2006年2月
5.谭天伟著，《生物分离技术》，第二版，化学工业出版社，北京，2007年8月
6.朱志强著，《超临界流体萃取技术原理》，化学工业出版社，北京，2001年8月（2）相关专业网站：
小木虫学术科研第一站：/
食品伙伴网：/
食品商贸网：/
食品工业网：/
食品科技网：/
教学难点
凝聚和絮凝的区别、滤饼的重量比阻rB
教学方法
讲授法、谈话法。多媒体辅助教学。
教学过程设计
第二章细胞的分离与破碎
第一节发酵液的预处理第二节固液分离
1发酵液预处理的目的（15min）和具体方法（重点30min）
第三节 细胞破碎
1固-液分离设备及其特点（重点）（35min）
2细胞破碎概述细胞壁的结构和化学组成（10min）
3常用的细胞破碎方法（重点）及其原理（难点）、机械破碎法所用设备（30min）
4细胞破碎率的测定（5min）
5细胞破碎研究方向（5min）
6小结及思考题（5min）
3滤饼的重量比阻rB
教后小结
学生对絮凝以及凝聚概念有清楚的理解，对发酵液的预处理基本掌握。
教案1
课时安排
4学时
教学次序
第3次课
授课题目
第二章细胞分离与破碎
第三节细胞破碎
1固-液分离设备
2细胞破碎概述细胞壁的结构和化学组成
3常用的细胞破碎方法及其原理、机械破碎法所用设备
4细胞破碎率的测定
5细胞破碎研究方向
2.严希康著，《生化分离工程》，化学工业出版社，北京，2001年2月
3.孙彦著，《生物分离工程》，化学工业出版社，北京，2005年3月
4.欧阳平凯，胡永红著，《生物分离原理及技术》，化学工业出版社，北京，2006年2月
5.谭天伟著，《生物分离技术》，第二版，化学工业出版社，北京，2007年8月
6.朱志强著，《超临界流体萃取技术原理》，化学工业出版社，北京，2001年8月（2）相关专业网站：
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教学难点
凝聚和絮凝的区别、滤饼的重量比阻rB
教学方法
讲授法、谈话法。多媒体辅助教学。
教学过程设计
第二章细胞的分离与破碎
第一节发酵液的预处理第二节固液分离
1发酵液预处理的目的（15min）和具体方法（重点30min）
生物分离工程 第二章
细胞分离与破碎
（2）珠磨
影响因素：搅拌速度、停留时间、微珠粒径、细胞本身 适用对象：绝大多数微生物细胞
2
细胞分离与破碎
（3）喷雾撞击破碎
喷雾撞击破碎器结构简图
特点：细胞破碎程度均匀，可避免过度破碎，适用 于细胞器（线粒体、叶绿体等）的回收 适用对象：大多数微生物细胞和植物细胞
2
细胞分离与破碎
（4）超声波破碎 机理：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的 形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞 破碎。 影响因素：细胞种类，细胞浓度，频率、功率 适用对象：多数微生物细胞
物理渗透法
（1）渗透压冲击法
（2）冻结-融化法
2
细胞分离与破碎
2.2.4 目标产物的选择性释放
细胞破碎的目的是使胞内的目标产物释放出来，以 进行进一步的分离纯化，因此，理想的破碎方法应当是
使目标产物尽可能多的释放出来，而杂质成分尽可能少 得释放。 ① 仅破坏或破碎目标产物的周围。
① 选择性溶解目标产物。
Rc
W
A
kp
m
一般需缓慢增大操作压力，最终操作压力不超过 0.3 ～ 0.4MPa。
2
细胞分离与破碎
2.1.3.2
过滤设备
工业上常用的过滤设备：加压叶滤机、板框过滤机、 转鼓真空过滤机。
加压叶滤机
转鼓真空过滤机
2
细胞分离与破碎
板框过滤机
2
细胞分离与破碎
2.2 细 胞 破 碎
2.2.1 细胞结构
不同生物细胞，其细胞结构差异很大。
2.2.2 细胞破碎和产物释放原理
摩擦力、撞击作用力、剪切力、化学溶解、酶解
渗透作用力等。
微生物细胞的破碎及破碎率测定1
细胞破碎的方法很多，归纳起来可分为机械破碎法、物 理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法等。
（1） 研磨法
研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使细胞破碎。
实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器， 利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。
主要缺点：温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用胶质磨来处理。
4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速 升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰 浴冷却。
思考题
1. 细胞破碎的方法有哪些？ 2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？ 3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。
实验步骤
1、研磨法
• 细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培养基中， 37℃振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心 机收集细胞，3500rpm离心20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎 缓冲液中。
• 研磨：在研钵中加入适量石英砂，与菌悬液混合，研 磨10min。
• 超声波破碎： 800W，工作6s，间歇6s，破碎75次。 • 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、
脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
3、酶解法
• 细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期后 (约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。
例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜 色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色， 而受损害的酵母细胞呈现亮红色。
（2）测定释放的蛋白质量或酶的活力
测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中 蛋白质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的 标准数值比较。
（1） 研磨法
研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使细胞破碎。
实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器， 利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。
主要缺点：温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用胶质磨来处理。
4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速 升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰 浴冷却。
思考题
1. 细胞破碎的方法有哪些？ 2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？ 3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。
实验步骤
1、研磨法
• 细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培养基中， 37℃振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心 机收集细胞，3500rpm离心20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎 缓冲液中。
• 研磨：在研钵中加入适量石英砂，与菌悬液混合，研 磨10min。
• 超声波破碎： 800W，工作6s，间歇6s，破碎75次。 • 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、
脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
3、酶解法
• 细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期后 (约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。
例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜 色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色， 而受损害的酵母细胞呈现亮红色。
（2）测定释放的蛋白质量或酶的活力
测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中 蛋白质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的 标准数值比较。
生化分离技术 细胞破碎分离
生物分离过程的一般流程
细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离
原料液 原料液
细胞分离 ( 细胞分离 ( 离心，过滤 离心，过滤 )) 路线一 路线二 清液－胞外产物
路线一A
粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳 层析、电泳 ) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 凝胶过滤、超过滤 )
通过改变微生物生长环境（温度、pH、缓 冲液），可以诱发产生自溶酶或激发产生其 它的自溶酶，以达到自溶目的。
缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后 细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
（2）物理法
渗透压冲击法 冻结-融化法 干燥法
①渗透压冲击法
将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定 浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作 用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩， 当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞
之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，
释放出内含物。
WSK卧式高效全能珠磨机
②影响珠磨法破碎的因素
破碎作用公式：
ln[1/(1-R)]=Kt
R — 破碎率；K— 一级反应速度常数； t—时间。 K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环 速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及 温度等相关。
②影响珠磨法破碎的因素
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质 和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次 生壁一般较厚 (4μm以上 ) ，常有三层组成。
n
在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初 生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更 紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。
二
细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离
原料液 原料液
细胞分离 ( 细胞分离 ( 离心，过滤 离心，过滤 )) 路线一 路线二 清液－胞外产物
路线一A
粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳 层析、电泳 ) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 凝胶过滤、超过滤 )
通过改变微生物生长环境（温度、pH、缓 冲液），可以诱发产生自溶酶或激发产生其 它的自溶酶，以达到自溶目的。
缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后 细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
（2）物理法
渗透压冲击法 冻结-融化法 干燥法
①渗透压冲击法
将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定 浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作 用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩， 当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞
之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，
释放出内含物。
WSK卧式高效全能珠磨机
②影响珠磨法破碎的因素
破碎作用公式：
ln[1/(1-R)]=Kt
R — 破碎率；K— 一级反应速度常数； t—时间。 K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环 速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及 温度等相关。
②影响珠磨法破碎的因素
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质 和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次 生壁一般较厚 (4μm以上 ) ，常有三层组成。
n
在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初 生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更 紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。
二
生物分离工程第二章细胞破碎
常用离心设备
Decanter centrifuge
Multichamber bowl, vertical cut
管式离心设备
A disposable cell separation insert PowerfugeTM one-chamber with scraper
Tubular bowl
碟片离心设备
fg fS fb
则
v
2 g
4 3
S
L
L
d
p
g
重力沉降理论
当球形颗粒处于滞流区（103 Re 1 ）时 Biblioteka 24Revg
d
2 p
S
L g
18 L
Stokes公式
当球形颗粒处于过渡区（1 Re 103 ）时
10
Re 0.5
vg
0.27
操作过程区带离心种类?差速区带离心速度区带离心平衡区带离心等密度离心?平衡区带离心等密度离心差速速区带离心差速区带离心?基于颗粒的大小形状的分离?梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的最大密度?离心过程中颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等?动态离心分离方法平衡衡区带离心平衡区带离心?梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度?离心过程中颗粒不断沉降至其浮力密度离心过程中颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等?平衡离心分离方法梯度液的种类和应用细胞分离区带离心异同区带离心种类差速区带离心平衡区带离心共同点事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度梯度介质梯度介质常用蔗糖常用蔗糖常用氯化铯常用氯化铯密度梯度最大的密度梯度低于最大密度的沉降样品最大的密度梯度大于最大密度的沉降样品区带形成条件根据各个组分沉降系数的差别形成各自的区带根据各组分密度差形成区带离心条件在最前的沉降物质达到管底前停止短时间低速度使各组分沉降到其平衡的密度区长时间高速度离心方法新进展具体表现在哪几个方面
生物分离工程总复习题
生物分离工程总复习题第一章绪论复习题1.生物分离工程在生物技术中的地位？在生物技术领域，通常将生物产品的生产过程称作生物加工过程，包含优良生物物种的育种、基因工程、细胞工程、生物反应过程（酶反应、微生物发酵、动植物细胞培养等）及目标产物的拆分提纯过程，后者又称作下游加工过程。
生物产物的特殊性、复杂性和对生物产品要求的严格性。
因此导致下游加工过程的成本往往占整个生物加工过程成本的大部分。
生物拆分工程研究的根本任务：设计和优化拆分过程，提升拆分效率，增加拆分过程步骤，延长拆分操作方式时间，达至提升海口收率与活性、降低生产成本的目的。
生物拆分工程的特点就是什么？1．产品丰富产品的多样性导致分离方法的多样性2．绝大多数生物分离方法来源于化学分离3．生物分离一般比化工分离难度大3.生物拆分工程可以分成几大部分，分别包含哪些单元操作方式？生物拆分过程通常分后四步：1.固-液拆分（不溶物的除去）Vergt、过滤器、细胞碎裂目的就是提升产物浓度和质量2.铀（杂质斯维恰河）离子交换吸附、萃取、溶剂萃取、反胶团萃取、超临界流体萃取、双水相萃取以上分离过程不具备特异性，只是进行初分，可提高产物浓度和质量。
3．纯化色谱、电泳、结晶以上技术具有产物的高选择性和杂质的去除性。
4．精制结晶、干燥在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经济、可靠？（1）产品价值（2）产品质量（3）产物在生产过程中发生的边线（4）杂质在生产过程中发生的边线（5）主要杂质独有的物化性质就是什么？（6）相同拆分方法的技术经济比较上述问题的考虑将有助于优质、高效产物分离过程的优化。
5.生物分离效率有哪些评价指标？目标产品的浓缩程度――浓缩率m2．目标产物的拆分提纯程度――拆分因子或拆分系数α3．回收率rec第二章细胞分离与破碎复习题1．简述细胞破碎的意义一、细胞破碎的目的由于存有许多生化物质存有于细胞内部，必须在提纯以前将细胞碎裂，并使细胞壁和细胞膜受相同程度的毁坏（减小通透性）或碎裂，释放出来其中的目标产物，然后方可展开抽取。
细胞破碎-分离纯化
细胞破碎
概述
/jpkc/bbs
细胞破碎 植物细胞初生壁的化学组成
组分
纤维素 半纤维素 果胶物质
结构和分类
β－1，4－D－葡聚糖
木葡聚糖 甘露聚糖 木聚糖(包括阿拉伯木聚糖和40-甲基-葡萄糖醛酸木聚糖） 半乳糖醛酸聚糖 、 鼠李半乳糖醛酸聚糖 半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖
biotechecusteducnjpkcbbs概述目前较流行的初生细胞壁结构是由lampert等人提出的经纬模型依据这一模型纤维素的微纤丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上面同一层次上的微纤丝平行排列而不同层次上则排列方向不同互成一定角度形成独立的网络构成了细胞壁的经模型中的纬是结构蛋白富含羟脯氨酸的蛋白它由细胞质分泌垂直于细胞壁平面排列并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联构成更复杂的网络系统
/jpkc/bbs
细胞破碎
概述
概
述
★但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细 胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞 分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类 rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞 破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然 后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
/jpkc/bbs
细胞破碎
细胞破碎技术
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀 锥型阀 球型细胞破碎阀 高压匀浆器各种阀型设计
/jpkc/bbs
细胞破碎
细胞破碎技术
高压匀浆法适用的范围
高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎。 料液细胞浓度可达到20%左右。 ☆团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高 压匀浆法。
生物分离工程第二章
此，将式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs
为
s
2
2
d
2 P
(
S
9 L
L)N 2r
或
s
dr dt
Sr
2.N
12
即：
vs dP 2 (S L ) r 2 18 L
13
提高离心沉降速度的主要措施
vs dP 2 (S L ) r 2 18 L
d － 颗粒直径； ρS － 固体颗粒密度； ρL －液体介质密度； µL－ 液体介质粘度； ω －旋转角速度； r －转轴中心到颗粒中心距离
第二章 细胞分离与破碎
1
总体学习目的和要求
通过本章学习，要求掌握细胞分离 和目标产物释放的原理和方法，熟知各 种方法的优缺点和应用范围。
2
固液分离的目的
• 收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物 （细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和 它们的絮凝体等）。
• 收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相。
7
子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝团 – 引入外力
8
离心沉降
• 离心沉降是利用沉降设备使流体和颗粒旋转， 在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度 差，所以颗粒沿径向与流体产生相对运动，从而 使颗粒和流体分离。
9
应用
• 1878年 瑞典 牛奶——奶油 • 1896年 用于回收酵母 • 离心分离技术在生工方面主要用于：分
干燥 处理
珠磨法 撞压击榨法 高
压 匀 浆
超 酶溶法 声 破 碎
溶胞 作用 化学法 物理法
44
四、细胞破碎方法及其原理
机械破碎 物理破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。