第二章-细胞的分离与破碎-2

离心沉降
• 离心类别 • 离心沉降速度 • 离心分离法
• 离心分离设备
离心机的种类和适用范 围
转速 / rpm 离心力 / g 适 细 胞 用 细胞核 范 细胞器 围 蛋白质 低速离心机 2 000～6 000 2 000～7 000 适用 适用 — — 高速离心机 10 000～26 000 8 000～80 000 适用 适用 适用 — 超离心机 30000～120000 100000～600000 适用 适用 适用 适用
物质 细胞色素 C 肌红蛋白 胰蛋白酶 尿酶酶 卵白蛋白 α -淀粉酶 血红蛋白 伴刀豆蛋白 A(四聚体) IgG IgM 相对分子质量 12 400 16 900 28 000 32 000 45 000 50 000 64 550 102 300 150 000 900 000～1 000 000 沉降系数 S w0 , 20 / S 1.18 2.04 2.5 2.7 3.7 4.5 4.1～4.5 6.0 6.0～7.8 18～20
形成分被过滤介质截留，在介质表面形成滤饼。
滤液的透过阻力来自两个方面，即过滤介质和 介质表面不断堆积的滤饼。 2. 提高过滤速度和过滤质量是过滤操作的目标。 由于滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素，因
此在过滤操作以前，一般要对滤液进行絮凝或
凝聚等预处理。改变料液的性质，降低滤饼的
阻力。
过滤设备
出液口
组分的性质和相互作用等)、分离的目的和所需
分离的程度，选择适当的操作条件(离心转数和 时间)，可使料液中的不同组分得到分级分离。
差 速 离 心
2.2.3.2 离心分离法 差速离心是生化工业中常用离心分离方法。以菌体 细胞的收集或除去为目的的固液离心分离，是分级离心 操作的一种特殊情况，即为一级分级分离。
思考题
1、何谓沉降 2、沉降与离心的异同 3、离心设备可分为哪两大类 4、常用的离心沉降设备有哪些 5、常用的离心过滤设备有哪些
2.2 细胞破碎
胞外产物：微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多 数小分子代谢物、胞外酶、抗生素、多糖等，直接进行固 液分离，即可进行滤清液的分离。 胞内产物： 某些目的产物不能分泌到细胞外，留在细 胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等。 随着重 组DNA技术发展，许多有重要价值的生物产品应运而生，
霉菌 100～250 多层 多聚糖 (80%～90%) 脂 类 蛋白质
主要组 成
2.1.2 细胞破碎原理
细胞破碎方法可分成两大类，一是机械法，二是非机
械法，或是两者的结合。
机械法有珠磨法、高压均质法、超声破碎法、X-press 法等；由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，大多需 冷却以防止生物品受热破坏。非机械法有酶溶法、化学法、 物理法和干燥法等。 机械法中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切 力。 化学破碎利用化学或生化试剂(酶)改变细胞壁或细胞膜 结构，增大胞内物质的溶解速率；或者完全溶解细胞壁后， 在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。
高压匀浆法中影响细胞破碎的因素主要有压力、
循环操作次数和温度。细胞破碎率S与操作压力 P和循环操作次数N之间的关系可表达为
1 a b ln kp N 1 S
细胞破碎率用胞内产物释放率表示,是单位质量
细胞的产物释放量，mg/cell
R S Rmax
高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞的 破碎，料液细胞浓度可达到20％左右。团状 和系状菌易造成高压匀浆器堵塞，一般不宜 使用高压匀浆法。高压匀浆操作的温度上升 约2～ 3℃／10MPa，为保护目标产物的生物 活性，需对料液作冷却处理，多级破碎操作 中需在级间设置冷却装置。因为料液通过匀 浆器的时间很短，通过匀浆器后迅速冷却， 可有效防止温度上升，保护产物活性。
细胞外层结构
微生物 壁厚 /nm 层次
细菌 革兰氏阳性 革兰氏阴性 20～80 单层 肽聚糖 (40%～90%) 多 糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%～4%) 10～13 多层 肽聚糖 (5%～10%) 脂蛋白 脂多糖 (11%～22%) 磷 脂 蛋白质
酵母菌 100～300 多层 葡聚糖 (30%～40%) 甘露聚糖 (30％) 蛋白质 (6%～8%) 脂 类 (8.5%～13.5%)
梯度 离心
1. 两种区带离心法均事先在离心管中用某种 低分子溶质(如蔗糖、甘油等溶液)调配好密 度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液 后进行离心操作。 2. 区带离心的密度梯度一般可用蔗糖配制。 事先调配不同浓度(密度)的蔗糖溶液，然后 在离心管中依浓度从大到小层层加入即可。 将一定浓度的蔗糖溶液经一定时间的高速 离心后可制成连续的蔗糖密度梯度。 3. 区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大 分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限
于实验室水平。
密度梯度离心（density gradient）
生物大分子及颗粒的沉降不仅 决定于它的大小，而且也取决于 它的密度。颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大 的颗粒沉降的快，并且每种蛋白 质颗粒沉降到与自身密度相等的 介质密度梯度时，即停止不前， 最后各自在离心管中被分离成独 立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分 步收集。常用的介质有蔗糖、氯 化铯等。
区带离心
区带离心(Zonal centrifugation)是生 化研究中的重要分离手段，根据离心操作条 件不同，分为 1. 差速区带离心(Rate zonal density gradient sedimentation)
2. 平衡区带离心(Isopycnic density gradient sedimentation)
2 d P ( S L ) N r s 9 L
或
dr s Sr dt
2 .N
离心分离法
• 差速离心 • 区带离心
差速离心分级
1. 差速离心(Differential centrifugation)是生化工业
中最常用的离心分离方法。以菌体细胞的收集 或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作 的一种特殊情况，即为一级分级分离。 2. 操作中，根据实际物料的特点(目标产物和其他
g
2 d p ( S L )g
18 L
d 上式为球形粒子的Stokes沉降速度， p 、 s、 L 和 g 分别表示粒径、固体颗粒密度、液 体密度和重力加速度， g 为重力沉降速度， L 为液体粘度。
菌体和动植物细胞的重力沉降虽 然简便易行，但菌体细胞体积很小， 沉降速度很慢。因此，实用上需使菌 体细胞聚并成较大凝聚体颗粒后进行 沉降操作，提高沉降速度。
主要菌体和细胞的离心分离
菌体、细胞 大肠杆菌 酵母 血小板 红血球 淋巴球 肝细胞 大小/μ m 2～4 2～7 2～4 6～9 7～12 20～30 离心力 实验室 工业规模 1 500g 13 000g 1 500g 8 000g 5 000g — 1 200g — 500g — 800g —
蛋白质的沉降系数
区带转子
分析转子
各种转子
管式离心机
碟片式离心机
过滤
• 过合适的多孔性过滤介质， 可以过滤截留菌体、细胞和碎片等 悬浮液中的固体离子。 织物状介质，棉花、石棉、蚕丝、
麻、羊毛及各种人造纤维与金属丝等
多孔陶瓷介质，此为特殊的介质，
低温烧制，具有大量微细孔道的滤管或 滤板（其他多孔材料，PE等）
菌(狭义)、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体。
真核细胞 － 含有真核（被核膜包围的核）的细胞。包括动植物以
及微小的原生动物、单细胞海藻、真菌、苔藓等。
动物细胞无细胞壁，只有细胞膜，易于破碎。植物细胞和微生
物细胞的细胞膜外还有一层坚固的细胞壁，破碎较困难。
微生物细胞的细胞壁固定细胞外形，保护细胞免受机械损伤或 渗透压破坏。细胞膜主要由蛋白质和脂质组成，二者之和占细胞膜
预处理--细胞的分离与破碎
2.1 细胞分离
• 重力沉降 • 离心沉降 • 过滤
重力沉降
重力沉降是化工过程中常用的气固、 液固和液液分离手段，在生化分离过程 中亦有一定程度的应用。
以液固沉降为例，重力沉降过程中固体颗粒受 到重力、浮力和摩擦阻力的作用。考虑球形的 固体颗粒，则当浮力、摩擦阻力和重力达到平 衡时，固体颗粒匀速沉降，沉降速度为
3、溶液中核酸构象的研究
：单链DNA双链DNA 蛋白质 双链DNA RNA 4、核酸的制备 氯化铯密度梯度超离心
超螺旋 DNA
经染料-氯化铯密度梯 度超离心后，质粒DNA 及各种杂质的分布
离心分离设备
1. 离心机是生化实验室及生化工业广泛使用 的分离设备。实验室用离心机以离心管式 转子离心机为主，离心操作为间歇式。 2. 工业离心分离设备中，较为常用的有管式 和碟片式两大类。
滴加样品
离 心 管
蔗糖浓度
蔗糖密度梯度
密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的应用
1、核酸密度的测定
= o + 4.2 2(20
2)10-10
石蜡油 蛋白质 开环质及 线型DNA 闭环质粒 DNA
2、测定DNA中G-C之含量 Rolfe-Meselson公式： = 0.100xG-C + 1.658
离心沉降速度
离心设备的一个重要技术指标是其所能达到的离心
力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量
离心程度的参数，用Z表示
4 N r Z g
2 2
式中，r为离心半径，即从旋转轴心到沉降颗粒的距 离，N为离心机的转数(s-1) 。
离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，因 此，将式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs 为 2 2 2
细胞破碎和产物释放原理
胞内产物释放速率模型
细胞破碎法
• 机械破碎 • 化学和生物化学渗透
• 物理渗透法