蛋白酶活性的测定方法及原理 PPT
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酶活力测定方法
供试液的a每分钟改变相当于的单位数为每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为0003重组人白细胞介素11的胰蛋白酶切肽图分析肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法目前常用的方法有cnbr裂解sdspage微量肽图法和胰蛋白酶切rphplc肽图1
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。
加热：使酶失效
酶反应
不同的时间取样
终止反应
测定
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法：
紫外-可见分光光度法 旋光法
荧光分光光度法
电化学测定法
酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰 蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切, 每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌ ｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析, 直至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳 酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切, 酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致, 即确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个 峰,12次重复进样3个峰保留时间的ＲＳＤ分别 为0. 4%,0 .6%和0. 8%,峰面积的ＲＳＤ分别为 0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品37℃ 酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进样5次, 结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,所产生 21个峰的保留时间、峰高和峰面积的ＲＳＤ均 分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系统误差 小,重复性好,可用于 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是 稳定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品 比较有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和 峰面积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一 个峰,说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ 公司生产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。
加热：使酶失效
酶反应
不同的时间取样
终止反应
测定
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法：
紫外-可见分光光度法 旋光法
荧光分光光度法
电化学测定法
酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰 蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切, 每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌ ｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析, 直至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳 酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切, 酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致, 即确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个 峰,12次重复进样3个峰保留时间的ＲＳＤ分别 为0. 4%,0 .6%和0. 8%,峰面积的ＲＳＤ分别为 0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品37℃ 酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进样5次, 结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,所产生 21个峰的保留时间、峰高和峰面积的ＲＳＤ均 分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系统误差 小,重复性好,可用于 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是 稳定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品 比较有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和 峰面积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一 个峰,说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ 公司生产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
蛋白酶的测定方法
蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定1、试剂配制①1%的酪素溶液：用 pH7.4 的 0.2M 磷酸盐缓冲溶液配制。
PH为7.4的0.2M磷酸盐缓冲溶液：0.2M 磷酸氢二钠（27.8g NaHPO4·2H2O溶于 1L 蒸馏水中）19ml 加 0.2M 磷酸二氢钾（53.65g KH2PO4溶于 1L 蒸馏水中）81ml 即成。
②0.1N 硫酸。
③20%硫酸钠。
④2%茚三酮液：2g 茚三酮溶于 100ml 丙酮。
⑤甲苯。
⑥甘氨酸标准溶液：取 0.1g 甘氨酸溶液水中，定容 1L，则得 1ml 含 0.02mg 氨基氮的标准液。
再稀释 10 倍做成标准液。
标准曲线的绘制：分别吸取工作液 1,3,5,7,9,13ml 移于50ml 容量瓶中，加 1ml 的茚三酮，冲洗瓶颈后在沸水浴上加热10min，将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。
在风光光度计上于 500nm 处比色测定颜色深度。
以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标，绘制曲线。
2、操作步骤称 4g 风干土，置于 50ml 三角瓶中，加 20ml1%酪素溶液和 1ml 甲苯，小心振荡后用木塞盖紧，在30℃恒温箱中培养 24h。
培养结束后，于混合物中加 2ml0.1N 硫酸和 12ml 20% 硫酸钠液，以沉淀蛋白质，然后离心 15min(6000 转/min)。
取上清液2ml，置于 50ml 容量瓶中，按绘制标准曲线显色的方法进行比色测定。
为了消除土壤中原来含有的氨基氮引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。
无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
蛋白酶活性，以 24 小时后1g 土壤中氨基氮的毫克数表示。
3、结果计算NH2-N(mg)=a×5式中 a——从标准曲线查的氨基氮毫克数5——换算成 1g 土的系数。
蛋白酶活力测定方法-大肠杆菌生长曲线的测定
实验材料
• 1.实验器材 电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管； 721分光光度计
• 2.实验试剂 (1) 缓冲液：pH 7.5-8.0的 50 mM Tris-Cl缓冲液。 (2) 2%酪蛋白溶液 (3) 三氯醋酸溶液（ TCA ）：10％ TCA (4) 酪氨酸标准溶液：1000μg/mL；100μg/mL (5) 碱性蛋白酶溶液：发酵液上清夜
➢将被测溶液推入光路，显示器显示为被测样 品的吸光值。
在600 nm波长下，用未接种的LB液体培养 基作空白对照，分别对培养了0、4、8、12、 16和20 h的大肠杆菌培养液，进行光电比浊 测定。对于高浓度的大肠杆菌培养液,要用未 接种的LB培养基进行稀释，使其吸光值不超 过1。
比色皿经蒸馏水清洗后，必须经待测样品润 洗。比色皿的毛面用吸水纸擦干，而光面只 能用吸水纸吸干，以免光面被划破。
➢取出档光体，按100%T/OA键调100%透射 比。
2.样品测定
➢将参比溶液以及被测溶液倒入比色皿中。
➢打开样品室盖，将参比溶液放在样品架的第 一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。
➢将参比溶液推入光路，按100%T/OA键调满 度。
➢按 MODE ， 将 测 试 方 式 调 至 吸 光 度 方 式 （A）。此时,显示器显示“0.000”。
• 福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定， 容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的 混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
• 利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白 酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表 示酶活力。
2. 紫外分光光度计法
• 蛋白质、酪氨酸等氨基酸在200～320nm范围内 有光吸收，最大吸收波长在280nm处，故选此波 长作为测定波长。
蛋白酶液化淀粉酶活力的测定
（六）抑制剂对酶作用的影响
——使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学 性质改变而降低酶活力甚至使酶丧失活性的物质， 称为抑制剂（ inhibitor, I）。 由抑制剂所引起的酶活力降低或丧失称为抑 制作用（inhibition）。 凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用 称为失活作用（inactivation）。
（1）酶法 酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光 光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如 葡萄糖氧化酶催化的下列反应： 葡萄糖+O2→葡萄糖内脂+H2O2 欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧 化物酶和木酚，使发生下列反应:
由于4—甲氧联酚在435nm波长处有光吸收峰，因此、只 要测定A435，就可知4—甲氧联酚的量，可得H202的量，从而 可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶(过氧化物酶)必须过 量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在5 倍以上。
一些酶的最适 pH 值
酶 胃蛋白酶 过氧化氢酶 最适 pH 1.8 7.6
胰蛋白酶
延胡索酸酶
7.7
7.8
核糖核酸酶
精氨酸酶
7.8
9.8
酶的最适pH只在 一定条件下才有 意义－－ 酶的最适pH 不是固定的常数, 其数值受酶的纯 度、底物种类和 浓度、缓冲液种 类和浓度等影响
pH影响酶活力的原因：
1. 环境过酸、过碱可使酶的空间结构破坏， 引起酶构象的改变，酶变性失活； 2. pH改变能影响酶分子活性部位上有关基团 的解离，从而影响与底物的结合或催化；
偶联法中偶联酶对反应速度的影响
再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）： 葡萄糖＋ATP→葡萄糖-6-P 其偶联-指示剂 为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 葡萄糖-6-P+NADP+ →6-P-葡萄糖酸+NADPH+H+ 这时即可测定340nm处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄 糖激酶）的活性. 酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行。 （2）化学法 化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理 方法测出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度 法等方法测出酶活性.
蛋白酶活性的测定方法
结果分析
酶活性计算
根据实验数据，计算蛋白酶的活性，包括比活力和米氏常数等参 数。
显著性检验
通过t检验、方差分析等方法，对实验组和对照组之间的差异进行 显著性检验，确定实验结果是否具有统计学意义。
可重复性评估
评估实验结果的重复性，判断实验方法的可靠性和稳定性。
误差分析
误差来源
分析实验过程中可能存在的误差来源，如试剂不纯、 操作误差、仪器误差等。
电化学法
总结词
电化学法是一种快速、简便的蛋白酶活性测定方法，通过电化学信号的变化来检 测酶的活性。
详细描述
电化学法利用电化学探针或电极检测酶反应过程中产生的电化学信号，如电流、 电位等，通过分析这些信号的变化可以计算酶的活性。该方法具有快速、简便和 实时监测等优点。
核磁共振法
总结词
核磁共振法是一种高分辨率、高灵敏度的蛋白酶活性测定方法，通过检测核自旋磁矩的变化来计算酶的活性。
酶液的保存
选择适当的保存条件，如温度、pH值和添加稳定 剂等，以确保酶液的活性。
反应条件优化
温度对酶活性的影响
通过在不同温度下测定酶活性，找到最适温度范围，确保酶活性 的最大化。
pH对酶活性的影响
在不同pH条件下测定酶活性，找到最适pH值，确保酶活性的最大 化。
底物浓度对酶活性的影响
通过改变底物浓度，观察酶活性的变化，找到最佳底物浓度。
在测定过程中，可能存 在异常值、缺失值或重 复数据，需要进行数据 清洗，确保数据准确性 和可靠性。
图表绘制
通过绘制图表，如柱状 图、折线图或散点图， 可以直观地展示蛋白酶 活性随时间、温度、pH 等参数的变化趋势。
数据转换
根据需要，对数据进行 适当的数学转换，如对 数转换或归一化处理， 以便更好地分析数据。
胰蛋白酶的活力的测定完美版PPT
法：
1、专一性研究 通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断 和确定活性中心的结构特点。
2、酶侧链基团的化学修饰法 酶分子中可以被化学修饰的基团 很多，如巯基、羟基、咪唑基、氨基及羧基 等。
四、酶的命名与分类
习惯命名法
按催化反应类型分类 脱氢酶、脱羧酶、连接酶、聚合酶等。 按组织来源及性质分类 胃蛋白酶/胰蛋白酶，酸性/碱性磷酸 酶等。
酶活力与酶反应速度 初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准
产物量
18
16
14
12
10 8
系列1
6
4
2
时间
0
0
5
10 15 20
时间
以N-苯甲酰-L—精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法进 行测定的原理是：N－苯甲酰－L—精氨酸乙酯英文缩 写为BAEE）在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲 酰L—精氨酸（英文缩写为BA）。在胰蛋白酶的催化 下，随着酯键的水解，苯甲酰L—精氨酸逐渐增多，反 应体系的紫外吸收宜随之相应增加。
五、酶的活力测定
酶活力（enzyme activity），是指酶催化一定化学反 应的能力。
酶活力单位（国际单位） 标准状态下，每分钟使一微克 分子作用物发生转变的酶量。人们普遍 采用是习惯用法，如 a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表 示。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底物反应液pH8.0， 25℃，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定A253，每分 钟使A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。
的紫外吸收远远构弱于区苯域甲酰，L—与精氨催酸化（英作文缩用写直为B接A）相。 关。
样品胰蛋白酶BAEE活性单位＝
1、专一性研究 通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断 和确定活性中心的结构特点。
2、酶侧链基团的化学修饰法 酶分子中可以被化学修饰的基团 很多，如巯基、羟基、咪唑基、氨基及羧基 等。
四、酶的命名与分类
习惯命名法
按催化反应类型分类 脱氢酶、脱羧酶、连接酶、聚合酶等。 按组织来源及性质分类 胃蛋白酶/胰蛋白酶，酸性/碱性磷酸 酶等。
酶活力与酶反应速度 初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准
产物量
18
16
14
12
10 8
系列1
6
4
2
时间
0
0
5
10 15 20
时间
以N-苯甲酰-L—精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法进 行测定的原理是：N－苯甲酰－L—精氨酸乙酯英文缩 写为BAEE）在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲 酰L—精氨酸（英文缩写为BA）。在胰蛋白酶的催化 下，随着酯键的水解，苯甲酰L—精氨酸逐渐增多，反 应体系的紫外吸收宜随之相应增加。
五、酶的活力测定
酶活力（enzyme activity），是指酶催化一定化学反 应的能力。
酶活力单位（国际单位） 标准状态下，每分钟使一微克 分子作用物发生转变的酶量。人们普遍 采用是习惯用法，如 a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表 示。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底物反应液pH8.0， 25℃，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定A253，每分 钟使A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。
的紫外吸收远远构弱于区苯域甲酰，L—与精氨催酸化（英作文缩用写直为B接A）相。 关。
样品胰蛋白酶BAEE活性单位＝
蛋白酶活力测定
3
在实际应用中，蛋白酶活力测定具有广泛的应用 价值，如食品工业中蛋白质水解、洗涤剂生产中 的酶催化反应等。
研究展望
随着生物技术的不断发展，蛋白酶活力测定技术也在不断改进和完善。未来，可以通过开发 新型的蛋白酶活力测定方法，提高测定灵敏度和特异性，进一步拓展其应用范围。
在研究蛋白酶的底物特异性、抑制剂作用机制等方面，可以结合计算机模拟技术、光谱学技 术等手段，深入探究酶的催化机制和作用机理。
随着蛋白质组学和代谢组学研究的深入，蛋白酶活力测定在生物标志物发现、疾病诊断和治 疗等方面的应用将更加广泛。同时，随着人类对生物大分子结构和功能的认识不断深入，蛋 白酶活力测定在药物设计和发现等领域也将发挥更加重要的作用。
THANKS
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数据记录与处理
06 详细记录实验数据，并进行必
要的计算和处理，以得出实验 结论。
实验操作技巧
温度控制
确保酶反应在恒温条件下进行，以减 少温度对酶活力的影响。
02
pH调节
使用适当的缓冲液调节反应液的pH值， 以保证酶活力的稳定。
01
03
避免污染
在整个实验过程中，要严格控制实验 环境，避免样品和试剂受到污染。
对照实验
进行对照实验时，要确保对照组与实 验组条件一致，以消除误差对实验结 果的影响。
05
04
精确测量
在实验过程中，要使用精确的测量工 具和方法，确保实验数据的准确性。
05
结果分析与解读
结果分析
酶活力单位
通过实验数据，计算出蛋白酶的酶活力单位， 以评估酶的催化活性。
酶促反应速率
分析酶促反应速率，了解酶促反应的进程和 快慢。
底物浓度与酶活力的关系
蛋白酶活性的测定方法及原理_图文
L-酪氨酸标准溶液按下表配制
试管0
100μg/mml ）
10
酪氨酸实际
浓度
O
（μg/ml ）
试管1 1 9 10
试管2 2 8 20
试管3 3 7 30
试管4 4 6 40
试管5 5 5 50
分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使 用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不 含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为 横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常 数K值，其K值应在95~100范围内。
蛋白酶活性的测定方法及原理_图文.pptx
考马斯亮蓝法 甲醛滴定法
DHT-酪蛋白法 DNA-溴乙锭荧光分析法
X-光胶片法 福林酚法
考甲马醛斯滴亮定蓝法法
考甲马醛斯滴亮定蓝法法
D考H马T-斯酪亮蛋蓝白法法
DNA-考溴马乙斯锭亮荧蓝光法分析法
考X马-光斯胶亮片蓝法法
考福马林斯酚亮法蓝法
重 本次实验就是采用福林酚 点 法测定蛋白酶活性
原理
福林酚法测定蛋白酶活性
仪器
• 分析天平：精度0.0001g • 恒温水浴：精度±0.2℃ • 计时表 • 分光光度计 • 沸水浴器 • 振荡混合器 • pH计: 精度0.01pH单位
试剂
• 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶 • 磷酸缓冲液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶 • 硼酸缓冲液 (pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶 • 0.4mol/L碳酸钠溶液 • 0.4mol/L的三氯醋酸液 • 0.5mol/L的NaOH • 10.00mg/ml酪素溶液 • 100μg/ml酪氨酸标准溶液
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蛋白酶活性的测定方法及原理
各种测定方法及原理
考马斯亮蓝法 甲醛滴定法
DHT-酪蛋白法 DNA-溴乙锭荧光分析法
X-光胶片法 福林酚法
考甲马醛斯滴亮定蓝法法
• 考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合， 主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是 精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料 的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶 液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测 定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
考甲马醛斯滴亮定蓝法法
• 蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固 定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定 生成的氨基酸，从而测定其酶活。
D考H马T-斯酪亮蛋蓝白法法
• 用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和 酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪 蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白为底物， 在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离 子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性 红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋 白，但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离 子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法 可测定蛋白酶酶活。
考马福斯林亮酚蓝法法
• 福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还 原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中 有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使 蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理 测定蛋白酶酶活。
重 本次实验就是采用福林酚 点 法测定蛋原理 • 蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。 磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不 稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合 物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋 白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接 测定蛋白酶的活力。
仪器
• 分析天平：精度0.0001g • 恒温水浴：精度±0.2℃ • 计时表 • 分光光度计 • 沸水浴器 • 振荡混合器 • pH计: 精度0.01pH单位
试剂
• 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶 • 磷酸缓冲液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶 • 硼酸缓冲液 (pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶 • 0.4mol/L碳酸钠溶液 • 0.4mol/L的三氯醋酸液 • 0.5mol/L的NaOH • 10.00mg/ml酪素溶液 • 100μg/ml酪氨酸标准溶液
标准曲线的绘制
L-酪氨酸标准溶液按下表配制
分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使 用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不 含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为 横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常 数K值，其K值应在95~100范围内。
考X马-光斯胶亮片蓝法法
• 酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液 滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上的明胶 水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被 酶水解的地方，出现透明的圆圈。酶活性的高 低与透明圆圈的面积成正比。测定圆圈的面积 以测定蛋白酶的活性。。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
影响酶活力的因素有哪些？ ①酶浓度对酶活力的影响：酶促反应速率与酶分子的浓度呈正比，在一定范围内，当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。 ②底物浓度对酶活力的影响：若酶的浓度为定值，底物的起始浓度越低时，酶促反应速度与底物浓度呈正比，即随底物浓度的增加而增加。当
③温所度有对的酶酶活与力底的物影结响合：生在成适中宜间的产温物度后范，围即内使，再酶增促加反底应物速浓度度随，温中度间T升产it高物le而浓增度加也，不超会过增最加适，反酶应促温反度应，速酶度活也力不将会会增下加降。。
计算 蛋白酶的活力= A×K×T4/it1l0e×n U/g(ml)
A：样品平行试验的平均OD值 K：吸光常数 4：反应试剂的总体积 1 0：酶解反应时间 n：酶液稀释总倍数
思考题
蛋白酶有哪几类？ ①按蛋白酶水解蛋白质的方式：A内肽酶：切开蛋白质分子内部肽键，生成相对分子质量较小的多肽类；B外肽酶：切开蛋白质或多肽分子氨 基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸的酶类；C水解蛋白质或多肽的酯键；D水解蛋白质或多肽的酰胺键。 ②按酶的来源可分为：动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶 ③微生物蛋白酶又可分为：细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶 ④按蛋白酶作用的最适PH可以分为（A）PH2.5~5.0的酸性蛋白酶，（B）PH9.5~10.5的碱性蛋白酶，（C）PH7~8的中性蛋白酶
DNA-考溴马乙斯锭亮荧蓝光法分析法
• 溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使 DNA的荧光增加25倍。接近饱和的溴乙锭 (0.5µg/mL) 与DNA 混合时，其荧光增加量与 DNA的浓度呈正比。在DNA-组蛋白-溴乙锭溶 液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链 上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴 乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白 酶活性呈正比。通过测定DNA溶液的荧光增量 来计算蛋白酶的活性。
实验步骤
①
先将酪素溶液 放入 40±0.2℃恒 温水浴中，预 热5min
②
取4支试管， 各加入1ml酶 液
③
取一支作为空 白管，加2ml 三氯乙酸，其 他3管作为测 试管各加入 1ml酪素，摇 匀，40℃保温 10min
④
取出试管，3 支测试管中各 加入2ml三氯 乙酸，空白管 中加1ml酪素 。
⑤
静置10min， 过滤沉淀
⑥
各取1ml滤液， 加入0.4mol/L 的碳酸钠5ml、 福林试剂1ml。 在40℃显色 20min 680nm 处测OD值。以 空白管调零点 。
蛋白酶活性的计算
1g固体酶粉（或1ml液体酶），在40℃（酸性pH=3.0、
定义 中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，1min水解酪素产 生1μg酪氨酸为一个K酶：活吸力光单常位数。
各种测定方法及原理
考马斯亮蓝法 甲醛滴定法
DHT-酪蛋白法 DNA-溴乙锭荧光分析法
X-光胶片法 福林酚法
考甲马醛斯滴亮定蓝法法
• 考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合， 主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是 精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料 的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶 液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测 定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
考甲马醛斯滴亮定蓝法法
• 蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固 定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定 生成的氨基酸，从而测定其酶活。
D考H马T-斯酪亮蛋蓝白法法
• 用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和 酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪 蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白为底物， 在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离 子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性 红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋 白，但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离 子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法 可测定蛋白酶酶活。
考马福斯林亮酚蓝法法
• 福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还 原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中 有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使 蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理 测定蛋白酶酶活。
重 本次实验就是采用福林酚 点 法测定蛋原理 • 蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。 磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不 稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合 物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋 白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接 测定蛋白酶的活力。
仪器
• 分析天平：精度0.0001g • 恒温水浴：精度±0.2℃ • 计时表 • 分光光度计 • 沸水浴器 • 振荡混合器 • pH计: 精度0.01pH单位
试剂
• 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶 • 磷酸缓冲液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶 • 硼酸缓冲液 (pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶 • 0.4mol/L碳酸钠溶液 • 0.4mol/L的三氯醋酸液 • 0.5mol/L的NaOH • 10.00mg/ml酪素溶液 • 100μg/ml酪氨酸标准溶液
标准曲线的绘制
L-酪氨酸标准溶液按下表配制
分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使 用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不 含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为 横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常 数K值，其K值应在95~100范围内。
考X马-光斯胶亮片蓝法法
• 酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液 滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上的明胶 水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被 酶水解的地方，出现透明的圆圈。酶活性的高 低与透明圆圈的面积成正比。测定圆圈的面积 以测定蛋白酶的活性。。
大家应该也有点累了，稍作休息
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影响酶活力的因素有哪些？ ①酶浓度对酶活力的影响：酶促反应速率与酶分子的浓度呈正比，在一定范围内，当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。 ②底物浓度对酶活力的影响：若酶的浓度为定值，底物的起始浓度越低时，酶促反应速度与底物浓度呈正比，即随底物浓度的增加而增加。当
③温所度有对的酶酶活与力底的物影结响合：生在成适中宜间的产温物度后范，围即内使，再酶增促加反底应物速浓度度随，温中度间T升产it高物le而浓增度加也，不超会过增最加适，反酶应促温反度应，速酶度活也力不将会会增下加降。。
计算 蛋白酶的活力= A×K×T4/it1l0e×n U/g(ml)
A：样品平行试验的平均OD值 K：吸光常数 4：反应试剂的总体积 1 0：酶解反应时间 n：酶液稀释总倍数
思考题
蛋白酶有哪几类？ ①按蛋白酶水解蛋白质的方式：A内肽酶：切开蛋白质分子内部肽键，生成相对分子质量较小的多肽类；B外肽酶：切开蛋白质或多肽分子氨 基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸的酶类；C水解蛋白质或多肽的酯键；D水解蛋白质或多肽的酰胺键。 ②按酶的来源可分为：动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶 ③微生物蛋白酶又可分为：细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶 ④按蛋白酶作用的最适PH可以分为（A）PH2.5~5.0的酸性蛋白酶，（B）PH9.5~10.5的碱性蛋白酶，（C）PH7~8的中性蛋白酶
DNA-考溴马乙斯锭亮荧蓝光法分析法
• 溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使 DNA的荧光增加25倍。接近饱和的溴乙锭 (0.5µg/mL) 与DNA 混合时，其荧光增加量与 DNA的浓度呈正比。在DNA-组蛋白-溴乙锭溶 液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链 上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴 乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白 酶活性呈正比。通过测定DNA溶液的荧光增量 来计算蛋白酶的活性。
实验步骤
①
先将酪素溶液 放入 40±0.2℃恒 温水浴中，预 热5min
②
取4支试管， 各加入1ml酶 液
③
取一支作为空 白管，加2ml 三氯乙酸，其 他3管作为测 试管各加入 1ml酪素，摇 匀，40℃保温 10min
④
取出试管，3 支测试管中各 加入2ml三氯 乙酸，空白管 中加1ml酪素 。
⑤
静置10min， 过滤沉淀
⑥
各取1ml滤液， 加入0.4mol/L 的碳酸钠5ml、 福林试剂1ml。 在40℃显色 20min 680nm 处测OD值。以 空白管调零点 。
蛋白酶活性的计算
1g固体酶粉（或1ml液体酶），在40℃（酸性pH=3.0、
定义 中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，1min水解酪素产 生1μg酪氨酸为一个K酶：活吸力光单常位数。