支原体检测PCR方法
猪肺炎支原体PCR检测方法的建立及初步临床应用
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鸡滑液囊支原体PCR检测方法的建立
鸡滑液囊支原体PCR检测方法的建立作者：陈文平李冬立康翠翠张妹程春格陈小娇由鹏王全武蔡晓庆来源：《家禽科学》2024年第06期摘要：目前鸡滑液囊支原体（MS）在养鸡生产中时有发生，是一种顽固性、条件性疾病。
在多种致病因素的作用易发，给养鸡生产造成了经济损失；为了快速诊断MS，特别是致病性鸡滑液囊支原体，本研究针对MS的VlhA基因设计特异性引物，通过优化反应条件，进行灵敏性试验、特异性试验和重复性试验，建立快速高效检测MS的PCR方法。
试验结果表明：该检测技术具有较好的灵敏性、特异性强且CV＜3%，具有很好的符合性。
关键词：鸡滑液囊支原体；PCR；检测中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2024）06-0027-05鸡的滑液囊支原体感染（Mycoplasama synoviae infection），又称滑液囊支原体病，是一种急性或慢性传染性疾病，可引起鸡和火鸡的传染性滑液囊炎、慢性呼吸系统疾病及鸡蛋尖端综合征[1]。
临床上主要表现为渗出性滑膜炎、腱鞘滑膜炎或粘液囊炎等，对鸡的生产性能造成了很大的影响。
近几年来，MS在各个地区都陆续出现，各个品种的鸡均有发病，特别是商品蛋鸡、商品肉鸡及一些地方品种鸡等，且各个日龄均可感染；大多数成年鸡呈隐形感染。
MS有垂直传播和水平传播2种传播方式，而呼吸道传播感染是该病的主要传播方式。
临床上主要表现为呼吸啰音、鸡冠苍白、食欲减退、生长缓慢；严重的可出现胸骨囊肿、脚垫及脚关节肿胀、跛行等。
临床剖检发现肝脏有尿酸盐沉积，脾脏、肾脏肿大等[2]。
剖检病鸡，主要病理变化为附关节、跗关节和脚垫肿胀，肿胀部位囤积大量黄色胶冻样粘液。
胸部发生囊肿，随着病程延长，胸骨关节被粘液或干酪样物质覆盖，爪垫内也存在脓性分泌物或干酪样渗出[3]。
病鸡的睫鞘滑膜层出现广泛、散在和局灶性的炎性浸润[4]。
部分鸡肝脾肿大、出现明显的纹路，肾脏肿大[5]。
支原体肺炎的检查方法有哪些？诊断准确吗？
支原体肺炎的检查方法有哪些？诊断准确吗？引言支原体肺炎是一种常见的呼吸道感染，由支原体引起。
它主要发生在儿童和年轻人身上，但成年人也可能受感染。
支原体肺炎的早期诊断非常重要，可以帮助医生迅速采取正确的治疗策略。
本文将介绍支原体肺炎的常见检查方法，以及这些方法的诊断准确性。
1. 病史采集与体格检查在对支原体肺炎进行检查之前，医生首先会收集患者的病史信息。
这包括发病时间、症状的持续时间、发热情况、咳嗽的性质以及其他任何相关症状。
接下来，医生会进行体格检查，包括听诊肺部、观察患者的咳嗽情况和全身状况等。
2. 血液检查血液检查是支原体肺炎的常见检查方法之一。
通过检查血液中的炎症指标如白细胞计数、C-反应蛋白（CRP）和血沉等，可以了解是否存在炎症反应。
然而，血液检查并不能直接确定是否存在支原体感染，因此需要配合其他检查方法使用。
3. 喉咳试验（Throat Swab）喉咳试验是用于检测喉部或鼻咽部的样本中是否存在支原体的方法。
医生会用棉签或拭子轻轻擦拭患者的喉咙或鼻咽部，然后送往实验室进行检测。
喉咳试验是一种简单、无创的检查方法，适用于儿童和成人。
4. 痰液检查痰液检查是支原体肺炎诊断的重要方法之一。
患者在清晨或咳嗽后采集新鲜痰液，送往实验室进行细菌培养和支原体检测。
这种检查方法对于确诊支原体肺炎非常准确，能够直接检测支原体的存在。
5. 呼吸道标本检查呼吸道标本检查是通过采集下呼吸道标本（如支气管肺泡灌洗液或支气管刷片）进行检测。
这种方法通常在痰液检查无法得出准确结果时使用。
呼吸道标本检查对于儿童和年轻患者来说相对困难，需要进行气道镜检查或支气管镜检查，但对于确诊支原体肺炎非常有效。
6. 呼吸道实时荧光PCR检测实时荧光PCR检测是一种新型的支原体肺炎检查方法，可以通过放大和检测呼吸道样本中的DNA，快速准确地检测支原体的存在。
该方法非常敏感，对于病例诊断具有很高的准确性。
诊断准确性和解读注意事项上述检查方法中，痰液检查和喉咳试验是诊断支原体肺炎最常用的方法。
欧洲药典中的支原体检测
欧洲药典中的支原体检测欧洲药典（European Pharmacopoeia，以下简称EP）是一个权威的药品质量标准参考文献。
其提供了规范化的药物检测方法，以确保药品的质量、安全和有效性。
支原体检测作为一项重要的检测项目之一，其在EP中有其详细的规范和指导。
支原体是一类细菌样微生物，它们是一种寄生生物，能够感染人类和动物，引发各种疾病。
在药品生产和质检过程中，支原体的检测是非常必要的，以确保药品的安全性和有效性。
欧洲药典中对支原体检测的方法进行了系统的规范，其中包括了样品准备、核酸提取、PCR扩增、测序等步骤。
首先，EP中对样品的准备做了规定。
样品可以来自于药品的原材料、中间体、成品药品等，需要进行充分的准备，以确保支原体的检测结果的准确性和可靠性。
样品的准备包括对样品的收集、保存、运输等步骤的规定。
在核酸提取方面，EP提供了详细的方法和技术要求。
核酸提取是支原体检测的关键步骤之一，其可通过多种方法进行，如酚/氯仿法、磁珠法、硅胶膜柱法等。
具体的核酸提取方法需要根据样品的特性和实际情况进行选择。
PCR扩增是支原体检测中最常用的方法。
EP中对PCR扩增方法进行了详细的规范，包括引物设计、反应体系的组成、PCR条件的设定等。
PCR扩增的结果可以通过凝胶电泳、荧光定量PCR等方法进行分析和鉴定。
测序是支原体检测中另一个重要的步骤。
根据EP的规范，测序可以通过传统的链终止法、高通量测序技术等进行。
测序结果需要进行生物信息学分析，以鉴定支原体的种属和亚种。
在支原体检测的过程中，EP强调了质量控制的重要性。
质量控制包括阳性和阴性对照的使用，以及质检实验室的合格评估等。
这些措施可以确保支原体检测的准确性和可靠性。
除了方法和技术指导，EP还提供了对于支原体检测结果的解释和判断的标准。
根据EP的规范，支原体检测结果应以阳性对照的出现为标准，同时，还需结合其他实验和临床信息进行判断和解释。
总之，欧洲药典中的支原体检测是一个完整、详细和规范的体系，可以指导药品生产和质检过程中的支原体检测工作。
三种方法检测肺炎支原体抗体的一致性分析
三种方法检测肺炎支原体抗体的一致性分析肺炎支原体是一种常见的致病菌，能引起多种疾病，包括肺炎、支气管炎和喉炎等。
肺炎支原体感染在临床上非常常见，但其诊断却具有一定的难度。
目前，常用的方法检测肺炎支原体感染包括血清学检测、PCR法和免疫荧光法。
但是这三种方法在检测肺炎支原体抗体时是否一致，需要进行一致性分析。
本文将从这三种方法的原理、优缺点以及一致性分析等方面进行探讨，以期为临床诊断肺炎支原体感染提供参考。
一、血清学检测法血清学检测法是通过检测血清中的肺炎支原体IgM和IgG抗体来确诊肺炎支原体感染的一种方法。
其原理是通过ELISA法或间接免疫荧光法检测血清中的特异性抗体水平，从而判断疾病的感染情况。
优点：血清学检测法简单易行，成本低廉，适用范围广，并且能够对早期和晚期感染进行诊断。
缺点：血清学检测法容易受到抗体交叉反应的影响，特别是对于已经接种过肺炎支原体疫苗的患者，结果容易出现假阳性。
由于肺炎支原体IgM和IgG抗体在感染初期同时产生，因此难以区分活动性感染和既往感染。
二、PCR法PCR法是通过检测标本中的肺炎支原体DNA或RNA来进行诊断的一种方法。
其原理是利用聚合酶链反应技术放大标本中的肺炎支原体基因片段，从而确定感染的情况。
优点：PCR法具有高灵敏度和特异性，能够准确检测肺炎支原体感染，并且对抗生素治疗前和治疗后的检测效果也非常理想。
缺点：PCR法需要专门的实验室设备和技术人员进行操作，成本较高，且易受到污染的影响，导致假阳性结果。
三、免疫荧光法优点：免疫荧光法具有高灵敏度和特异性，操作简便，结果可靠，并且对于急性感染和慢性感染均能够进行准确检测。
一致性分析为了进行肺炎支原体抗体检测方法的一致性分析，我们对三种方法进行了一系列实验和比较。
我们先分别用血清学检测法、PCR法和免疫荧光法对30份来自临床患者的标本进行检测，然后比较它们的结果一致性。
实验结果显示，三种方法在肺炎支原体抗体检测中的阳性率和阴性率并不完全一致。
支原体检测说明书
SaveIt系列产品——支原体检测试剂盒说明书一、产品简介支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。
支原体的侵染会引起细胞功能和基因表达的严重改变，并造成持续危害。
由于支原体污染会严重影响实验结果的可靠性、重复性和一致性，对支原体的常规检测非常重要。
针对细胞、培养基以及动物血清的支原体检测，我们推出了Myco-PCR-TEST快速支原体检测试剂盒。
本试剂盒基于PCR检测原理，根据支原体高度保守的16和23SrRNA区域设计的特异性引物，经过简单快速的PCR，从而迅速准确判断支原体污染是否被清除。
汉恒生物（）推出的SaveIt TM抗支原体试剂能够在不影响细胞状态的前提下能够有效的清除支原体污染，从而使一些珍贵的细胞受到支原体污染之后能够得到挽救。
二、产品包装产品规格见标签三、使用说明使用Trizol 法抽提待检测细胞的RNA，反转录为CDNA 后，加入支原体检测引物，进行PCR 检测细胞支原体污染情况。
四、操作步骤4.1样品处理1、A：培养贴壁细胞：不须胰酶消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml 比例加入。
B：悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
2、细胞加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
注：此时可放入-70℃长期保持。
3、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。
4、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
5、4℃ 12,000g离心15min。
6、吸取上层水相，至另一离心管中。
注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
7、按0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min 。
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍（2016年10月16日）哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。
支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有：一、培养法●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。
●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。
这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。
而猪鼻支原体约占所有细胞支原体污染的20-50%。
●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中收录的培养法支原体检测方法进行操作。
二、荧光染色法●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色，如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。
●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细胞而直接对目标细胞进行荧光染色，由于每种细胞繁殖和吸附支原体的能力差异极大，检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多；（3）该方法严重依赖实验人员的经验，可重复性较差。
解脲支原体(UU)核酸定量检测标准操作规程(PCR-荧光探针法)
解脲支原体（UU）核酸定量检测标准操作规程（PCR－荧光探针法）1.目的:规范解脲支原体（UU）核酸DNA（PCR－荧光探针法）检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围：解脲支原体（UU）荧光定量检测。
3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4.参考文献：4.1 中山大学达安基因股份有限公司解脲脲原体（UU）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书。
4.2 中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册。
5. 内容：5.1 检测方法：PCR-荧光探针法5.2 实验原理：用一对解脲脲原体特异性引物和一条解脲脲原体特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而检测解脲脲原体（UU）DNA。
主要用于（UU）感染的辅助诊断及其疗效监测的标准。
5.3 性能参数：5.3.1 精密度：检测下限为5.0Χ102 copies。
5.3.2 线性范围：5.0×102～5.0×108 copies。
5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集5.4.1 标本类型：泌尿生殖道分泌物等。
5.4.2 标本采集：5.4.2.1 泌尿生殖道分泌物：5.4.2.1.1 男性尿道分泌物：用细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌玻璃管中，密封送检（采集分泌物前2小时禁小便）。
5.4.2.1.2 女性生殖道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈内，停5s后旋动宫颈刷或棉拭子采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置于无菌玻璃管中，密封送检。
5.4.2.1.3 女性尿道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌玻璃管中，密封送检。
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PCR法检测支原体
实验原理：
通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增，
会将目标DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测，会跑出条带出现阳性
结果。反之当没有支原体污染时，由于没有模板，PCR无法扩增，则琼脂糖电泳跑
不出条带，出现阴性结果，为确保PCR法的精确性，故需要找到最优的PCR条件
在进行检测。
实验目的：
检测培养的细胞是否有支原体污染。
实验材料：
0.5 ml EP管；PCR管；镊子；手套；口罩；EP管架；移液枪（100 ul，10 ul）及配套
枪头(黄、白)；dd H2O；上下游引物（两组）；dNTPs；10 x Buffer；Easy Taq；冰
盒；琼脂糖；锥形瓶（200ml）；量筒（50ml）；全套琼脂糖电泳设备（电泳槽，
制胶槽，梳子，电源输出）；凝胶成像系统；
PCR引物：
LZY-5 Myco universal F：GGGGAATGGGTGAGTAACACG
LZY-5 Myco universal R：CGGATAACGCTTGCGACCTATG
产物大小：500bp
LZY-6 mycotest F ：GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCT
LZY-6 mycotest R ：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC
产物大小：250bp
实验步骤：
1、取样：
直接取培养细胞的培养基上清。
2、PCR（为25ul体系）
1、配制反应体系，根据检测样本数+1个阴性对照（水）+1个阳性对照，算出PCR
样本的个数，在此基础上增加几管的量，把除检测培养基外的其他组分按计算好的
量加到一起，混匀后分装，最后加入检测培养基。
25 ul 反应体系
5#引物：LZY-5 Myco universal
反应体系 反应条件
检测培养基 1 ul 94 ℃ 3 min
LZY-5 -F 0.5 ul 94 ℃ 30 s
LZY-5 -R 0.5 ul 55℃ 30 s
10xBuffer 2.5 ul 72 ℃ 30s
dNTP 0.5 ul 25 cycles或30 cycles
Easy Taq 0.5 ul 72 ℃ 10min
ddH2O 19.5 ul
6#引物：LZY-6 mycotest
反应体系 反应条件
培养基 1 ul 94 ℃ 3 min
LZY-5 -F 0.5 ul 94 ℃ 30 s
LZY-5 -R 0.5 ul 51℃ 30 s
10xBuffer 2.5 ul 72 ℃ 20s
dNTP 0.5 ul 35 cycles
Easy Taq 0.5 ul 72 ℃ 5min
ddH2O 19.5 ul
3.琼脂糖凝胶的制备
1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
上图为两对引物梯度PCR的结果，5#引物选择：55℃（55.9℃），6#引物引物选择：51℃