液相色谱简介
高效液相色谱简介.pptx
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高效液相色谱法的特点
高压：一般可以达到150~300kg/cm2高速：一般可以达到1~10mL/min高效：一般可以达到60000理论塔板/页
分类： 选择：
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高效液相色谱的应用
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THE END
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色谱流出曲线示意图
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有关术语 1）色谱流出曲线和色谱峰 2）基线 3）峰高 4）保留值（死时间、保留时间、调整保留时 间、死体积、保留体积、调整保留体积、相对保留值） 5）区域宽度（标准偏差σ,半峰宽W1/2，峰底宽度W）
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样品所含组分的最少个数； 定性分析（保留值）； 定量分析（峰高或面积）； 分离效能（保留值及区域宽度）； 两相选择的依据（峰间距离）论文内容
从色谱流出曲线中可以得出许多重要信息：
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高效液相色谱(HPLC)流程示意图
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HPLC组成图
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分配系数 K和分配比k K=(溶质在固定相中的浓度)/(溶质在流动相中的浓度) =Cs / Cm K为每一溶质的特征值，仅为固定相和温度有关，与两相体积论文内容、柱管特性及仪器无关。 k=(组分在固定相中的质量)/(组分在流动相中的质量) =Ms / Mm两峰间的距离由组分在两相间的分配系数决定；峰宽由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定。 两个理论（塔板理论和 速率理论）论文内容
1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素） 20世纪四五十年代 出现了纸色谱（PC)和薄层色谱法（TLC)1952年 James和Martin提出了气相色谱法（GC)20世纪60年代后期 液相色谱法得到了快速发展 论文内容
液相色谱法
液相色谱法
液相色谱法（liquid chromatography，LC）是一种色谱技术，用于分离
和分析溶液中混合物的化学成分，以确定是否存在或不存在特定成分，如果存在，则存在多少。
我们中的许多人会从上学开始就熟悉平面LC的形式，在滤纸上打上黑色墨水标记，将一端浸入水中，然后观察墨水中的成分颜色是否分开。
但是，分析应用中使用的大多数LC均基于柱色谱法，这将是本文的重点。
顾名思义，高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是使用高色谱分辨率进行高效分离的高性能分析。
分离的组分也可以在检测后使用馏分收集器分离，作为纯化的手段。
HPLC有多种不同的配置，可用于分离分子量从半挥发性小分子到几万千道尔顿的大蛋白生物分子的溶解组分。
液相色谱法是一种非常流行的分析技术，广泛用于环境监控，农业，医药领域。
液相色谱法的优缺点
LC通常用于各种应用。
但是，它不适用于挥发性化合物的分离和分析。
仅当所有要分离的组分的蒸气压低于流动相的蒸气压时，才能实现可靠的分析型液相色谱方法。
气相色谱法更适合分析挥发性化合物。
提供各种不同的色谱柱和溶剂，可提供广泛的选择性，从而可以分离极性范围很广的组分。
大分子和小分子同样适用于该技术。
在相对较低的温度下进行有效分离的能力也使LC成为可在气相色谱仪中分解的热不稳定化合物的理想分离技术。
液相色谱介绍
液相色谱介绍液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种分离和分析样品成分的实验室技术，属于色谱分析方法的一种。
它是利用样品在固定相和移动相之间分配系数的不同，实现成分分离和检测的方法。
液相色谱因其高灵敏度、高分辨率、广泛的应用范围等特点，在化学、生物、食品、环境等领域具有重要意义。
液相色谱的主要组成部分包括：1. 色谱柱：色谱柱是液相色谱的核心部件，用于分离样品成分。
它由固定相（stationary phase）和填充物组成，固定相的选择取决于分离目标和样品性质。
2. 流动相：流动相是液相色谱中用于载带动态成分的溶液。
其选择和配比对于色谱分离效果至关重要。
通常，流动相由溶剂、缓冲液和添加剂组成。
3. 进样器：进样器用于将样品引入色谱柱。
常见的进样器有手动进样器和自动进样器。
4. 检测器：检测器用于检测分离后的样品成分。
常见的检测器有紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
5. 泵：泵用于驱动流动相在色谱系统内循环，保证样品分离过程的进行。
液相色谱的保养知识包括：1. 色谱柱保养：长时间不用时，色谱柱内应充满溶剂，两端封死。
正相色谱柱使用相应的有机相，如ACN。
2. 手动进样器：使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。
3. 流动相：使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。
4. 带seal-wash的1100，要配制90%水10%异丙醇，以每分23滴的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。
5. 定期检查和维护：根据说明书或现场工程师的建议，定期检查液相色谱仪的性能，确保其在良好状态下运行。
总之，液相色谱技术的应用领域广泛，可为科研和生产提供准确、有效的分析手段。
了解液相色谱的原理、保养方法以及相关应用，有助于更好地利用这一技术进行科学研究和生产实践。
液相色谱简介（反相）
高效液相色谱法（反相液相色谱）一、液相色谱法方法的分类和选择1、方法的分类：根据流动相和固定相极性的相对强弱，液相色谱法分为正相色谱法和反相色谱法。
两类色谱使用流动相极性顺序与物质的极性流出顺序恰好相反。
正相色谱法中通常固定相的极性较大，，如硅胶、氧化铝等，流动相极性小于固定相的极性。
实验时，流动相的选择从极性小到极性大递增，样品中极性弱的组分最先流出，随后是极性逐步增大的组分流出。
反相色谱中使用的固定相极性小，如C18键合的硅胶固定相，流动相的极性大于固定相的极性。
通常用水-甲醇作流动相时，样品中极性强的组分先流出，随后是极性较小的组分。
流动相的极性变化从最大的水开始，逐步增加甲醇的比例，流动相的极性逐步减弱。
在HPLC中应用最广泛的是反相分配色谱法（常称为反相色谱法）。
它是利用样品组分在流动相和固定相之间的溶解度之差进行分离。
在反相色谱柱中改变流动相组成、进行梯度淋洗和恢复柱子分配平衡容易实现，因此同一柱子可以长时间使用，柱效长久，重复性较好。
在反相色谱法中，极性大的组分先出峰，保留体积小，峰形扩散小，分离效率高，流动相价格便宜，毒性较小，容易得到。
正相色谱法大多利用吸附的原理进行分离，正相色谱法的柱子如使用强极性的流动相（如水、醇等溶剂）会使柱中吸附剂活性失去后很难恢复，特别是分离极性强的组分时，常常因为固定相的吸附作用使保留体积增大，引起峰的扩散和拖尾。
2、方法的选择：HPLC方法的选择主要取决于样品的组成、结构的类型、溶剂性能、相对分子质量范围等。
一般来讲相对分子质量大于2000的高分子化合物，主要采用凝胶色谱法进行分离。
相对分子质量小于2000的化合物可以利用它在水中和有机溶剂中的溶解度及溶解性质进行分离。
如极性大的水溶性化合物和在水中可解离的离子化合物，可用不同类型的色谱柱以离子色谱法进行分离；在水中溶解但不解离的化合物（如糖类）可用反相色谱法进行分离，以甲醇或乙睛-水作为流动相。
液相色谱仪在聚合物中的应用
液相色谱仪在聚合物中的应用1. 引言1.1 液相色谱仪简介液相色谱仪是一种常用的分析仪器，广泛应用于化学、生物、药学等领域。
其原理是利用液相进行分离和分析样品中的化合物。
液相色谱仪主要由柱、泵、检测器和数据处理系统组成。
样品溶解后由泵送入柱内，通过与填料相互作用，不同成分在柱内以不同速率移动，最终被检测器检测出来并进行定量分析。
液相色谱仪具有高灵敏度、高分辨率、高准确性等优点，能够对复杂的混合物进行快速、准确的分析。
在聚合物研究中，液相色谱仪可用于聚合物的溶解度分析、分子量测定、组分分析、结构表征等方面。
通过液相色谱仪的分析，可以帮助研究者更好地理解聚合物的性质和特性，为聚合物材料的开发和应用提供重要依据。
液相色谱仪在聚合物研究领域的应用前景十分广阔，将为聚合物科学的发展带来新的突破和进展。
液相色谱仪的引入，使得聚合物研究更加深入和全面，为聚合物领域的发展做出重要贡献。
1.2 聚合物分析的重要性聚合物的溶解度分析可以帮助我们评估聚合物在不同溶剂中的溶解性能，从而选择合适的工艺条件和溶剂体系。
而分子量测定则是评估聚合物链的长度及质量分布情况，直接影响着聚合物的性能表现。
组分分析能够帮助我们准确了解聚合物中不同成分的含量，为实现精准控制提供依据。
结构表征则是揭示聚合物链构象、键合情况等信息的重要手段，对于聚合物性能的解释和优化具有重要意义。
2. 正文2.1 聚合物的溶解度分析聚合物的溶解度分析是液相色谱仪在聚合物研究中的重要应用之一。
通过液相色谱仪的分离和检测功能，可以对不同溶剂条件下聚合物的溶解度进行定量分析。
这对于了解聚合物的溶解行为、溶解度与溶剂种类、温度等因素的关系具有重要意义。
在溶解度分析中，液相色谱仪可以根据聚合物的不同化学特性和分子大小，选择合适的柱和检测条件，实现对溶解度曲线的精确测定。
这对于评估聚合物在不同溶剂下的溶解度特性，为聚合物的应用和加工提供了重要依据。
利用液相色谱仪进行溶解度分析还可以帮助研究人员优化聚合物的合成工艺，探索聚合物与溶剂之间相互作用的规律。
简述常见液相色谱种类及其基本原理
简述常见液相色谱种类及其基本原理
液相色谱是一种通过固定相与移动相间的相互作用，实现物质分离的分析方法。
常见的液相色谱种类及其基本原理如下：
1. 反相色谱：反相色谱是液相色谱中最常用的一种色谱方法。
其基本原理是利用极性不同的液相固定相和流动相之间的相互排斥作用，分离出样品中的化合物。
其中，固定相是疏水性的，通常是含有烷基或芳香环的硅胶、氧化铝等材料；流动相则是极性的，通常是水-有机溶剂混合物。
2. 核壳色谱：核壳色谱是一种高效液相色谱技术，其原理是将核壳固定相涂覆在微粒表面上，提高了分离效率。
固定相通常是二氧化硅或其它材料，制备过程中需采用特殊的表面处理技术。
3. 离子交换色谱：离子交换色谱则是利用固定相上的离子官能团与含有相反电荷的离子间吸附作用，将离子物质分离出来。
离子交换固定相通常是一种特殊的树脂材料，可选择阴离子或阳离子交换。
4. 蛋白质色谱：蛋白质色谱是一种针对生物大分子分离的液相色谱技术。
其特点是固定相上的官能团对蛋白质具有特异性结合作用，从而实现蛋白质的分离。
固定相通常是含有硫醇、酸、碱官能团的材料。
5. 超高效液相色谱：超高效液相色谱是一种新兴的色谱技术，其基本原理是采用高压泵将极细微的分散固相颗粒推入色谱柱
中。
由于固相颗粒极小，因此大大提高了分离效率，缩短了分离时间。
液相色谱基本知识
液相色谱基本知识一、液相色谱原理液相色谱是一种基于不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡原理的分离技术。
当流动相流经固定相时，不同物质在固定相中的保留时间不同，从而实现分离。
通过选择合适的固定相和流动相，以及调整流动相的速度，可以实现对不同物质的分离和纯化。
二、液相色谱种类根据固定相的不同，液相色谱可以分为硅胶柱色谱、氧化铝柱色谱、活性炭柱色谱等多种类型。
根据流动相的不同，液相色谱可以分为正相色谱和反相色谱。
正相色谱中，固定相的极性大于流动相的极性；反相色谱中，固定相的极性小于流动相的极性。
三、液相色谱操作步骤1. 样品准备：将待分离的样品进行适当处理，以便于后续的分离和纯化。
2. 装柱：将固定相装入色谱柱中，确保固定相填充均匀。
3. 平衡：在流动相中平衡色谱柱，使固定相和流动相充分接触。
4. 进样：将待分离的样品加入色谱柱，开始分离过程。
5. 洗脱：使用流动相洗脱样品中的各组分，并收集洗脱液。
6. 检测：对收集到的洗脱液进行检测，确定各组分的含量和纯度。
四、液相色谱应用领域液相色谱在多个领域有着广泛的应用，如医药、生物、环保、食品等。
在医药领域，液相色谱可用于药物的分离和纯化；在生物领域，液相色谱可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化；在环保领域，液相色谱可用于污染物的分离和检测；在食品领域，液相色谱可用于食品添加剂、农药残留等的检测。
五、液相色谱优缺点1. 优点：液相色谱具有分离效果好、分离速度快、适用范围广等优点。
同时，液相色谱还可以与质谱等检测手段联用，提高检测灵敏度和准确性。
2. 缺点：液相色谱需要使用有机溶剂作为流动相，可能对环境和人体健康造成一定影响。
此外，液相色谱的设备成本较高，操作复杂度也相对较高。
六、液相色谱仪器设备液相色谱常用的仪器设备包括高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计、质谱仪等。
其中，高效液相色谱仪是实现液相色谱分离的核心设备，它包括泵、进样器、色谱柱、检测器等部分。
液相色谱特点及主要类型
01
02
03
硅胶色谱
硅胶作为固定相，具有高 稳定性、高分离效能和广 泛的应用范围。
活性炭色谱
活性炭作为固定相，具有 高吸附性能，常用于分离 大分子物质。
凝胶色谱
凝胶作为固定相，根据分 子大小进行分离，常用于 分离大分子物质。
按流动相类型分类
有机溶剂色谱
使用有机溶剂作为流动相，具有较高的分离效能和选择性。
该方法适用于分离具有较强疏水性的化合物，如脂肪酸、酯等。
有机溶剂流动相液相色谱具有较高的分离效能和灵敏度，但有机溶剂的使 用可能对实验操作人员和环境造成一定危害。
缓冲液流动相液相色谱
缓冲液流动相液相色谱使用 缓冲液作为流动相，以调节 pH值和改善待测组分在固定
相上的保留能力。
该方法适用于分离酸性和碱 性化合物，如氨基酸、蛋白
水溶性色谱
使用水或水溶液作为流动相，常用于分离水溶性物质。
离子交换色谱
使用离子交换剂作为固定相，根据离子的性质进行分离。
液相色谱的特点
CHAPTER
高分离效能
液相色谱法采用固定相和流动相的相 互作用，使不同组分在色谱柱中实现 高效分离。通过优化色谱条件，可以 实现复杂样品的高效、快速分离。
质等。
缓冲液流动相液相色谱具有 较高的分离效能和稳定性， 但缓冲液的选择和配制可能 较为繁琐。
谢谢
THANKS
通过选择合适的检测器，可以实现对目标化合物的灵敏、 准确和专属性的检测，提高分析方法的可靠性。
04 液相色谱的主要类型及特点
CHAPTER
硅胶基质液相色谱
硅胶基质液相色谱是一种常用的液相色谱类型，其分离原理主要基于硅胶表面的硅 醇基与待测组分之间的相互作用。
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7. 疏水作用色谱
(Hydrophobic Interaction Chromatography）
Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity
有机酸、有机碱特别是强酸、强碱的分析，如羧酸、 磺酸、胺类、酚类、药物、染料等
应用
4. 离子色谱法
采用离子交换剂为固定相的方法，固定相可分为强 酸型（磺酸基团）、强碱型（季铵基）、弱酸型 （羧酸）、弱碱型（伯、仲、叔胺） 流动相：分离阳离子，一般采用无机酸如HCl，HNO3
等；分离阴离子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3
Often need spacer arm
Spacer arm
AC ver 990326 30
but watch out for adsorption to the spacer!
载体活化、配基连接、吸附、洗脱
亲和色谱分离原理
Competitive elution
流动相的选择原则
涡流扩散项
纵向扩散
流动相传质
滞留区传质
固定相内传质
对速率方程的讨论
选用细颗粒填料可获高柱效
流动相流速低，有利于达到高柱效
选用黏度小的流动相有利于提高柱
效
温度的影响
柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
三、高效液相色谱仪
高效液相色谱仪流程
聚合物基质材料
交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯等。 pH 稳定性好：pH 1－ 13。 可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子 交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。 在中等 pH 条件下对强碱性物质具有更好的峰形。 填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩。 分离效率相对硅胶而言比较低 重现性不好
0.01-1.0
1-20 50-200 2-50 1-10
20-300
0.05-1.0 2-30 104-105 10-6-10-2
高效液相色谱法的特点
高压
高速 高效 高灵敏度
HPLC分离过程示意图
二、高效液相色谱理论基础
高效液相色谱中的速率方程
2 2 Cm d p Cs d p Cs d 2 Cd Dm f H 2d p ( )u u Dm Dm Ds
（2）示差折光检测器
结构
响应特性
通用性检测器
低灵敏度
基线易受温度的影响
不适合梯度洗提
（3）荧光检测器
结构
响应特性
选择性检测器。如PAH，蛋白质
高灵敏度，比紫外高约1000倍
适合梯度洗提
（4）蒸发光散射检测器
结构
特点
通用检测器 灵敏度高 可梯度洗脱 响应与质量有关
1．梯度洗脱的特点
（1）改善分离, 加快分析速度； （ 2 ）改善峰形 , 减少拖尾 , 有利于 痕量组分的检测；
（3）增加峰容量；
（ 4 ）强烈滞留的组分不容易残留 在柱上, 保持柱性能长期良好； （ 5 ）下次分析时 , 流动相需要一 段平衡时间；不同溶剂的 UV吸收程
度稍有差异, 可能会引起基线漂移。
予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。
流动相的优化
流动相的优化主要是考察流动相组成对保留 时间、分离因子和分离度等参数的影响。 使用混合溶剂最大优点是：获得最佳的分离 选择性；保持流动相的低粘度, 从而保证高的 柱效。 在吸附色谱中混合溶剂选择规则： 混合溶剂中
极性强的组分含量大或小时 , 有最大的 值；能与溶
等，不同极性取代基的化合物，结构异构体和几何
异构体混合物的分离。
应用举例
3. 离子对色谱法
在流动相中加入与样品离子电荷相反的离子（称为对 离子或反离子），使其与样品离子结合生成弱极性的 离子对（中性缔合物）的分离方法。 固定相与流动相多与反相键合相相同
离子对试剂：四丁基铵正离子、十六烷基三甲基铵正 离子，ClO4-，十二烷基磺酸根等
（5）电导检测器
结构
响应特性
选择性检测器，对离子型化合物有响应
灵敏度高 受温度的影响 不能梯度洗提
四、HPLC的主要类型
化学键合相色谱法 液固色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 体积排阻色谱法
HPLC固定相分离原理
根据样品性质选择固定相和流动相
分离模式的选择
1. 化学键合相色谱法
分析柱 微孔柱 半制备柱 制备柱
Influence of Particle Size on the Separation effect
3的关系
压力与制备量的关系
5．检测系统
紫外检测器(UV) 示差折光检测器(RI) 荧光检测器 蒸发光散射检测器(ELSD) 电导检测器
1.
2. 3.
目前应用最为广泛的基质材料。
高机械强度和高的比表面积。 可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交 换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。
4. 5. 6. 7.
高效。 重现性好。 pH 适用范围为pH 2－8。 具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。
Source RPC
聚合物形态
印迹聚合物
HPLC 色谱柱的构成
类 型 内径D (cm)
0.3 – 0.46 0.1, 0.21 0.8 – 1.0 2.0 – 5.0
柱长(cm)
3 - 25 15, 25 10 - 25 10 - 25
粒径 (µ m)
3 - 10 3 - 8 5 - 20 5 - 20
Mechanism of HIC
A 280
0.04 AU
Na2SO4 1.0 M
疏 水 层 析 操 作
8. 亲和色谱
（Affinity chromatography）
Steric considerations & spacer arms
Small ligand (<1,000)
Risk of steric interference with binding between matrix and target molecule
高效液相色谱仪
高压输液系统
往复泵原理示意图
进样系统
六通进样阀结构示意图
分离系统——色谱柱
包 括 柱 体 和 固 定 相 两 部 分
HPLC色谱柱及其填料的特征
HPLC 色谱柱的基质材料
硅胶
聚合物
色谱柱结构
常用HPLC填料种类
多 孔 微 球 灌 流 色 谱
薄 壳 型
整 体 柱
硅胶基质材料
高效液相色谱法
HPLC
一、高效液相色谱法的特点
GC 应用范围 HPLC
热稳定、低沸点的 热不稳定、高沸点、 物质 离子型的物质
热力学理论
分析成本 分离能力
较成熟
低 与柱的类型有关
发展中
高 较高
经典液相色谱法 粒径(μm) 75-600
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
柱前压力(atm)
分析时间 (h) 色谱柱长度(cm) 柱效(块/m) 样品用量(g)
（1）紫外检测器
固定波长的紫外检测器
可变波长的紫外检测器
二极管阵列检测器
二极管阵列检测器
二极管阵列检测器之三维图
响应特性
选择性检测器，如芳烃类化合物的检测
灵敏度高，可检测10-9g/mL的物质 线性范围宽，104-105 对温度及流动相的改变不敏感 适合梯度洗提 HPLC常规检测器
质发生氢键作用的溶剂, 有较好的分离选择性。
梯度洗脱技术
梯度洗脱（溶剂程序）：通过改变流动相的组成 来调整组分的k’值，改变分离因子α值，以达到 最短时间内得到最佳分离的目的。 为什么程序升温在液相色谱中没有受到青睐？
在液相色谱中最低温度和最高温度受到流动相的 黏度和沸点的限制；同时它的温度效应比较小。
Mini Q PC 3.2/3: Glutathione synthetase
6. 体积排阻色谱法（SEC）
以多孔凝胶为固定相，利用精确控制的凝胶孔径， 使样品中不同分子大小的组分得以分离。 用于分离分子大小差大于10%的样品 大分子的分离分析，聚合物分子量分布的测定
分类
使用水溶液为流动相的凝胶过滤色谱法（GFC ），
2．梯度洗脱的主要条件
① A 流动相/弱溶剂组成； ② B 流动相/强溶剂组成； ③ 梯度时间；
强溶剂 A%
④ 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。
time
5
2
硅胶基质固定相，主要用于分析多肽、蛋白质、核 酸、多糖等。
使用有机溶剂为流动相的凝胶渗透色谱法 (GPC) ， 高密度聚苯乙烯二乙烯苯固定相，主要用于高聚物
（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的测定
凝胶渗透色谱分离原理图
在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流 经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以 分离 优点： 操作简便 分离效果好，重复性高，回收率高 分离条件温和 应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐 分辨率低
凝胶色谱填料