C2-2 分子克隆的工具酶
2.3.1 DNA连接酶（DNA ligase）
• 催化双链DNA片段紧靠在一起的3’羟基末 端和5’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键。 • 连接酶的种类：
T4 DNA连接酶 E.coli DNA连接酶 T4 RNA连接酶
T4DNA连接酶的活性单位
• Weiss单位：37°C 20min催化1 nmol 32Pห้องสมุดไป่ตู้焦磷 酸根置换到【γ，β 32P】ATP所需 的酶量。 • NEB：在20 μl反应体系中于16 °C ，使Hind III 切过的λDNA（300 μ g/ml, 0.12 μmol/L 5’末端） 在30 min内连接50％所需的酶量。 • 1 weiss unit=67 NEB连接单位
• 催化 γ - 磷酸基团从 ATP 分子转移到 DNA 或 RNA 的 5’-OH末端，或与DNA分子的5’-磷酸基团置换。 • 不受底物分子大小的限制 • 用途： 对5’-OH末端的DNA或合成接头进行磷酸化； 对5’末端进行标记。
多核苷酸激酶的活性和DNA分子5′末端标记
2.4.4 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)
• 一 般 有 两 种 ： 禽 成 髓 细 胞 瘤 病 毒 AMV (avian myeloblastosis virus) 反转录酶以及M-MLV （ Moloney 鼠 白血病病毒）反转录酶。 • AMV与M-MLV的主要区别：
M-MLV的RNase H活性较弱，有利于合成较长的cDNA。 AMV 的反应温度较高（可达55℃），可用于基因比较复杂、 有二级结构或GC含量较高的RT反应。
特点 ： RNase 的非竞争性抑制剂，以非共价方式结 合在 RNase 上，需要 DTT 。对 RNase H 以及反转录 酶等不起抑制作用。 作用 ： 用于 RNase 活性的抑制 ，防止 RNase 对样品 RNA的降解。
2.4.2 甲基化酶（methylase）
• 存在广泛。甲基化酶是原核生物限制修饰系统中的一员。 • 大肠杆菌中主要有两种：Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶。
• 核糖核酸酶 H（ribonuclease H， RNaseH）
特点 ：特异水解 DNA:RNA 杂交分子中 RNA 上的磷 酸二酯键。对单链核酸、dsDNA及dsRNA均不起作 用。许多酶附带有该酶的活性，如AMV反转录酶。 作用：降解DNA:RNA杂交双链分子中的RNA。
• S1核酸酶（S1 nuclease）
• 用途： 以单链RNA 为模板，以 olig(dT)15~20 、 随机寡聚核 苷 酸 （ 6~10 个 ） 或 基 因 特 异 引 物 合 成 cDNA ， 可 用 于 cDNA构建、探针标记或RT-PCR反应。
2.2.3 RNA 聚合酶 (RNA polymerase)
教材p33
• 以DNA为模板合成mRNA，不需引物，但必须 有启动子。 • 常用的RNA聚合酶来源与SP3、T3和T7噬菌体。 • 用途：体外转录用于体外翻译的底物或体外剪 接反应的底物； 用作RNA探针。
• 使DNA或RNA分子的5’-P末端脱磷转换成5’-OH末端 • 主要有两种：
CIP或CIAP（calf intestinal alkaline phosphatase，牛小肠碱性磷酸酶）， 其活性容易除去； BAP（bacterial alkaline phosphatase，细菌碱性磷酸酶），耐高温和去污 剂，其活性不易丧失。
特 点 ： 来 源 于 米 曲 霉 ， 单 链 核 酸 酶 ， 降 解 单 链 DNA 或 RNA ， 产生 5’P- 单核苷酸或寡核苷酸。对双链DNA的突出 末端以及发夹环也起作用。单链区可小到只有一个碱基。 用途：移去单链尾巴以产生平末端，或打开cDNA合成中产 生的发夹环。
• 核酸酶抑制剂（RNase inhibitor）
同尾酶
2.2.2.2 具平末端DNA片段之间的连接
G
产生新的酶切位点
2.2.2.3 DNA片段末端修饰后进行连接
• DNA片段末端同聚物加尾后进行连接 • 黏性末端修饰成平末端后进行连接 • DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接
多聚C加尾
粘性末端加尾 多聚G
平末端与黏性末端
黏性末端修饰成平末端后进行连接
2.2.2 反转录酶 (reverse transcriptase)
• 依赖于RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)。 • 一般具有5’→3’DNA聚合活性以及很强的RNase H活性。 • 该酶无3’→5’外切酶校正作用，故存在错误碱基掺入;需高浓度 dNTP • 可以合成第一链cDNA，也可以自身序列为引物继续合成第二 链cDNA（效率低）。 • RNase H具有核酸外切酶活性，能按5’→3’和3’→5’方向特异地 降解RNA:DNA杂交分子中的RNA链，使其成为长4~20个碱基 的寡核甘酸。
2.2.4 末端转移酶 (terminal transferase)
• 特性：不依赖于模板的DNA聚合酶；可在单链或双链 DNA（至少3个碱基）的3’-OH端（5’突出或平末端效 率低）添加一个或多个核苷酸。 教材p33 表2-6 同聚尾的长度 • 用途：给cDNA分子或载体末端加同聚尾；3′末端标记。
5’端脱磷
区别
• 核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）
特点：来源于牛胰，核酸内切酶，可特异攻击RNA 上嘧啶碱 基的 3’ 端，从而降解 RNA 。 比 DNase 耐 热 ，其活性不易丧失，故在配制 RNase 时，通过沸 水浴10~15分钟以去除DNase活性。 用途：广泛用于去除DNA样品中的RNA。也可用于 去除DNA:RNA杂交分子中未杂交的RNA单链区。
E.coli 和T4DNA连接酶
E.coliDNA连接酶 催化连接底物 反应需辅因子 用途 DNA NAD 黏性末端的连接 T4DNA连接酶 DNA、RNA ATP 黏性末端 平末端的连接及切口 的连接 4～160C
连接温度 连接时间
4～160C 过夜； 4h
2.2.2.1 具黏性末端的DNA片段之间的连接
• 用途： 对线性化的载体分子进行脱磷，防止载体自我环化，提高重组 DNA检出率；5’末端标记前的脱磷酸化。
碱性磷酸酯酶与DNA脱磷酸作用
复习思考题＋教材p38思考题
1.名词解释： 限制性核酸内切酶；回纹结构；同尾酶；同裂酶；黏性末 端；平末端；限制性核酸内切酶的酶活性单位（U）；限制 性核酸内切酶的星活性；连杆（linker）；衔接头（adaptor） 2. 限制性核酸内切酶反应体系的组成是什么？ 3. 引起限制性核酸内切酶星活性的可能因素有哪些？ 4. DNA片段之间的连接方式有哪些？ 5. 假设DNA片段A与DNA片段B的黏性末端非互补，试述连接A 片段与B片段的两种方式？ 6. DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶、末端转移酶、多核苷 酸激酶、碱性磷酸酯酶和核酸酶有哪些主要特性？它们在基 因工程中的主要用途分别是什么？
• 脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）
特点 ：来源于牛胰，可降解双链或单链 DNA 。 在 Mg2+ 存在下，作用于 dsDNA ， 产生 随机切口 ；在 Mn2+ 存 在 下 ， 在 两 条 链 的 大 致 同 一 位 置 切 割 dsDNA，产生平末端或1~2个核甘酸突出的切口。 用途：去除RNA样品中的DNA，还可用于切口平移 标记探针、DNA足迹分析、构建随机缺失突变体等。
(exonuclease VII)
DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接
-p
防止载体 自我连接
2.2.2.4 DNA片段加连杆（linker）后的连接
• 连杆/衔接物（linker）：化学合成的8～12个核 苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对 称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识 别序列，酶切后可产生一定的黏性末端，便于 与具有相同黏性末端的另一DNA片段连接。 • 衔接头/接头（adaptor）：化学合成的寡核苷 酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序 列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割 产生的黏性末端。
Dam甲基化酶识别GATC，使A*甲基化； Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG，使第二个C*甲基化。
• 不同限制酶对甲基化的敏感程度不同。 • 植物基因组甲基化程度高，酶切时应选用甲基化不敏感 限制酶。 • 用途：修饰（或保护）酶切位点；产生新的酶切位点。
2.4.3 T4多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)
分子生物学试卷（含答案）
分⼦⽣物学试卷（含答案）分⼦⽣物学试卷姓名：__________ 考试时间：_______ ___⼀、填空题，根据题意，将正确答案补充完整(本⼤题满分20分,每⼩题2分)1. 反式作⽤因⼦可划分为( )、组织特异性转录因⼦和( )三类。
2. 分⼦克隆中常⽤的⼯具酶有( )、( )、( )、( )。
3. 常⽤的核酸探针包括( )、( )和( )。
4. 限制性核酸内切酶的作⽤特点是识别位点的DNA序列呈⼆重旋转对称，即具有( )、切割DNA均产⽣含( )和3'-羟基的末端、错位切割产⽣具有5'-或3'-突出的粘性末端；⽽沿对称轴切割双链DNA产⽣平头末端，也称( )、少数不同的限制酶可识别和切割相同的( )。
5. 顺式作⽤元件按功能可划分为( )、( )、( )和( )。
6. 影响PCR的因素有( )、( )、耐热DNA聚合酶活性和⽤量、( )、( )、PH、温度、( )。
7. 原核细胞中各种RNA是催化⼀种酶催化( )种RNA⽣成的，⽽真核细胞基因的转录分别由( )种RNA聚合酶催化，其中rRNA基因由( )转录，hnRNA基因由( )转录，各类⼩分⼦量RNA则是( )的产物。
8. 体外重组常⽤⽅法有( )、平齐末端连接法、( )、( )和适配⼦连接法。
9. DNA切除修复需要的酶有( )、 ( )、( )。
10. PCR技术的基本过程是( )、( )、( )。
⼆、判断题，以下各题只有对错两个选项(本⼤题满分10分,每⼩题1分)1. Km值是酶的特性常数之⼀，与酶的浓度、pH、离⼦强度等条件或因素⽆关。
( )2. 有两个核酸制剂A和B,A的A250/A280=2.0,B的A250/A280=1.5,因此可判定制剂A的纯度⽐制剂B的要⾼。
( )3. 卫星DNA是⼀类⾼度重复序列，通常由串联重复序列组成。
( )4. ⽬前已知的G蛋⽩都是由α和βγ亚基组成的。
( )5. ⽣物膜中脂质的流动性受胆固醇含量的影响。
第二章：分子克隆的工具酶
加几个和加哪几个的问题
/techinfo/re/restrdigpcrii.htm
比如设计引物5'端导入酶切位点的时候, 一般导入3–4 个;导入的碱基, 最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡 整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5'形成所谓GC Clamp(有的软件,认为这样好). 别的就没什么了.
1. 现象
* 1975 EcoRI切割 phage (Lambda)中的5个 位点，并不是随机的，靠近右端的位点， 比分子中间的位点切割快10倍。
* 有4个 SacII位点 三个在中央 一个在右臂（Right-terminus）
at 40,386 中央三个快50倍
NEB检测了许多限制酶，有许多酶 的差异在10倍的范围上，但有许多 酶有较大的差异, 如
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
5’-CCC 3’-GGG
GGG-3’ CCC-5’
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
双酶切 PCR产物
AccI HindIII
EcoRI
CCGGTCGACCGG
2hr 20hr 00
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
00 00 10% 75%
GGAATTCC
>90 >90
PstI
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAG(N) 14 CTGCAG(N) 20
常见限制性酶切位点
常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等）分子生物学实验室技术2009-11-17 17:46:32 阅读2235 评论2 字号：大中小订阅.在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。
无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T载就不必考虑了）。
先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5’端（英语怎么说？）。
常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。
下面，我就总结了一些常用的内切酶的识别序列，仅供各位参考。
下面这些内切酶都属于II型内切酶。
先介绍一下什么是II型内切酶吧。
The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine.ApaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5'GGGCC^C 3'BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^GATCC 3'BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^GATCT 3'EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^AA TTC 3'HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^AGCTT 3'KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GGTAC^C 3'NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^CA TGG 3'NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' CA^TATG 3'NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^CTAGC 3'NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GC^GGCCGC 3'SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GAGCT^C 3'SalI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^TCGAC 3'SphI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GCA TG^C 3'XbaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' T^CTAGA 3'XhoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^TCGAG 3'当然，上面总结的这些肯定不全，要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；NEB网站上提供的识别序列图表下载2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBASE数据库去查（网址：/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：NEB公司网站提供的保护碱基参考表下载NEB公司网站上关于设计PCR引物保护碱基的参考双酶切buffer的选择（MBI、罗氏、NEB、Promega、Takara）这里再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要DNA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。
第二章 分子克隆工具酶(共73张PPT)
噬菌体T4DNA连接酶
噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为 60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。 此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接 DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性 末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌 DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶那么无 效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶 都不能催化两条游离的DNA链相连接。
2) 反响系统因素
缓冲液〔无菌、无污染〕 buffer 〔pH=8.0〕 ：
50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2
1mmol/L DTT或巯基乙醇 100μg BSA/ml
〔DDT：二硫苏糖醇 BSA： 牛血清蛋白)
NaCL〔0, 500, 1000mM〕
金属离子如：Ⅱ型酶需Mg2+，假设以Mn2+代 替Mg2+〔如HindⅢ，ECORI〕那么特异性改
④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质 粒的多克隆位点中有一个 SalⅠ 位点〔识别切割位点为 G↓TCGAC〕，该位点也可被 AccⅠ〔识别切割位点为 GT↓MKAC〕和 HincⅡ〔识别切割位点为 GTY↓RAC〕切割。
(3) 同尾酶
有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些 酶称为同尾酶〔isocaudamer)
2.2 种类及作用机理
T4 DNA连接酶(ATP提供能量〕和大肠 杆菌DNA连接酶〔NAD+提供能量〕两 种。
大肠杆菌的DNA连接酶
大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。 对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍 具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反响形 成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促 进磷酸二酯键的形成。
分子生物学名词解释及问答题
名词解说操控子：是原核生物基因的一个基本转录单位，由编码序列及上游的调控序列构成。
编码序列往常包含几个功能有关的构造基因，调控序列有启动序列（启动子）、操控序列（操控基因）及其余调理序列构成。
顺式作用元件：是真核基因变大调控转录过程的特别DNA 序列，于转录因子联合而起作用，往常包含启动子、增强子、缄默子等。
反式作用元件：与其余基因的顺式作用元件联合，调理基因转录活性的蛋白质因子，依据功能不一样分为基因转录因子和特异性转录因子。
启动子：位于构造基因上游、与RNA 聚合酶辨别、联合的特异DNA 序列，与基因转录起始有关。
同源重组：是指发生在同源序列见得重组，它经过链的断裂和再连结，在两个DNA 分子同源序列间进行单链或双链的互换。
又称基因重组。
DNA 克隆：将重组分子导入适合指在体外对 DNA 分子依据既定目的和方案进行人工重组，细胞内，使其在细胞扩增和生殖，进而获取该DNA 分子大批拷贝的过程称为分子克隆，又叫基因克隆或重组 DNA 技术。
基因工程：在体外将目的基因和载体DNA 依据既定的目的基因进行人工重组，并将重组体导入宿主细胞，经过无性生殖和表达获取所需核酸、蛋白质、生物新品种。
包含转基因动物、植物、基因工程生产药物、基因诊疗和基因治疗等。
限制性核酸内切酶：指一类能辨别和切割双链DNA 分子内特定的碱基次序的核酸水解酶，绝大部分是从原核细胞中提取的，可分为三类，此中Ⅱ型是分子克隆中最常用的工具酶。
pBR322 ：是研究最早、最清楚的质粒，其所有次序为4363bp，含有一个复制原点、一个Amp r 和 Tet r标志，有限制酶酶切位点，可供外源性基因插入，利用这种遗传标志，有益于挑选出重组转变菌。
gDNA 文库：即基因组 DNA 文库，是指存在于转变菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA 的会合。
它涵盖了基因组所有基因信息。
cDNA 文库：是细胞总mRNA 的克隆，文库只包含表达蛋白质或多肽的基因。
分子问答
10．重组体的筛选常用的方法有哪些？简述各种方法的原理。
1、表型筛选法：DNA体外重组所用的载体常常携带一个或几个可供选择的遗传标记或标记基因，当外源基因插入载体并转入受体细胞后，使受体细胞可获得或缺失这些标记表型，可以通过插入失活筛选阳性克隆。
2、抗药性标志的筛选：如果克隆载体带有某种抗药性标志基因，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗药菌素的平板上幸存并形成菌落，[ 这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。
3、B---半乳糖苷酶系筛选：很多4、蓝白筛选45、DNA损伤的突变有哪些类型？1、碱基对的置换2、颠换：原为嘧啶突变后变为嘌呤或原为嘌呤[突变后为嘧啶3、移码突变丢失或插入一个或几个核苷酸4、二聚体的形成5、重排;DNA分子内部发生较大片段的交换F1．分子克隆中常用的工具酶有哪些？各有何用途？1.限制性内切酶：1.DNA重组，2，构建新质粒，3，组建DNA物理图谱2.DNA聚合酶：制备DNA探针3，逆转录酶：DNA的序列分析；用于各种PCR 4,DNA链接酶：1粘端DNA或DNA切口间的连接 2，可用于粘性未端的连接5，DNA修饰酶：改变成修饰DNA的某些基因，如加“尾巴”。
2．何谓载体？分子克隆中常用的载体有哪些？理想的载体应具备哪些条件？载体：指能够将外源性DNA片段引入宿主细胞并能在宿主细胞中进行自我复制或最终使外源性DNA表达的自主DNA。
常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、病毒、人工染色体理想载体条件：1、在宿主细胞中有自我复制能力2、拷贝数多 3、应具有筛选标志 4、有RE切割位点5、分子量不宜过大 6、最好配备有调控元件 7、载体DNA与宿主DNA容易分开3．何谓PCR？试述PCR基本技术原理和影响因素。
PCR是一种体外扩增特异片段的技术，其原理类似DNA的体内扩增。
它包括：高温变性（90-97°C）低温退火（45—55°C）中温延伸（72度左右）。
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用分子克隆是利用分子生物学技术对目标DNA进行扩增及克隆的过程。
在分子克隆的过程中，常常需要使用许多酶类工具来完成不同的任务。
以下介绍了分子克隆过程中最常用的四种酶类工具及其应用。
1. 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction endonuclease）又称限制酶，是一类可特异性切割DNA特定序列的酶。
它可以在DNA的特定位置切割成不同的碎片，而不会破坏DNA的结构。
因此，限制酶被广泛应用于DNA的纯化、分析和重组等领域。
在分子克隆中，限制酶通常用于切割DNA的特定序列，以获得所需的DNA片段。
同时，也可以用于制备载体DNA的端部修饰，方便插入外来DNA片段。
此外，限制酶还可以用于分析DNA序列的变异和同源性等特征。
2. DNA连接酶DNA连接酶（DNA ligase）是一种催化DNA连结软帽酶，用于连接具有互补末端的DNA片段。
连接酶广泛应用于DNA重组、引物连接、克隆和测序等领域。
在分子克隆中，DNA连接酶通常使用于将外来DNA片段连接到载体 DNA 上。
此外，为了克隆具有完整DNA序列的目标基因，连接酶还可以用于连接PCR扩增出来的目标DNA序列。
3. PCR酶聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种快速、有效、敏感的DNA扩增技术。
在PCR过程中，通过PCR酶催化下的DNA扩增反应，能够在很短的时间内扩增目标DNA的数量。
在分子克隆中，PCR酶通常用于扩增目标DNA片段。
利用PCR技术，可以选择性增加目标DNA的数量并在容易处理的基本DNA片段之间产生特定的限制酶切断部位，为后续分子克隆实验提供方便。
4. 接头酶接头酶（T4 DNA ligase）是一种针对DNA单链断裂或缺口进行修复和连接的酶。
在分子克隆中，接头酶主要用于将外来DNA片段和载体DNA粘到一起。
在分子克隆的过程中，外来DNA片段和载体DNA之间通常存在一些不兼容的末端或过于短的重叠部分。
分子生物学试卷(含答案)
分子生物学试卷姓名：__________ 考试时间：_______ ___一、填空题，根据题意，将正确答案补充完整(本大题满分20分,每小题2分)1. 反式作用因子可划分为( )、组织特异性转录因子和( )三类。
2. 分子克隆中常用的工具酶有( )、( )、( )、( )。
3. 常用的核酸探针包括( )、( )和( )。
4. 限制性核酸内切酶的作用特点是识别位点的DNA序列呈二重旋转对称，即具有( )、切割DNA均产生含( )和3'-羟基的末端、错位切割产生具有5'-或3'-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称( )、少数不同的限制酶可识别和切割相同的( )。
5. 顺式作用元件按功能可划分为( )、( )、( )和( )。
6. 影响PCR的因素有( )、( )、耐热DNA聚合酶活性和用量、( )、( )、PH、温度、( )。
7. 原核细胞中各种RNA是催化一种酶催化( )种RNA生成的，而真核细胞基因的转录分别由( )种RNA聚合酶催化，其中rRNA基因由( )转录，hnRNA基因由( )转录，各类小分子量RNA则是( )的产物。
8. 体外重组常用方法有( )、平齐末端连接法、( )、( )和适配子连接法。
9. DNA切除修复需要的酶有( )、 ( )、( )。
10. PCR技术的基本过程是( )、( )、( )。
二、判断题，以下各题只有对错两个选项(本大题满分10分,每小题1分)1. Km值是酶的特性常数之一，与酶的浓度、pH、离子强度等条件或因素无关。
( )2. 有两个核酸制剂A和B,A的A250/A280=2.0,B的A250/A280=1.5,因此可判定制剂A的纯度比制剂B的要高。
( )3. 卫星DNA是一类高度重复序列，通常由串联重复序列组成。
( )4. 目前已知的G蛋白都是由α和βγ亚基组成的。
( )5. 生物膜中脂质的流动性受胆固醇含量的影响。
第二章 分子克隆工具酶
2 分子克隆工具酶（4学时）概述限制性内切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ）其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。
所以把这些酶称之为“工具酶”。
o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。
o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。
这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。
o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。
常用的工具酶2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)o限制与修饰（Restriction and modification）o限制酶识别的序列o限制酶产生的末端o DNA末端长度对限制酶切割的影响o位点偏爱（Site preference）o酶切反应条件o星星活性（star activity）o单链DNA 的切割o酶切位点的引入o影响酶活性的因素o酶切位点在基因组中分布的不均一性E.coli k 感染频率下降许多E .coli B 【E .coli B 限制λ（k ）】1. 限制与修饰现象①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象：2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ）E.coli B 修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。
表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率111E.coli C 10-4110-4E.coli B10-410-41E.coli KλC λB λK λ噬菌体感染率E.coli 菌株细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。
分子克隆技术常用的工具酶
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等， 一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程