人凝血因子8分离纯化工艺分析
人凝血因子8分离纯化工艺分析ppt课件
进一步纯化
借助亲和层析、层析后处理等方法,进一步提高凝血因子8的纯度
和活性。
离心分离-离子交换层析
离心分离
利用离心力将血浆成分按密度差异进行分离，去除杂质和红细 胞等不需要的部分。
离子交换层析
通过离子交换介质对带电荷的生物分子进行吸附和洗脱，实现 目标蛋白的进一步分离纯化。
层析参数优化
调整pH值、离子强度等因素，确保凝血因子8在层析过程中保 持活性并实现高效分离。
通过离心分离和层析等技术,可以有效去除 血浆中的杂质物质,如血细胞碎片、脂肪颗 粒等,确保最终产品纯度满足标准要求。
病毒去活
采用化学处理、热处理等方法对血浆制品 进行病毒灭活,可有效降低病毒感染风险,提 高产品的安全性。
质量控制
通过严格的质量检测,确保 final 产品符合相 关规范和标准,为患者用药提供可靠保障。
测试项目 理化性质 生物活性 杂质分析
评价重点
测试方法
pH值、溶解度、粘度 等
标准分析仪器测试
目标蛋白的功能活性
细胞活性测试、酶活 性测试等
高聚物、降解产物等
色谱、电泳等检测方 法
通过稳定性研究,可以确定产品的有效期,为产品的储运和保管提供依据,确保患者 用药的质量和安全。
杂质的去除及病毒去活
杂质去除
亲和层析-层析后处理
亲和层析 1
利用目标蛋白与亲和介质的特异性结合原理分离纯化
层析后处理 2
包括脱盐、浓缩、病毒灭活等步骤
质量控制 3
确保最终产品符合国家标准和注册要求 亲和层析是人凝血因子8分离纯化的关键步骤之一。它利用目标蛋白与特异性亲和介质的结合原理，实现高选择性的分离。层析后还需进 行脱盐、浓缩等处理，并进行病毒灭活等质量控制步骤，确保最终产品安全有效。
人凝血因子_的纯化
果做比较, 计算 FÕ (或 FÒ 、F× 、FÚ )的 百分 活性, 以 1 m l 正常人新鲜血浆中的 FÕ ( 或 FÒ 、F× 、FÚ )的 百分活 性作 为 1个活性单位 ( U )。 1. 7 紫外分光光度法测蛋白含量 将 1 mg /m l的牛 血清白
层析柱 ( 2. 6 cm @ 26 cm )用平衡液 (配方及 条件同上 )平衡, 然后将上述溶解后的 样品上柱, 平衡液冲洗直到紫外检 测值 回到基线; 再分别用 0. 1、0. 2和 0. 3 m o l/L NH4 C l的缓冲 液 做阶段洗脱 , 流速为 180 cm /h; 用 收集器按 10 m l/管收集, 隔 管检 测 FÕ B C。将 FÕ B C\ 2 U /m l 的 组 分 进 行 收 集, 用 01 22 Lm 的膜过滤, 检测总 FÕ B C和蛋白含量。用 超滤器 超 滤至适当体积。
v 通信作者: 肖小璞 ( 1953) ) , 女, 主任技师, 硕 士研究生导师, 主要 从事 血栓 与止 血相关 蛋白 质的 研究, 电话: 028-68169101, Em ai:l x-i aopux iao@ vip. sina. com
1 材料与方法
1. 1 实验用血浆 共 30袋 ( 600 g /袋 ) , 2008 年 7月 28日 由什邡单采血浆 站采 集、提供, 质 量符 合 5中 国生 物制 品规 程 6相关要求。 1. 2 仪器与试剂 层析纯化系统 ( AKTA explo re r 100 air, 美 国 GE公司 ); 垂直电泳 仪 ( EPS-601, 美国 GE 公司 ); 大容量 低温冷冻 离心机 ( SORVALL RC 3BP+ , 美国 Therm o 公司 ); 超滤器 (M icon8050, 美 国 M icon公 司 ); 紫 外-全 波长 分 光光 度计 ( UV2900, 日 本 日立 公 司 )。 Benzam id ine hydrochloride ( 2726b015, 美 国 P romega 公 司 ); 胰 蛋 白 酶 抑 制 剂 ( 90234021, 美 国 R oche 公 司 ); 二 异 丙 基 氟 磷 酸 ( DFP ) ( 55914, 美国 S igm a公司 ); 缺乏 FÒ 血浆、缺乏 FÕ 血浆、缺 乏 F × 血 浆、缺 乏 F Ø 血 浆、缺 乏 F Ú 血 浆 ( F Ò - ID5020071127, F Õ- ID-5020071127, F × - ID-5020071127, F Ø ID-5020071127, F Ú -ID-5020071127, 美 国 HT I 公 司 ) ; PT 检 测试剂盒 ( 20071208, 成都协和生物技术中心 ); A PTT 检测试 剂盒 ( 20060402, 成都协和生物技术中心, ) ; 高分子量 M a rker ( IC0765, 美国 invitrogen公司 ); 其它试 剂均为国产分析纯。 1. 3 血浆前处理 1. 3. 1 加入酶抑制剂 将保存于 - 80e 新鲜冰冻血浆 1 L, 于 4e 放置 5 h, 37e 水浴迅 速融化, 然 后将血 浆转 入 4e 降 温, 加入酶抑制剂, 使终浓度达到如下标准: 2 mm o l/L Benzam id ine hydrochlor ide、1 mm o l/L DFP、50 mg /L 胰蛋 白酶 抑制 剂。用磁力搅拌器边搅拌边加入。 1. 3. 2 柠檬酸钡沉淀吸附 在经处理的血浆中加入 1 mo l/L BaC l2 80m ,l 4e , 边搅拌边逐滴缓慢加入, 30 m in加完, 然后继 续搅拌 30 m in, 静置 10 m in, 4e , 6 000 g离心 10 m in, 取上清。 1. 3. 3 PEG-6000分级沉淀 在 上清中加入 PEG 6000使终
人凝血因子Ⅷ提取工艺优化研究
人凝血因子Ⅷ提取工艺优化研究邓志华;何淑琴;梁小明;张丽铃;黄璠【摘要】Objective Optimal human coagulation factor Ⅷ in plasma extracts process cond-itions. Methods With human plasma cryoprecipitate as raw materials,human factor VIII activity recovery rate as the evaluationindex,the single factor test was used to study the amount of alumina,the adsorption of pH value,pH value of acid precipitation,optimum extraction process. Re-sults Add cold precipitation of 12% alumina gel of 3% and the pH value is adjusted to 7.1,then adsorbed. The human factor Ⅷspecific activity ratio can reach 9.50IU/mg in the supernatant,acid precipitation when the pH value is adjusted to 6.3,human fac-torⅧspecific activity was 11.50 IU/mg in the centrifugal supernatant. Af-ter the above two steps,the human facto rⅧspecific ac-tivity increased nearly 2 times. Conclusion The optimization process is reasonable,feasible,could reach purification,extra-ction of human coagulation factorⅧ.%目的：优化血浆中人凝血因子Ⅷ提取工艺条件。
冻干人凝血因子Ⅷ浓制剂制造及检定规程
冻干人凝血因子Ⅷ浓制剂制造及检定规程本品系由乙型肝炎疫苗免疫健康人的新鲜血浆分离、提纯、冻干并经病毒灭活制成。
主要成份为人凝血因子Ⅷ及少量纤维蛋白原，含适量枸橼酸钠，不含防腐剂。
本品对缺秒人凝血因子Ⅷ所致的凝血机能缺陷具有纠正作用，专供防治甲型血友病患者的出血症状。
1 制造1.1制造要求1.1.1 对血浆的要求1.1.1.1所用之血浆来源应符合《原料血浆采集（单采血浆术）规程》要求，血浆应无凝块、无纤维蛋白析出，非脂血，无溶血。
在采集时应减少皮肤损伤，保持血流通畅，并与抗凝剂充分混合，用塑料袋采集。
新鲜分离液体血浆或新鲜冰冻血浆及冻结冷沉淀，均可用于生产。
1.1.1.2分离后的血浆应保持无菌，并应及时冰冻保存。
自采血到冻结一般在8小时内完成。
液体血浆应在4±2℃贮放，贮放时间应不超过小时，最长不得超过12小时。
冰冻血浆（-30℃以下）保存期不超过6个月。
1.1.2 对制造工作室、设备及原材料的要求，与《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》中1.1.3～1.1.4项要求相同。
1.2 制造工艺1.2.1 采用低温乙醇法或冻融法制得冷沉淀，经抽提、吸附、精制，亦可采用经卫生部批准的其他工艺制备，并经卫生部批准的适宜方法进行病毒灭活处理。
1.2.2 分批同一制造工艺、同一容器混合的制品作为一批，不同滤器和不同机柜冻干的制品分为亚批。
1.2.3 稳定剂及防腐剂制品内允许加稳定剂，制品应不含防腐剂。
1.2.4除菌过滤及分装本品应用微孔薄膜过滤，可直接分装无菌的成品瓶内，每瓶装量根据效价及规格确定。
1.2.5 半成品检定每批半成品应进行效价测定及热原质试验，并按亚批做无菌试验。
1.2.6 冻干除菌过滤分装的制品经外观检查后立即冻结，并按《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》1。
2。
5项规定进行冻干，但制品温度不得超过35℃。
1.3 规格每瓶含人凝血因子Ⅷ的效价可有50、100、200、300、400IU五种，制品的效价应标示在瓶签及包装上。
人凝血因子Ⅷ效价测定二步法
人凝血因子Ⅷ效价测定二步法1 材料1.1试剂1.1.10.05mol/L CaCl2溶液称7.35gCaCl2·2H2O（分析纯），加蒸馏水溶解，稀释至1000ml。
1.1.20.025mol/L CaCl2溶液称3.675gCaCl2·2H2O（分析纯），加蒸馏水溶解，稀释至1000ml。
1.1.3 咪唑缓冲液称0.68g咪唑和1.17gNaCl，溶于约100ml蒸馏水中，加37.2ml0.1mol/l HCl，加蒸馏水至200ml，pH为7.3～7.4。
1.1.4 枸橼酸盐-氯化钠溶液1份3.8%枸橼酸三钠溶液加5份0.85%NaCl溶液混匀。
1.1.5Al(OH)3胶a称（NH4）2SO45.5g，溶于150ml63℃蒸馏水中。
B称氨明矾19.175g，溶于250ml58℃的蒸馏水中。
C最取12.5ml氨水（比重0.88），加12.5ml蒸馏水。
三种溶液配毕后，立即将c液迅速倒入a液中搅匀，然后在搅拌下将此混合液迅速倒入b液，用力搅拌10分钟（保持温度不低于58℃），离心（2500r/min，15分钟），弃上清，沉淀洗涤5次。
第一次：用75ml蒸馏水加0.055ml氨水（比重0.88）混匀，离心，弃上清。
第二次：用75ml蒸馏水加0.11ml氨水（比重0.88）混匀，离心，弃上清。
第三、四、五次分别用75ml蒸馏水洗。
将沉淀物悬浮于总体积为175ml蒸馏水中，混匀，分装，4℃保存。
1.1.6 正常人血清分别收集20份以上正常人血于干燥灭菌的玻璃瓶中，待血凝固后，放于37℃保温5～6小时，置4℃冰箱过液，分离血清，混匀，定量分装（0.5ml/安瓿），冷冻干燥，-20℃保存。
缓冲液作1∶10稀释，4℃冰箱过夜（使血清活化），试验当日再用咪唑缓冲液作最适浓度稀释（一般为1∶20），置冰浴备用。
1.1.7 牛Ⅴ因子收集公牛血于干燥灭菌的玻璃容器中，室温放置4小时，离心（2500r/min，30分钟），分离血清，取血清加10%（g/ml）BaSO4在室温下搅拌吸附40分钟，离心（2500r/min，40分钟），弃沉淀，定量（1ml/瓶）分装，冷冻干燥，-20℃保存。
最新八因子层析工艺立项建议-填料与层析柱0710
八因子层析工艺立项建议-填料与层析柱07102007年10月关于八因子项目的层析工艺立项提案（社外秘）一、工艺路线借鉴国内外成熟的层析纯化工艺经验，结合自身的研究开发。
人血浆八因子的主要工艺技术路线（推荐）：1步层析工艺 + 2步病毒灭活（其他步骤略）说明：以下的提案内容仅涉及层析工艺部分的内容。
二、项目开发计划1、前期准备工作公司内部调研、公司外部调研、讨论该项目开发的必要性和可行性等2、提案与立项与供应商间进行交流、完成项目投资成本的初步估算；八因子项目的研发提案、公司高层的研究决策；八因子项目研发工作的正式立项3、小试阶段层析纯化介质、层析柱的选择；层析纯化条件的优化；层析纯化工艺的初步确立注：拟使用层析纯化介质为Toyopearl DEAE-650M（日本TOSOH公司产品）小试用预装柱柱尺寸：Toyopearl DEAE-650M PAK 22mmI.D.*20cmL （76mL·gel）4、中试阶段中试用层析柱的选择；层析纯化条件的进一步优化；（载量、纯度、回收率等指标的确认）批次重复/再现性试验；层析工艺的确立5、设备的引进、安装与调试层析纯化介质使用量的讨论、决定及购买；层析柱选用的讨论、决定及购买；安装调试等6、规模化试生产7、工艺验证（纯化工艺、病毒灭活工艺等）多方通力合作，完成八因子制备工艺的验证工作8、报批9、临床……三、项目投资成本的初步估算（层析工艺部分）（一）、层析纯化介质部分1、纯化介质的选用产品：Toyopearl DEAE-650M（日本TOSOH公司）纯化介质粒径分布范围：40-90微米纯化介质孔径大小：1000埃Toyopearl DEAE-650M填料的其他指标请参照产品说明书。
2、纯化介质使用量的算出工艺路线一：从血浆直接制备八因子回收率：根据进料量的不同，回收率会出现差异。
经验表明，回收率一般在50-90%。
（我们的目标为>70%）纯度：100-500 I.U./mg·八因子前提假设1：0.5I.U.·八因子/mL·血浆DEAE-650M的载量：50 I.U.·八因子/mL·DEAE-650M每mL DEAE-650M的血浆处理量：100 mL·血浆/mL·DEAE-650M·批次前提假定2：使用50L的DEAE-650M纯化介质50L DEAE-650M的血浆处理量：5,000L·血浆/50L·DEAE-650M·批次前提假定3：纯化介质在使用15-20个批次后进行更换50L DEAE-650M使用15-20个批次后的血浆处理总量：75,000L-100,000L·血浆/50L·DEAE-650M·（15-20）批次前提假设4：每L血浆重量为1Kg50L DEAE-650M使用15-20个批次后的血浆处理总量：75-100吨·血浆/50L·DEAE-650M·（15-20）批次结论：采用工艺路线一、并结合上述前提假定的情况下，当使用50L DEAE-650M填料进行八因子的纯化时，累计可处理75-100吨血浆原料。
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01
相关背景
性质
结构
内容
六个结构域， 结构复杂
分子量
等电点 血浆含量 半衰期
330KD
4.3左右 0.1-0.2μg/ml 12h
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相关背景
原材料：人新鲜冰冻血浆 主要杂质：人纤维蛋白原、人纤维结合蛋白、白蛋白、其他凝血因子等
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02 分离纯化工艺
关键步骤：
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02 分离纯化工艺
冷沉淀中所含杂质： 杂质 人纤维蛋白原 人纤维结合蛋白 白蛋白 FⅨ FⅡ FⅦ FⅩ 分子量 340KD 450KD 67KD 56KD 72KD 50KD 59KD 等电点 5.2-5.6 5.5左右 4.7-4.9 4.0-4.6 4.1 4.0-4.6 4.1-4.6
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02 分离纯化工艺
2. 乙酸缓冲液调节pH —— 等电点沉淀法
调节温度为15℃，pH6.3左右 去除等电点较高的人纤维白蛋白和人纤维结合蛋白
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02 分离纯化工艺
3.Al(OH)3 吸附 —— 吸附分离法 （负吸附） 使用Al(OH)3 作为吸附剂，通过预实验确定铝胶含量为12%。由于该吸附剂为两性离子，在pH7.1 （预实验确定）左右时带正电，易于吸附小分子酸性蛋白，去除F Ⅸ、F Ⅱ、F Ⅶ、F Ⅹ 等
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02 分离纯化工艺
4. DEAE 650M 弱阴离子交换凝胶 —— 离子交换层析 固定层析过程为pH7.0,通过调节缓冲液盐浓度来改变蛋白结合能力，进行洗脱。 梯度洗脱方案：
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02 分离纯化工艺
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02 分离纯化工艺
5. 病毒灭活 （1）S/D处理法 灭活脂包膜病毒 （2）100℃ 30min 干热灭活法灭活非脂包膜病毒
The Preparation Procedure of Human Coagulation Factor ⅷ
人凝血因子 ⅷ 的分离纯化工艺
制作人：龙益如 班级：144092
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01
相关背景
FⅧ
FⅨ
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相关背景
人凝血因子Ⅷ是人血浆中一种非常重要的凝
血因子，其缺失或缺乏会引起不同程度的甲型血
友病——一种连锁隐性遗传的出血性疾病，严重 时甚至会危及患者的生命。甲型血友病是一种终 生性疾病，目前仍没有根治的方法，只能通过输 注产品进行替代性治Procedure of Human Coagulation Factor ⅷ
谢谢您的观看与聆听
制作人：龙益如 班级：144092
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