临床对解脲支原体(uu)的检测方法
生殖道解脲支原体感染与自然流产的临床探讨
生殖道解脲支原体感染与自然流产的临床探讨【摘要】目的：探讨解脲支原体（uu）与自然流产的相关性。
方法：采用免疫层析法和分离培养法对150例自然流产者（观察组）和150例人工流产患者（对照组）的宫颈分泌物进行uu的检测。
结果：①观察组宫颈分泌物uu的总检出率为90.00%，对照组为43.33%，两组比较差异有统计学意义（p<0.05）。
②自然流产次数≥2次者， uu检出率与只有1次自然流产史者相比，差异有统计学意义（p<0.05）。
结论： uu感染与自然流产的发生可能相关，尤其与复发性自然流产关系密切，对自然流产患者进行uu的检测并积极治疗对防止不良妊娠结局再次发生有重要意义。
【关键词】解脲支原体；自然流产【中图分类号】r711 【文献标识码】a 【文章编号】1004—7484（2013）09—0128—01支原体是目前国际上最为关注的与不良妊娠结局相关的病原体之一，特别是解脲支原体能在妊娠的全过程定位于滋养细胞内并增殖，引起细胞超微结构的改变，[1～5]，反复自然流产或胚胎停育均为病理现象，其病因非常复杂。
目前认为其可能的病因除遗传、内分泌、生殖器官解剖异常、自身免疫性疾病外，尚有生殖系统感染，而妊娠妇女生殖道支原体感染可能是早期流产的重要原因之一。
本课题收集大量样本研究解脲支原体与早期自然流产的关系，以便在今后自然流产的病因学研究中，解脲支原体感染应作为一个重要因素加以考虑。
1 资料与方法1.1 研究对象 2011年2月～2013年4月河南省中医院生殖中心收集的300例自然流产妇女作为观察组，自然流产发生年龄20～36岁，平均（25·6±3·4）岁；发生孕周5～12周；发生次数1～4次；既往成功妊娠次数0～2次；经外周血检测排除 torch的近期感染；经相关检排除生殖器官畸形，遗传性及内分泌疾病、血型不合及免疫异常；此外，经配偶的精液检查，排除配偶精液质量不佳的问题并排除配偶染色体异常。
解脲脲原体UU
解脲脲原体(UU)一解脲脲原体（ureaplasma urealyticum，UU）感染解脲脲原体又叫解脲支原体、溶脲脲原体，是支原体的一种，因为能够合成尿素酶分解尿素而命名。
现已明确解脲脲原体是引起性传播疾病的病原体之一。
解脲脲原体的主要致病原因是掠夺宿主细胞膜固醇等脂类营养，分解尿素，产生大量毒性代谢产物氨类，损害细胞，并可促进局部形成结石。
在非淋球菌性尿道炎中，除衣原体外，解脲脲原体的感染占第二位，有30～40%的男性尿道炎是由解脲脲原体感染所致。
解脲脲原体可形成继发感染，在淋球菌尿道炎患者中解脲脲原体的检出率高于非淋球菌性尿道炎的2.16倍，也是一些淋病患者治愈后仍有后遗症的原因之一。
大量的研究证明解脲脲原体与自然流产、先天缺陷、死胎和不孕症有关。
自然流产1～8次妇女的宫颈分泌物或流产胎儿组织解脲脲原体的检出率为68%，其中流产超过4次以上者检出率高达80%，而正常妇女检出率仅为10.5%。
国内对2181例不孕患者研究报道，解脲脲原体检出率明显高于对照组。
阳性患者经强力霉素治疗后转阴者为83.7%，其中恢复妊娠者为38.7%，说明不孕症与解脲脲原体感染高度相关。
解脲脲原体感染除引起男性非淋性尿道炎、前列腺炎、附睾炎外，还被认为与男性不育相关，男性不育患者精液中，脲原体检出率高达66.6％。
检出率随精子数减少和精子活动力下降而升高。
有研究证明解脲脲原体引起不孕症的原因可能是：①吸附于精子表面，阻碍精子运动；②产生神经氨酸酶样物质，干扰卵子与精子的结合；③解脲脲原体与精子有共同抗原，刺激机体产生的抗体对精子造成损伤。
二荧光探针定量PCR方法检测UU-DNA的意义对UU感染的病原学诊断通常可用简便的培养法和免疫荧光抗体来检测，但阳性率偏低，而且费时。
培养法检测是利用脲原体能合成尿素酶分解尿素产生氨，使液体培养基pH 值增高，酚红指示剂变色。
一些非致病的脲原体或培养过程中的污染都可能导致假阳性的结果。
利用液体培养法检测解脲支原体的特异性分析
利用液体培养法检测解脲支原体的特异性分析摘要】目的探讨利用单相液体培养法培养解脲支原体的特异性。
方法分别采用液体培养法和固体培养法对215例非淋病性泌尿生殖道炎症患者进行了解脲支原体检测分析,以固体培养法作为对照，分析液体培养法的特异性。
结果采用液体培养法进行解脲支原体的检测，出现了59例假阳性标本，特异性仅为65.6%。
结论采用液体培养法进行解脲支原体的检测，特异性不高。
经常会出现假阳性。
只能作为临床实验室的初筛实验。
【关键词】解脲支原体液体培养法固体培养法解脲支原体是导致人体泌尿生殖系感染的主要病原体,可以引起非淋球菌性尿道炎、阴道炎、慢性前列腺炎。
解脲支原体还可以通过胎盘感染胎儿，引起自发性流产、死胎与低体重胎儿，并吸附于精子表面，阻碍精子与卵子结合，引起不孕[1,2]。
在我国此病发生率已逐年呈上升趋势。
实验室检查是诊断和发现解脲支原体的重要手段,而选择合适的检查方法对临床准确诊断具有重要意义。
其中利用常规的单相液体培养基，通过液体变色来完成检测占有相当大的比重。
为了了解这种方法的特异性，我们分别利用液体培养基和固体培养基对215例非淋病性泌尿生殖道炎症患者进行了解脲支原体培养。
现将分析结果报告如下。
1 材料与方法1.1病例来源：2006年9月至2009年9月对我院性病门诊就诊后被确诊为非淋病性泌尿生殖道炎症的患者215例,实验组采用液体培养基试验对解脲支原体进行培养检测。
对照组采用采用固体培养基试验对解脲支原体进行培养检测检测,两组患者其它方面均无差异，无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2试剂：液体培养基是由珠海市迪尔生物工程有限公司提供的支原体（Uu/Mh）分离培养药敏试剂盒。
固体培养基由上海第二医科大学生产。
1.3标本采集方法：标本采集前，患者应停止使用全身及局部抗生素1周以上。
男性患者禁排尿2h以上，用一次性无菌棉拭子由前尿道2～4cm处取分泌物；女性患者先清洁宫颈口分泌物，用一次性无菌棉拭子在宫颈管内1～2cm处取分泌物，拭子应在宫颈（或尿道）内旋转并至少停留20s以上，取出时不触及阴道壁。
荧光定量PCR检测宫颈分泌物中解脲支原体
荧光定量PCR检测宫颈分泌物中解脲支原体张宁;唐轶;李力;段云葵;齐倩【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2001(019)003【摘要】@@我们用荧光定量PCR检测宫颈分泌物中Ureaplasma urealyticum(解脲支原体，简称Uu)，结果如下。
rn1 材料和方法rn1.1 仪器 PE-5700荧光定量PCR仪，万分之一天平Chyo JK180。
rn1.2 试剂盒达安基因诊断中心产品。
rn1.3 方法rn1.3.1 标本来源培养法阳性的解脲支原体感染病人的宫颈分泌物41份。
rn1.3.2 棉拭子取样法将长8 cm棉拭子装入长10 cm的塑料离心管中，加热封口，经60Co照射灭菌。
在分析天平上称量每只管的重量，标于管上。
取样时，在管上端剪口，取出拭子，插入宫颈口捻转并停留数秒，取样后小心放回试管中，立即送检，称取该管重量。
将取样后总管重量减去取样前总管重量即为所取宫颈分泌物的重量。
加入1 ml生理盐水，震荡提取分泌物，分取定量体积(d)于1.5 ml塑料离心管中，10 000 r/min 离心10 min,弃上清液，加入50 μl裂解液，沸水裂解10 min，吸取2 μl于反应管中与标准曲线反应管一同按下列条件扩增:93℃ 2 min预变性，然后按93℃ 45 S、55℃ 120 S共40个循环。
反应结束后电脑按标准曲线计算待测样品反应管中每微升体积Uu的考贝数(Copy/μl)，最后按下列公式计算每克分泌物中含Uu的拷贝数(Copy/g):rnCopy/g=(Copy/μl×50 μl)/(g×d/1000)【总页数】1页(P179)【作者】张宁;唐轶;李力;段云葵;齐倩【作者单位】中国人民解放军第202医院全军优生优育中心实验室,;中国人民解放军第202医院全军优生优育中心实验室,;中国人民解放军第202医院全军优生优育中心实验室,;中国人民解放军第202医院全军优生优育中心实验室,;中国人民解放军第202医院全军优生优育中心实验室,【正文语种】中文【中图分类】R446.5【相关文献】1.荧光定量PCR检测宫颈分泌物中病原微生物样本采集方法研究 [J], 张宁;唐轶;等2.解脲支原体在1000例已婚女性宫颈分泌物中的检出情况和药敏情况分析 [J], 赵佳;莫璟娟;徐建阳;尚贤文3.PCR法宫颈分泌物沙眼衣原体、解脲支原体检测在女性不孕症患者检查中的应用 [J], 安爱平4.不孕症患者宫颈分泌物沙眼衣原体和解脲支原体的检测及临床意义 [J], 宋玉美5.宫颈糜烂患者宫颈分泌物中沙眼衣原体、解脲支原体感染和分泌型免疫球蛋白、干扰素-γ水平及意义 [J], 侯春霞;孟梦;郭利彩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
应用固体与液体两种培养基检测支原体结果的比较
应用固体与液体两种培养基检测支原体结果的比较目前实验室用于检测泌尿生殖道解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)的方法主要有PCR法、培养法(液体、固体培养基)。
二合一液体培养基因具有快速且培养与药敏结果同时进行等特点而在临床广泛应用。
近来，有学者对液体培养基检测支原体的可信度提出质疑。
为了验证液体培养基的特异性，本研究采用临床标本拭子平行接种选择性固体培养基和液体培养基的方式，对两种方法检测结果进行了对比分析。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 试剂与仪器液体培养基：Uu和Mh分离、鉴定、药敏试剂盒(珠海丽珠试剂有限公司生产)。
固体培养基：Uu和Mh的选择性鉴定固体培养基(二合一培养基)带有CO2发生片(上海恩康生物科技有限公司生产提供)。
生产批号：060410,显微镜：日本奥林帕斯。
1.1.2 标本来源2006年5月至7月108例我院妇科和皮肤科门诊患者的泌尿生殖道标本拭子。
采集方法：男性患者用无菌棉球擦干尿道口后，用无菌棉拭子插入尿道口2～3厘米，轻轻旋转后取出；女性患者清除阴道口分泌物后，用无菌棉拭子插入宫颈口1～2厘米，轻轻旋转后取出。
用拭子先接种固体培养基然后用于液体培养基接种。
2方法2.1 接种方法先用拭子的一面“N”型划线接种固体培养基，然后立即进行液体培养基的接种。
均严格按照说明书进行，36℃培养。
2.2 结果判定方法液体培养基：分别于24至48小时观察液体培养基颜色由黄色变红色，严格按照结果判读表读取结果。
固体培养基：24小时后逐日观察培养基颜色的变化(黄色变为红色)，同时在显微镜下观察典型支原体菌落：Mh：煎蛋样菌落(100～300μm)，Uu：棕褐色颗粒、棕褐色菌线或棕褐色团块样菌落。
2.3 统计学方法Kappa检验(一致性检验)。
3 结果以显微镜下见到典型支原体生长菌落(如图所示)，结合生化反应确认Uu、Mh为“金标准”。
两种培养基支原体检测结果见附表。
108份标本液体培养基报告支原体阳性标本4l例，阳性率为37．96%；固体培养基检测的阳性标本37例，阳性率为34．26%。
解脲支原体几种临床检测方法的比较
分离法 +
荧光法
+
-
36 ( a)
5 ( b)
合计 41
剂器材部的产品 。试剂也由该公司提供 。
-
15 ( c)
30 ( d)
45
31计算 机 落 射 荧 光 显 微 镜 由 沈 阳 八 达 公 司 提 供 ,并使用相配 UU 荧光试剂 。
素影响 。而荧光染色法如果载玻片不洁净或者其它 因素污染标本 ,就会将污染颗粒或杂菌误染色荧光 绿 ,误认为是 UU。
使用 UUSM 单管培养基 ,与经典法相比 ,其符合 率高 ,二法结果无显著差异 ( PCR > 0. 05) ,说明单管 培养法 结 果 准 确 性 好 , 认 为 选 择 使 用 已 商 品 化 的 UUSM 作为培养基 ,效果不错 ,而且操作十分简便 ,结 果易判断 ,实验所需时间短 ,很适合基层医疗单位普 及开展 。
资 料 与 方 法
结
果
本文选择为多数学者公认的分离鉴定法作为金 标准 。
一 、经典分离鉴定法和荧光染色法检测结果及分 析 ,见表 1。
一 、一般资料 :采自本院妇科及泌尿科病人的宫
表 1 分离法与荧光法检验结果比较
颈分泌物及尿道分泌物标本共 86份 。 11解脲支原体选择性培养基 (UUSM )采用三明
腺炎 、流产 、产后热及新生儿低体重的重要原因之一 。 盖涂膜 ,在 37℃水浴箱中染色 20分钟 ,取出后用 PH
目前 ,泌尿生殖支原体感染的检测不仅是 STD 门诊 的常规项目 ,在泌尿科 、妇科 、妇幼保健和计划生育等 医疗单位已广泛进行监测和防治 。UU 的培养和鉴 定多采用以下几种方法 : 1. 经典的分离鉴定法 : 2. 简
PCR法和液体培养法检测解脲支原体结果分析
PCR法和液体培养法检测解脲支原体结果分析摘要：目的：比较聚合酶链反应（pcr）法和液体培养法在解脲支原体检测中的诊断价值和治愈判定价值。
方法：用聚合酶链反应（pcr）法和液体培养法对164例患者的泌尿生殖道分泌物进行检测解脲支原体。
结果：pcr法检测uu阳性71例，阳性率为43.3%，液体培养法阳性例数62例，阳性率为37.8%，pcr法阳性患者液体培养法有8例阴性，液体培养法阳性患者pcr法有2例阴性。
结论：pcr法检测解脲支原体，敏感性高，特异性强，并且简便、快速，适合门诊初查病人，液体培养法虽然敏感性比pcr法低，但能区别病原菌是否存活，且对指导临床用药有着不可替代的作用。
关键词：pcr法液体培养法解脲支原体【中图分类号】r4【文献标识码】a【文章编号】1671-8801（2012）11-0020-01支原体是泌尿生殖系统的正常寄生菌，属于条件致病菌，解脲支原体（uu）是支原体的一种，是引起泌尿生殖道非淋球菌性炎症中常见的病原菌之一[1]，可导致男女不育不孕、流产、死胎、女性生殖道炎症等一系列疾病。
在一般情况下，被感染者多数无明显临床症状，易被忽略，临床上的漏诊率和误诊率也相对较高。
常用检测uu的方法有液体培养法和pcr法，今对164例泌尿生殖道炎症患者同时采用pcr法和液体培养法进行检测，并对结果进行分析比较，报道如下。
1材料与方法1.1一般资料。
选择2012年6月我院门诊患者164例，其中男性26例，女性138例，年龄18-52岁。
用无菌棉拭子插入女性宫颈1.0-1.5cm或男性尿道2-3cm，转动10秒并停留数秒钟后将棉拭子取出密闭送检。
1.2仪器与试剂。
1.2.1pcr法。
仪器为达安基因股份有限公司生产的da7600全自动荧光定量pcr分析仪，试剂盒为达安基因股份有限公司的配套产品。
1.2.2液体培养法。
珠海浪峰生物技术有限公司生产的支原体培养、鉴定药敏试剂盒。
1.3方法。
1.3.1pcr法。
解脲-人型支原体分离培养与药敏实验分析
解脲/人型支原体分离培养与药敏实验分析目的：了解本地区解脲支原体耐药状况，指导临床合理用药。
方法：应用支原体微量培养及同步药敏试剂盒，检测解脲支原体及其药敏分析。
美满霉素、交沙霉素、克拉霉素三种抗生素敏感性高，不易产生耐药性，且耐药率变化不大；结论：临床治疗UU引起的非淋菌性尿道炎，本地区应推荐美满霉素、强力霉素、交沙霉素作为治疗解脲支原体的首选药物。
不论是UU单项感染或是UU+MH混合感染均产生多重耐药，支原体的耐药问题严重，治疗要根据药物敏感性报告用药。
提示：在进行治疗前做支原体药敏试验很有必要。
支原体（mycoplasma）是细胞外生存的最小微生物。
是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态，能在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。
它不同于细胞，也不同于病毒。
种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，涉及人、动物、植物及昆虫等多个领域，给人类健康和科研工作带来不利影响。
从人体分离的16种支原体中，5种对人有致病性，即肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体及发酵支原体。
脲解支原体属（ureaplasma）含脲解支原体等体、脲解支原体及人型支原体等对人有致病性。
肺炎支原体是呼吸道感染、肺炎的主要原因。
能引起人类泌尿生殖道感染的有解脲支原体（UU）、人型支原体（MH）、生殖道支原体等，其中最常见的是UU，约有30%～40%男性的非衣原体、非淋病性尿道炎是由UU所致；此外UU可通过胎盘感梁胎儿，引起早产、死胎、低体重胎儿和新生儿呼吸道感染。
由于不合理使用抗生素，支原体对常用抗生素耐药已非常普遍，对其进行培养及耐药性监测显得尤为重要。
解脲支原体（M.urealyticum）为支原体属中唯一的一个种，因生长需要尿素而得名。
菌落微小，直径仅有15～25um，须在低倍显微镜下观察，故旧称T株（tiny strain）。
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临床对解脲支原体（uu）的检测方法
(一)分离培养方法
Uu在含95% 氮气和5%CO2 环境中生长良好。
其生长最适pH为5.5-6.5,最适温度为36℃-37℃。
Uu具有尿素酶，能分解尿素产氨，使含酚红指示剂的Uu液体培养基pH值上升，颜色由黄色变为红色。
再将液体培养物转种到Uu固体培养基上，能生长成具特征性油煎蛋样集落。
(1 )液体培养基：支原体肉汤培养基80mL，马血清或小牛血清10mL，酵母浸液10mL,
10 %尿素溶液0.5mL-1.5mL, 0.4%酚红溶液0.5mL,青霉素(使其在培养基中的浓度为
500U/mL-2000U/mL,)用1N HCl 调pH值至5.5-6.5, 用小试管分装后置冰箱中备用，每管1.5-2.0mL。
(2 ) 固体培养基：在100mL 支原体肉汤培养基中，加入琼脂1.2-1.4g, ,高压灭菌后冷却到50 ℃左右，逐一加入上述添加剂。
摇匀，倒入无菌平皿中，待凝固后，置冰箱中备用。
接种标本后，经孵育，若培养基发生由黄变红的颜色变化，透明无混浊(有别于某些细菌及真菌生长)则可初步判断为有支原体生长。
大多数Uu在24h内可获得阳性结果。
如果培养基发生颜色变化，但液体又有混浊，则应排除杂菌污染, 可用0.45μm滤膜过滤后，作再接种观察。
进一步诊断需将液体培养物接种到固体培养基上培养, 经Dienes法染色后在低倍显微镜下观察集落形态。
阴性结果最好观察５天。
Uu 在固体培养基上集落核心呈粗颗粒状,具极窄的边，有时呈油煎蛋样。
如用Dienes 法染色，集落为特异的蓝色。
一般细菌的菌落不着色，容易鉴别。
(二)代谢抑制试验
根据特异性抗体能阻止支原体的生长和代谢这一特性，可用病人血清进行代谢抑制试验。
在加有抗血清的培养基中，支原体的代谢受到抑制，从而阻止了培养基的颜色改变。
代谢抑制试验也可用于检测感染支原体患者血清抗体的滴度。
即将血清作10倍连续稀释后，滴入支原体培养液，并以不加血清的支原体试验管和不加支原体液的培养基管作对照。
经37℃培养，不加抗血清的培养管支原体应生长良好，培养基变成红色(Uu或Mh)，未加支原体液培养基管颜色不变。
未发生颜色变化的最高血清稀释度为代谢抑制试验的抗体滴度。
(三) 间接血凝试验
在一定条件下，抗体和相应抗原相遇，可形成抗原抗体复合物。
这种复合物分子团很小,不能形成肉眼可见的反应。
用经鞣酸处理的红细胞作载体，将抗原吸附在其表面，使红细胞致敏，待与相应的血清抗体相遇时，可出现肉眼可见的凝集现象。
(四)生长抑制试验
特异性抗体能阻止支原体的生长和代谢。
用直径为6mm-8mm的圆形灭菌滤纸片，以未稀释抗血清浸透后放入无菌平皿内，于４℃下干燥后待用。
吸取待检菌液0.5mL涂布于固体培养基上，置３7℃使琼脂表面稍干燥。
以无菌操作镊取抗血清纸片放于琼脂表面,培养4日-5日后,在低倍显微镜下观察滤纸片周围有无支原体生长。
若滤纸片周围无菌落生长，出现抑菌圈大于2mm者表示该支原体与抗血清系同种免疫原，小于2mm判为异种。
(五)分子生物学诊断方法
目前主要应用聚合酶链反应(PCR)法及DNA探针技术作诊断。
前者具有高度特异性和敏感性、且快速、简便。
但操作要求极为严格。
聚合酶链反应的原理是DNA片段扩增，其中支原体引物的选择是PCR检测技术中的关键。
1９９1年Willonghby 设计的引物来自脲酶基因。
Zheng等（1995）用MB抗原基因引物对所有14个血清型的Uu均显示良好的PCR扩增效果，其敏感性较Willonghby设计的脲酶基因引物更好。