改良组织块法培养细针活检滑膜组织成纤维样滑膜细胞
改良组织块法培养细针活检滑膜组织成
纤维样滑膜细胞
(作者：__________ 单位：___________ 邮编：___________ )
作者：李婷戴冽杨斌郑东辉朱浪静莫颖倩张白玉【摘要】【目的】探讨体外分离培养细针活检滑膜组织成纤维样
滑膜细胞(FLS)的方法。【方法】滑膜组织来自接受盲式细针滑膜活检术的活动期类风湿关节炎患者，分别采用消化酶培养法、组织块培养法和改良组织块培养法分离培养FLS。采用台盼蓝染色进行细胞计数及活性鉴定，并应用倒置相差显微镜、透射电镜、免疫细胞化学染色、流式细胞术对第3?4代FLS进行鉴定。【结果】3种原代分离培养的方法均可成功培养出FLS。台盼蓝染色示FLS细胞计数约(8.30 士 1.65) X 105/瓶，活细胞百分率95%。传代可使FLS达到形态学上的纯化要求，倒置相差显微镜、透射电镜观察均符合FLS 的形态结构特征，免疫细胞化学染色示Vimentin阳性、CD68阴性、CK 阳性，流式细胞术检测示CD55+细胞占(95.34 士 2.47)%。改良组织块法培养FLS成功率较高，细胞游出时间较早，所需传代时间较短。【结论】改良组织块法特别适合于细针滑膜活检标本FLS的
培养，第3?4代细胞的数目、活性及纯度符合进一步实验的要求。
【关键词】成纤维样滑膜细胞；细胞培养；细针活检
Abstract : 【Objective ] To explore the culture method for fibroblast-like synoviocytes (FLS) from needle biopsied synovium tissue. 【Methods ] Synovium tissue obtained from patients with active rheumatoid arthritis by blind needle synovium biopsy were cultured with three different methods (digestive enzyme culture , tissue culture and modified tissue culture). Cell count and the perce ntage of viable cells were observed by trypa n blue sta ining. FLS were ide ntified by morphology , immuno cytochemical stai ning and flow cytometry. 【Results ] All three methods could culture FLS successfully , of which modified tissue culture method was better than the other two methods. FLS cell count was (8.30 士1.65) x 105 per flask with more than 95% viable cells by Trypan blue staining. FLS of the third or forth generation showed typical morphological characters un der inv erted phase
con trast
microscope and tran smissi on electro n microscope with Vimentin+/CD68-/CK+ staining and (95.34 士2.47)% CD55+ cells. Modified tissue culture method has higher successful rate with earlier and more quickly cell emigration from synovium tissue.
【Conclusion ] Modified tissue culture method is especially suitable for FLS culture in vitro from needle biopsied synovium tissue. The cell count , the percentage of viable cells , and purity of FLS of the third or forth generation meet the requirement for molecular biology experime nts.
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis , RA)是以关节滑膜炎症为特
征的慢性自身免疫性疾病，滑膜细胞增生并向周围组织侵袭形成血管翳在RA的发病、慢性炎症的维持及骨与软骨的破坏中起重要作用。成纤
维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte ，FLS)是滑膜组织最活跃的组成细胞，可通过自分泌或旁分泌方式产生大量的炎性细胞因子及免疫反应介质，是参与RA发病的重要细胞［1］。FLS体外培养模型的建立对于研究FLS的功能、进一步探讨RA的发病机制及体外筛选治疗RA的药物具有重要意义［2］。目前用于FLS体外培养的滑膜多来自关节开
放性手术、关节镜手术、从滑液中分离及细针滑膜活检等方法，其中细针滑膜活检局麻下操作，技术简单，并且获取的滑膜组织常较少混有其它成分，有利于原代细胞培养的纯化和操作。然而，细针活检获取的滑膜组织体积较小，标本总量较开放手术少，若采用
经典的消化酶培养法或组织块培养法进行原代培养，成功率偏低，细
胞生长速度缓慢。为此，本实验探讨细针活检滑膜组织FLS体外培
养的最佳方法，为有效进行下一步实验做准备。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 滑膜组织
来自接受盲式细针滑膜活检术［3］的确诊活动期RA患者，RA 诊
断符合1987 年美国风湿病协会（America n College of
Rheumatology，ACR）修订的诊断标准。
1.1.2 主要试剂
DMEM/F12 培养基、胎牛血清（fetal bovine serum , FBS）、2.5 g/L胰酶-0.2 g/L EDTA（美国GIBCO公司）;I型胶原酶、PBS缓冲液、台盼蓝（广州威佳生物有限公司）;鼠抗人Vimentin单克隆抗体、鼠抗
人CD68单克隆抗体、生物素化羊抗鼠IgG、DAB反应显色试剂盒（武汉博士德公司）、鼠抗人CK单克隆抗体（北京中杉）、鼠抗人CD55单克隆抗体（BD Pharmingen 公司）。
1.2方法
1.2.1消化酶培养法
①将活检的滑膜组织剪碎，加入I型胶原酶（1 mg/mL）并充分混匀，置37 C、体积分数5%CO2细胞培养箱中消化4?6 h;②用100目细胞滤网过滤、离心，弃上清，加入含200 mL/L FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，移入细胞培养瓶中培养；③每2?4 d 更换一次含100 mL/L FBS 的DMEM/F12培养液。
1.2.2 组织块培养法
①将活检的滑膜组织剪成1 mm3大小，以5 mm间距均匀排列在
培养瓶的培养面，加入含200 mL/L FBS 的DMEM/F12培养液，使培养面斜向上置细胞培养箱；②孵育4 h待组织块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养;③每2?4 d更换一次含100 mL/L FBS 的DMEM/F12培养液。待组织块周围FLS成片生长后，去除组织块
继续培养。
123 改良组织块培养法
①将活检的滑膜组织剪成1 mm3大小，加入I型胶原酶并充分混匀，置细胞培养箱中消化4?6 h;②细胞滤网过滤、离心，弃上清，加入含200 mL/L FBS 的DMEM/F12培养液重悬细胞，移入细胞培养瓶中培养：③收集细胞滤网上的组织碎屑，以 5 mm间距均匀排列在另一培养瓶的培养面，加入含200 mL/L FBS的DMEM/F12 培养液4 mL及I型胶原酶1 mL，使培养面斜向上置细胞培养箱：④ 孵育4 h待组织块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养;⑤24 h 后更换含100 mL/L FBS 的DMEM/F12培养液，以后每2?4 d更换一次培养液，待FLS成片生长后，去除组织块继续培养。
1.2.4 FLS的传代培养
待细胞长至融合度约70%?80%时进行细胞传代，2.5 g/L 胰酶-0.2 g/L EDTA消化，待细胞突起逐渐收缩、细胞变圆、细胞间距增大时终止消化，离心后按 1 : 3进行传代培养。
1.2.5台盼蓝染色FLS计数及活性鉴定
将第3?4代FLS消化离心重悬后，取等体积细胞悬液和 5 g/L的台盼蓝染液混匀，静置染色3?4 min后计数。死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染。根据以下公式进行细胞计数：细胞总数/毫升二（4大格细胞总数/4）X 104 X稀释倍数。活细胞百分率（细胞活性）二（4大格活细胞总数/4大格细胞总数）X 100%。
1.2.6倒置相差显微镜
观察细胞原代及传代后的形态及生长状况。
127透射电镜
第3?4代细胞细胞消化离心后，25 g/L戊二醛、20 g/L多聚甲醛混合液前固定，10 g/L锇酸后固定，乙醇、丙酮梯度脱水，Epon包埋剂包埋，超薄切片，乙酸双氧铀和枸橼酸铅染，Philips CM10透射电镜观察。
1.2.8 Vimentin、CD68、CK免疫细胞化学染色
将第3?4代细胞爬片用40 g/L多聚甲醛液固定，加一抗（鼠抗人Vimentin单克隆抗体、鼠抗人CD68单克隆抗体、鼠抗人CK 单克隆抗体，1 : 100稀释）、加生物素化羊抗小鼠IgG，DAB显色，苏木素轻度复染，乙醇梯度脱水，中性树胶封片。PBS作为阴性对照。
1.2.9流式细胞术检测CD55+细胞百分率
第3?4代细胞经消化重悬制成1 x 105/mL的单细胞悬液，加入
鼠抗人CD55单克隆抗体进行免疫荧光染色，流式细胞术检测细胞表面CD55表达并计算其阳性率。
2结果
2.1三种体外培养FLS方法的比较
共行24例次细胞培养，其中消化酶培养法10次，成功6次; 组织块培养法5次，成功4次;改良组织块法9次，成功9次。采用消化酶培养法，FLS约24 h贴壁，初期生长较慢，约2周长满瓶底20%?30%，之后生长较快，约4周长满瓶底的70%?80%（图
1）。采用组织块培养法，2?3 d可见长梭型FLS从组织块边缘游走生长，并逐渐增多呈放射状，两周后细胞迅速生长，约3?4周
长满瓶底的70%?80%（图2）。采用改良组织块培养法，分为2瓶原代细胞，1瓶为胶原酶所消化下来的细胞，其生长速度与消化酶法相近;另1瓶为组织块，1?2 d后见长梭型FLS从组织块边缘游走生长，并逐渐增多呈放射状，1周后细胞迅速生长，约2?3周长满瓶底的70%?80%（图3）。
2.2 FLS计数及活性鉴定
3种方法培养出的FLS长满25 cm2培养瓶时细胞总数为（8.30 士
1.65）X 105/瓶，活细胞百分率95%。
2.3 FLS的鉴定
倒置相差显微镜下观察可见FLS呈三角形、梭形，细胞核成卵圆
老化皮肤成纤维细胞的分析研究进展
老化皮肤成纤维细胞的研究进展 丛敬1，2，指导：吴景东1 <1 辽宁中医药大学，沈阳110032；2 沈阳医学院，沈阳110034 ） 【摘要】延缓皮肤老化，永葆青春是人类从未放弃的梦想。成纤维细胞作为真皮中主要细胞成分，已广泛应用于皮肤老化模型的建立和研究中。较系统的介绍了成纤维细胞的组织学结构与功能，其在细胞和分子水平影响皮肤老化的机制，对深入研究皮肤老化的机制、预防和治疗具有重要意义。 【关键词】成纤维细胞；皮肤老化；机制；中药研究 成纤维细胞是皮肤真皮中最主要的细胞成分，在合成分泌纤维和细胞外基质中扮演着重要的角色，在组织创伤修复中发挥着重要的作用。随着年龄的增长，皮肤老化突显，可以表现为皮肤干燥粗糙，皱纹增多、加深，皮肤松弛，弹性下降等。这些临床表现都与成纤维细胞数量减少，合成功能下降或异常有关。因此，在皮肤老化的研究中，人们越来越关注成纤维细胞的结构和功能的改变及其对皮肤老化产生的影响。 1 成纤维细胞的组织学结构与功能 光镜下观察[1]，成纤维细胞胞体较大，常呈多突起的扁平星状。细胞核较大，扁卵圆形，着色浅，核仁明显。细胞质较丰富，呈弱嗜碱性。胞质内有较多的核糖核酸，碱性磷酸酶的活性很强。电镜下，细胞表面有一些微绒毛和粗短的突起，胞质内富于粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。 成纤维细胞的超微结构表明，细胞合成蛋白质功能旺盛。成纤维细胞既合成和分泌胶原蛋白，弹性蛋白，生成胶原纤维、网状纤维和弹性纤维，也合成和分泌糖胺多糖和糖蛋白等基质成分[1]。在婴儿和青年人皮肤中，Ⅰ型胶原蛋白的含量约占70％，Ⅲ型胶原蛋白占30％。在衰老过程中，成纤维细胞合成Ⅲ型胶原蛋白增加，Ⅰ型胶原蛋白减少。成纤维细胞受损，还可以产生大量异常弹性蛋白，导致皮肤弹性下降，皱纹增多，且难以平复。 2 成纤维细胞致皮肤老化的作用机理 皮肤老化包括自然老化和外源性老化两种形式，其发生、发展的机制十分复杂。成纤维细胞在致皮肤老化的过程中发挥着十分重要的作用。 2.1基因调控异常 紫外线照射可导致成纤维细胞急性DNA 光损伤和突变，形成环丁烷嘧啶二聚体和6- 4 嘧啶- 嘧啶酮光产物，光老化的成纤维细胞对其修复能力下降，表达参与细胞核外切修复的蛋白及其mRNA水平亦下降[2-3]。而光老化成纤维细胞DNA修复能力的下降是由于修复合成相关因子表达下降导致核苷酸切除修复后期功能障碍造成的[4]。 人类线粒体DNA ·基础研究· 以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞* 杨俊林 刘雄昊喻姣玲冯劢谭杨李卓吴 奔 高 庭 潘 盛 邬玲仟梁德生夏家辉 （中南大学医学遗传学国家重点实验室湖南长沙410078） 摘要目的：比较人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs ）与小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs ）未分化生长的能力。方法：利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs ，通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs 与MEFs 的体外增殖能力。将HDFs 作为饲养层细胞与hESCs 共培养，传代12代后，检测hESCs 碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。结果：HDFs 可连续传代培养15代以上，10代以下的HDFs 增殖迅速，而MEFs 自第4代起，增殖能力就明显下降；hESCs 在HDFs 饲养层上可传代培养12代以上，克隆边界清晰，细胞排列紧密，碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性，表达了hESCs 特异性转录因子。结论： HDFs 比MEFs 具有更强的增殖能力；HDFs 可作为培养hESCs 的饲养层细胞。关键词：人胚胎干细胞；人皮肤成纤维细胞；饲养层细胞中图分类号： R329.2文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009） 16-3001-05Culture of human embryonic cells by using human dermal fibroblasts as feeder cells* YANG Jun-lin,LIU Xiong-hao,YU Jiao-ling,FENG Mai,TAN Yang,LI Zhuo,WU Ben,GAO Ting, PAN Sheng,WU Ling-qian,LIANG De-sheng,XIA Jia-hui （State Key Laboratory of Medical Genetics,Central South University,Changsha,410078，China ） ABSTRACT Objective:To compare the proliferative potential of human dermal fibroblasts(HDFs)and mouse embryonic fibroblasts (MEFs),and to explore the feasibility for HDFs as feeder cells to support the growth of human embryonic cells (hESCs).Methods:HDFs were obtained from human skin by using the method of tissue-adherence.The proliferative capacities of HDFs and MEFs were compared by cell morphology and growth curve.HDFs were used as feeder cells to culture hESCs.After growing on HDFs for 12passages,the hESCs were tested for the expressions of alkaline phosphatase (AKP),the cell surface markers and cell-specific transcription factor of hESCs.Results:HDFs could be subcultured for more than 15passages,and retained strong proliferative potential before 10passages,while it decreased obviously in MEFs after subcultured for 4passages.The hESCs can passaged on HDFs feeder cells for 12passages with tightly packed cells and clear boundaries of clone,showing the positive results of alkaline phosphatase (AKP)and the cell surface markers and the expression of hESCs-specific transcription factor.Conclusion:HDFs showed a stronger proliferation ability than MEFs;HDFs can support the growth of hESCs. Key words:Human embryonic stem cells;Human dermal fibroblasts;Feeder cells Chinese Library Classification:R329.2Document code:A Article ID:1673-6273（2009） 16-3001-05*基金项目：国家重点基础研究发展计划（2004CB518800），国家高技术研究发展计划（2007AA021002和2007AA021206）和国家自然科学基金（30700458和30971298） 作者简介：杨俊林（1977-），男，博士研究生，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：yangjunlin@https://www.360docs.net/doc/847451479.html, 刘雄昊（1975-），男，博士，助理研究员，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：liuxionghao@https://www.360docs.net/doc/847451479.html, 杨俊林、刘雄昊为并列第一作者 △通讯作者：梁德生，E-mail ：liangdesheng@https://www.360docs.net/doc/847451479.html, （收稿日期：2009-07-06接受日期：2009-07-30） 前言 自1998年Thomson [1]等人建立第一株人胚胎干细胞（hu-man embryonic stem cells,hESCs ）细胞系以来，hESCs 迅速成为人干细胞领域的研究热点。 hESCs 是具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以定向分化成不同的细胞、组织，这使得hESCs 在细胞治疗以及再生医学方面具有巨大的潜力。目前大 多数的人胚胎干细胞系是以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse em-bryonic fibroblasts,MEFs)作为饲养层细胞维持其生长和未分化状态的， MEF 细胞通过与hESC 直接接触及分泌多种因子维持人胚胎干细胞未分化状态。而鼠源性的饲养层细胞很可能给hESCs 带来动物源性的病原体或生物活性分子的污染，严重阻碍hESCs 的临床应用。早期就在鼠的细胞发现Hantaan 病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）、呼肠病毒-3[2]，这些病 Ist. Nazionale Neurologico Carlo Besta Laboratory Procedures for Human Cell Culture August 2004 _______________________________________________________________ PRIMARY FIBROBLAST CULTURE FROM HUMAN SKIN BIOPSY This protocol describes the steps for obtaining a primary fibroblast cell line from human skin biopsies. Fibroblasts are derived directly from excised skin as explants; enzyme digestion by collagenase may help obtain cells in a shorter time. This protocol describes the different steps for obtaining a primary cell line from a skin biopsy. Equipment and materials ?Laminar flow hood ?CO2 incubator ?Inverted microscope ?Sterile surgical Instruments for microdissection ?BME fibroblast medium +2 or Mg+2 ?PBS 10x without Ca ?Collagenase type II (4mg/ml) ?Petri dishes 100 mm ?Pasteur pipettes 2 ?Culture flask, 25 cm ?15 ml sterile plastic tube BME Fibroblast medium BME 80 ml Foetal bovine serum 20 ml Penicillin-streptomycin solution 100x 1 ml Filter and store at +4°C, up to 1 month. The skin biopsy sample should be shaped as a diamond and about 5-10 mm in diameter. Collect the tissue sample in sterile BME fibroblast medium. Procedure 1 1.Rapidly wash the skin biopsy in PBS in a Petri dish, cut into small fragments and transfer these to a flask. https://www.360docs.net/doc/847451479.html,ing a sterile Pasteur pipette with flame-rounded tip, distribute the small tissue fragments over the bottom surface of the culture flask. 3.Pass the flask rapidly and carefully through the Bunsen flame in order to evaporate the medium so that the minced tissue pieces adhere to the plastic surface, but so as not to heat-damage the minced tissue. Take care not to cook the tissue! 4.Carefully add BME medium for fibroblast growth, firmly close the lid of the flask and place in CO2 incubator. 5.The next day, slightly unscrew the lid of the flask so that the tissue can “breathe.” 6.Replace the culture medium after two days and, from this point on, replace it three times a week. 本页已使用福昕阅读器进行编辑。 福昕软件（Ｃ）２００５－２００９，版权所有， 仅供试用。 成纤维细胞（fibroblast）成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁 的星状，具有突起。根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成 纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质 弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞 轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。此二型细胞可互相转化。 成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细，细胞核呈规 则的卵圆形，细胞轮廓不清。 成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成 前α多肽链（proalpha polypeptide chain），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen）。前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。 在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶原分子（tropocollagen）。 许多原胶原分子成行平行排列，结合成具有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结 合形成胶原纤维。 是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在 结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条 件下可以互相转变。不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织 中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养 成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位〔2，3〕。成纤维细胞形态多样，常见的有 梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而 发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅， 核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表 明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状 纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞 合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm(640?)周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘 合形成胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生 化结构上完全相同。处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面 内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可 重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在 结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分 化为成纤维细胞。2 成纤维细胞在一般创伤修复中的表现各种创伤均会造成不同程度的细 胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修 复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分 裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细 血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中， 成纤维细胞主要来源于真皮乳头层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围 的成纤维细胞和周细胞。内脏损伤时，参与修复过程的成纤维细胞多来自间质和包膜，以及 粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认为创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞，一方 面是由成纤维细胞通过分裂增殖而来，另一方面，更多地是由邻近的间充质细胞、纤维细胞 和毛细血管周细胞等演变或游走到伤处。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参 与修复后组织的改建。在某些病理条件下，以成纤维细胞为主要细胞成分的肉芽组织或增生 组织块还可以在非骨组织内发生钙化，引起异位骨化(ectopic ossification)。但对于异位骨化 的参与细胞及其机制尚不十分清楚，未分化间充质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和毛细血管 周细胞等可划归为诱导性骨祖细胞的细胞都有可能参与这一过程 恶性纤维组织细胞瘤(malignant fibrous histiotoma，MFH)多发生于深层软组织，首先由O’Briea和St oat所报道，原发于骨内者甚为少见。1972年Feldman和Norman提出将此瘤作为一种独立的骨肿瘤类型，以前常将骨内MFH误认为骨肉瘤、纤维肉瘤、骨巨细胞瘤或骨转移性癌等。由可分化为组织细胞和成纤维细胞的细胞形成。已发现此肿瘤的变种有：多形分层型，粘液型，巨细胞型、炎症型、血管瘤样型等。 病理 此瘤由发生间变的组织细胞和纤维母细胞所构成，现时可见有良恶性多核巨细胞和炎症细胞。无钙化灶，组织细胞呈圆形或近圆形，核为圆形或肾状，有明显的异形性，富于胞浆，并有吞噬现象。泡沫细胞中含细胞碎屑和含铁血黄素等。纤维母细胞疏密不一，细胞呈漩涡状或车辐状排列，细胞体积较大，卵圆形，核明显异形性，多核巨细胞有良恶性之分。前者很象破骨细胞或杜顿（Touton）巨细胞，恶性者为瘤巨细胞。 肿块常呈多叶状，灰—白色，有时为黄色或黄褐色（脂质、含铁血黄素）肿块中，特别在粘膜样变种中有胶状区域。在血管瘤样的类型中出血病变区居优势，并伴发充满血液的大腔隙。在炎症病变中，黄色尤为明显。有时出血和坏死较广泛，以致整个肿瘤的肿块均变为含有液体的囊而类似于—囊性血肿。有时肿瘤外观似已完全包被，但实际上，病变已浸润至其周围的组织。 组织病理学特征和鉴别诊断 （1）多形分层型 组织学表现以显著的细胞多形性为特征。梭形、卵圆形和巨细胞同时存在，后者既可为良性又可为恶性。这些细胞的多形性改变、明显的有丝分裂、染色过深的核、粗大的染色质和体大的核仁等不典型性常见于此种病变。有时，巨细胞、单核及梭形细胞均有浓染的嗜曙红胞浆，并伴有前期的肌样质。但从无横行的条纹状图像可见。 上述细胞的多形成分可能也是形成病灶的主要成份，但同时有所谓的分层改变。梭形细胞和胶原纤维多呈螺旋状或风车状排列，常常在其中心由胶原或小血管形成的嗜曙红区向周围放射。梭形细胞的银染色显示—特别明显的网状模式，并包围单个细胞，而在组织细胞占优势的区域，外包绕小的细胞组织。在分层区的中央，嗜银性表现特别明显。由于病变区含有脂质，因此，可见含量不等的泡沫细胞。有时，还可见急性和/或慢性炎症浸润现象。 胞浆的PAS染色呈阳性，但相当不规则，且较多变，而且主要对抗淀粉酶和透明质酸酶（为粘多糖而非糖原）。同一肿瘤中，可在多形改变占优势的区域旁侧发现典型的分层和胶原化外观。 恶性纤维组织细胞瘤尚须与所有具有显著多形性的肿瘤，尤其是非常少见的多形性横纹肌肉瘤相鉴别。后者很难见到横纹，在电镜下可显示成横纹肌细胞的分化；另外，对淀粉酸敏感的PAS阳性（糖原）是明显而不变的。 本病与多形性的脂肪肉瘤的鉴别诊断比较困难。后者无分层改变，但有成脂细胞和脂细胞的分化。在恶性纤维组织细胞瘤中也可能存在胞浆内空泡，但在成脂细胞中，空泡能向细胞核和周围转移，并使核变平，另外，在恶性纤维组织细胞瘤细胞形成的空泡中含有粘多糖物质。由于两种肿瘤（前者和多形性脂肪肉瘤）的脂质染色均为阳性，故对鉴别诊断无任何意义。 成纤维细胞的培养 1前言 成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。 成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。 2材料和方法 2.1材料 玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管 塑料器材：细胞培养板 橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管 滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜 2.2试剂的配制 水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、 2.3方法 2.3.1试剂配制 （1）细胞分散液：无钙胰蛋白酶加4倍无菌蒸馏水 （2) 组织冲洗液：无血清MEM （3）细胞生长液：含10％FCS MEM 2.3.2实验分配：每人1枚鸡胚，每人制备1瓶100mL培养瓶细胞。 2.3.3细胞制备过程 碘酊消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，用无血清MEM 冲洗3次，将鸡胚置于无菌平皿内，去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个平皿内，用无血清MEM冲洗3次，剪碎胚体，静止片刻，吸净上清，加入5－10倍无钙胰蛋白酶，并吸入于无菌青霉素小瓶内，用橡皮膏封严瓶口，37 ℃消化至细胞呈毛球样，吸净消化液，加入细胞生长液，将细胞置于细胞培养瓶中，并用大口吸管吹打细胞使之充分分散，分装2个细胞培养瓶内。 4、换液或接毒 细胞于37℃培养过夜，次日换细胞维持液，或单层接种病毒，每日观察CPE。 人皮肤成纤维细胞的获取 一、材料：手术过程中获取的老年人皮肤组织 二、所需试剂：DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶，PBS缓冲液，青霉素，链霉素 三、方法： 1.提前准备好含有添加过青霉素和链霉素的PBS缓冲液的15ml离心管低温放置。 2.将得到的皮肤组织置于含有PBS（添加300U/ml青霉素和300μg/ml链霉素）的15ml 离心管中，并以冰盒存放拿至实验室立马进行实验。 3.在生物安全柜中将得到的皮肤组织于培养皿内用（含300U/ml青霉素和300μg/ml链霉 素）的PBS缓冲液反复漂洗3-5次。 4.用无菌手术刀片和镊子轻轻剪除、刮去皮下肌肉和脂肪组织。或在PBS清洗前，用70% 酒精浸泡半分钟。 5.清理干净的皮肤组织转移至新培养皿内，用含抗生素的PBS反复清洗后，取出皮肤组织 转移到新的皿中。 6.用剪刀将皮肤剪成体积约1mm3大小的组织块。 7.将小组织块贴附于一新的培养皿底部，每平方厘米均匀接种10-15块组织。 8.5-10分钟后（以团块贴紧培养皿为准），加入少量含10%FBS的DMEM培养液，使组织 块刚刚接触培养液即可（不能浸没组织，防止组织块飘起来），置于CO2培养箱。 9.2-3h后沿培养皿边缘缓慢加入含10%FBS的DMEM培养液浸没组织块，随后将培养皿 轻轻放置于培养箱内，在移动过程中严禁剧烈晃动培养皿影响组织块的贴壁。 10.间隔2-3天观察组织块贴壁情况，并进行换液。 11.观察细胞爬出情况，当组织块周边细胞生长汇合率达90%以上时进行胰蛋白酶的消化传 代。剩余的组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，细胞达到融合后，再消化传代，然后剩余组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，反复上面的步骤。 滑膜性病变与骨性关节炎 陈智能1 ,杨连梓 2 (1.福建中医学院骨伤系,福建福州350003;2.福建中医学院附属第二人民医院,福建福州350003)收稿日期:2003-03-29 作者简介:陈智能(1979)),男,2002级骨伤专业硕士研究生。 关键词:骨性关节炎;滑膜;细胞因子;细胞凋亡;综述 中图分类号:R84.3 文献标识码:A 文章编号:1004-5627(2003)04-0053-03 骨性关节炎(Osteoarthritis,OA )是一种严重危害人类健康的慢性进行性骨关节疾病,近几年 来随着对OA 的深入认识,开始注意到滑膜在OA 中的重要地位,从滑膜细胞的生物学特性与滑膜组织屏障这个新角度来探讨骨关节炎的发病机制,本文对近几年的文献作一综述。 1 中医对OA 的认识 中医学认为骨性关节炎属/骨痹0,/痹证0等的范畴。OA 的病因病机为本痿标痹。5内经6最早论述痹病的病因病机及其分类。5素问#脉要精微论6曰:/膝者,筋之府,曲伸不能,行则偻附,筋将惫矣。05素问#上古天真论6曰:/七八肝气衰,筋不能动,,肾脏衰惫,形体皆极。05素问#痹证6曰:/风寒湿三气杂至,合而为痹。0精辟地论述了骨关节病的内在因素和外在因素。随着增龄,肝肾日渐衰惫,难以充盈筋骨,骨枯髓减,筋不得滋润则出现关节疼痛,活动不利。2 滑膜组织的病理生理特性 滑膜是被覆关节腔内面的纤维结缔组织,可以分为靠近关节腔的滑膜内层(滑膜衬里层或滑膜细胞层)及其滑膜下层(滑膜衬里下层)。滑膜内层由多形性的滑膜细胞和滑膜细胞间颗粒状无定型的基质组成,无血管和淋巴管。由A 型(巨噬样滑膜细胞)、B 型(成纤维样滑膜细胞)以及C 型细胞(树突细胞样滑膜细胞)组成[1] 。滑膜细胞的功能:具有清除作用,如吞噬并降解关节腔内的异物及细胞碎片等;合成作用,如合成透明质酸、纤维结合素、?型、ò型胶原、潜在的胶原酶蛋白酶促进因子、中性蛋白酶的抑制剂、润滑素以及其他小的未确定的基质成分,参与滑膜免疫应答;保持关节结构稳定;分泌滑液营养和润滑关节软 骨;重吸收滑液,保持关节腔内环境稳定[1]。滑膜切除可导致软骨病变[2] 。3 滑膜细胞与细胞因子 3.1 IL -1 IL -1可干扰及抑制软骨细胞代谢,促进软骨降解。正常的滑膜能诱导产生IL -1刺激软骨细胞合成和分泌降解软骨蛋白聚糖的酶,从而参与关节软骨的代谢;滑膜细胞在受到脂多糖(LPS)刺激时,IL -1B 的分泌量则显著增加,而在OA 滑膜细胞培养中,在无丝裂原或其它因素刺激时,其上清液中始终可检测出较高水平的IL -1,其中以IL -1B 为主[3],说明滑膜细胞的异常分泌状态可能在OA 中起着重要作用。在鉴定IL -1B 的分布时发现,主要分布于骨关节炎滑膜的衬里层细胞、软骨与血管强交界处[3],进而反映了病理性滑膜分泌IL -1的重要作用。炎性滑膜大量合成IL -1B 等炎症前细胞因子,进而对软骨细胞功能进行调节,影响了软骨细胞外基质的稳态,炎症前细胞因子通过诱导蛋白溶解酶合成,加速软骨基质降解。IL -1通过增加胰岛素样生长因子1(IGF -1)受体蛋白的产生,干扰IGF -1等生长因子功能,从而对软骨及滑膜正常的修复和代谢功能产生影响。IL -1Ra 可与IL -1竞争结合滑膜细胞上的IL -1受体,是IL -1的天然拮抗剂,IL -1Ra 拮抗剂蛋白可阻止软骨破坏[4]。OA 和RA 滑膜的衬里层细胞、炎症浸润细胞以及血管内皮细胞中均强烈表达IL -1Ra 蛋白,表达的水平基本类似,说明IL -1Ra 参与了OA 和RA 的病理过程[5]。有研究表明IL -1Ra 阳性细胞主要局限于滑膜的衬里层细胞及血管内皮细胞,产生IL -1Ra 的滑膜细胞主要局限于A 型滑膜细胞,B 型滑膜细胞零星表达,而在正常软骨和滑膜中均未见明 53 福建中医学院学报2003年8月第13卷第4期Journal of Fujian College of T CM August 2003,13(4) 小鼠滑膜细胞 小鼠滑膜细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠滑膜细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠滑膜细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠滑膜细胞产品简介： 产品名称：小鼠滑膜细胞（Mouse Gastric Fibroblasts Cells） 组织来源：小鼠滑膜组织 产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠滑膜细胞简介： 小鼠滑膜细胞分离自4-6周龄正常小鼠的滑膜组织，滑膜细胞主要功能：（1）滑膜细胞产生润滑液成分，并且与关节腔的吸收和血液/润滑液交换有关。（2）滑膜细胞增生，表现为不依赖于支持物生长，并且分泌大量的效应分子来促进炎症和关节损坏。 （3）是自身自分泌和旁分泌网络中效应因子的一部分。 本公司生产的小鼠滑膜细胞采用混合酶消化制备而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细 ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路在ＴＧＦ－β１诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用 胡永亮 刘真 焦大凯 马恬 王常勇 贾赤宇 目的 观察ＴＧＦ－［１对人皮肤成纤维细胞表型转化的作用是否受到ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶 信号通路的影响，以探究该通路是否参与了人皮肤成纤维细胞的表型转化。方法 原代培养人皮 肤成纤维细胞，将第４代细胞用ＴＧＦ－β１（ １０ ｎｇ／ｍｌ）刺激后，分不同作用时间（０、３、６、２４ｈ）提取细胞 内总蛋白。ＢＣＡ法测定总蛋白浓度，Ｗｅｓｔｅｒｎ －ｂｌｏｔ检测α－ＳＭＡ的表达水平；并用相同的方法检测不 同浓度ＴＧＦ－β１（０、２、１０、５０ ｎｇ／ｍｌ）刺激人皮肤成纤维细胞后，α－平滑肌肌动蛋白（α－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ，α－ＳＭＡ）的表达水平。用ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路阻断剂Ｙ－２７６３２处理后，再用ＴＧＦ－β１刺激， 作为实验组，将未作处理的正常细胞作为空白对照组，Ｙ－２７６３２（１０ μｍｏｌ／Ｌ）组作为阴性对照组，只 用ＴＧＦ－β１（ １０ ｎｇ／ｍｌ）刺激组作为阳性对照组，分别检测α－ＳＭＡ的表达差异。使用ＡＮＯＶＡ对蛋白 表达量进行统计学分析，Ｐ ＜０．０５为差异有统计学意义。结果 １０ ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－β１按不同作用时间 刺激人皮肤成纤维细胞后，α－ＳＭＡ的表达量分别为：０ｈ为１．０，３ｈ为１．９＋０．２、６ｈ为２．１±０．１， ２４ ｈ为３．１±０．１。２４ ｈ较其他３个时间点α－ＳＭＡ表达量明显上升（ｎ＝４，Ｐ＜０．０５）。不同浓度 ＴＧＦ－β１刺激人皮肤成纤维细胞后，α－ＳＭＡ的表达量分别为：０ ｎｇ／ｍｌ为１．０，２ ｎｇ／ｍｌ为１．４±０．２， １０ ｎｇ／ｍｌ为３．２±０．１，５０ ｎｇ／ｍｌ为３．１±０．２。１０ ｎｇ／ｍｌ表达量明显高于０ ｎｇ／ｍｌ和２ ｎｇ／ｍｌ（ｎ ＝４， Ｐ ＜０． ０５），较５０ ｎｇ／ｍｌ差异无统计学意义（ｎ＝４，Ｐ＞０．０５）。用Ｙ－２７６３２（１０ μｍｏｌ／Ｌ）处理后，再用 ＴＧＦ－β１刺激，细胞的表型转化明显受到抑制，实验组α－ＳＭＡ的表达量（１．２±０．２）较阳性对照组 （２．９±０．１）明显降低（ｎ＝５，Ｐ ＜０．０５），与空白对照组（１．０）和阴性对照组（１．１±０．１）相比差异均 无统计学意义（ｎ＝５，Ｐ＞０． ０５）。结论 ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路参与了 ＴＧＦ－β１诱导的人皮肤成纤 维细胞表型转化过程。 成纤维细胞； ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路；转化生长因子β１； α－平滑肌肌动蛋 白 Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｏｎ ＴＧＦ－β１－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ＨＵ Ｙｏｎｇ－ｌｉａｎｇ ＬＩＵ ＺｈｅｎＪＩＡＯ Ｄａ－ｋａｉＭＡ ＴｉａｎＷＡＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｙｏｎｇ ＪＩＡ Ｃｈｉ－ｙｕ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ Ｂｕｒｎ Ｒｅｐａｉｒ， ３０９ ｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＰＬＡ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１， Ｃｈｉｎａ １０． ３７６０／ｃｍａ． ｊ． ｉｓｓｎ． １００９－４５９８． ２０１１．０５． ０１５ 国家自然科学基金（３０７７２２５９） 作者单位：１０００９１ 北京，解放军第３０９医院整形美容烧伤修复中心（胡永亮、刘真、马恬、贾赤宇）；军事医学科学院基础医学研究所组织 工程研究室（王常勇）；航空工业中心医院整形外科（焦大凯） Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｏｎ ＴＧＦ－β１－ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ４ｔｈ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＧＦ－β１ （１０ ｎｇ／ｍｌ）． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ α－ＳＭＡ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＴＧＦ－β１ ｆｏｒ ０， ３， ６， ａｎｄ ２４ ｈ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔ－ＳＭＡ ｗａｓ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ－β１ （０， ２， １０， ５０ ｎｇ／ｍｌ）． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ （４ｔｈ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ） ｗｅｒｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＧＦ－３１ （ １０ ｎｇ／ｍｌ） ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｙ－２７６３２ （ｌ０ｕｍｏｌ／ｍｌ）． Ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｔｈｉｎｇ ａｓ ｓｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌ， ｏｒ ｗｉｔｈ Ｙ－２７６３２ （１０ｕｍｏｌ／Ｌ） ｏｎｌｙ ａｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｏｒ ｗｉｔｈ ＴＧＦ－β１ （１０ ｎｇ／ｍｌ） ｏｎｌｙ ａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ α－ＳＭＡ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ａｌｌ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 论著 【收稿日期】2004-10-12;【修回日期】2004-12-03 【作者简介】李卫华(1971-),男,籍贯河北,硕士,主治医师,主要研究方向为瘢痕的形成机理。 增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较 李卫华1,李德水2,刘洪琪2 (武警医学院:11整形美容中心;21烧伤整形科;天津300162) 摘 要: 【目的】探讨增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞基因表现型的差异以及EGF 、PD GF 和 bF GF 对其的影响。【方法】测定细胞生长曲线;应用液闪计数测定成纤维细胞胶原蛋白的合成。【结果】增生性 瘢痕成纤维细胞增殖速度比正常皮肤成纤维细胞慢;胶原蛋白的合成高于正常皮肤成纤维细胞。EGF 、PD GF 和 bF GF 均对两种成纤维细胞的增殖具有强烈的刺激作用。EGF 和bF GF 可减少增生性瘢痕成纤维细胞的胶原蛋白 合成,PD GF 可以使两种成纤维细胞的胶原蛋白合成增加。【结论】增生性瘢痕成纤维细胞是一种特殊基因表现型的成纤维细胞,它具有自己特殊的生物学特性。EGF 、PD GF 和bF GF 在增生性瘢痕的形成过程中可能具有重要作用。 关键词:增生性瘢痕;成纤维细胞;胶原蛋白;表皮细胞生长因子;血小板衍生生长因子;碱性成纤维细胞生长因子 【文章编号】 100825041(2005)022******* 【中图分类号】 R32912 【文献标识码】 A The study of the phenotypic differences of hypertrophic scar f ibroblasts versus normal dermal f ibroblasts by cytokine stimulation L I Wei 2hu a ,L I De 2shui ,L IU H ong 2qi (Department of Plastic and Esthetic Surgery ,The A ff iliated H ospital of Medical College of Chinese People ′s Armed Police Force ,Tianjin 300162,China) Abstract :【Objective 】To study the phenotypic differences between the hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts by determining their responsiveness to EGF 、PD GF and bF GF 【Methods 】Hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts were propagated in culture.Their proliferative behaviors were studied.The collagen synthetic rates were determinedwith liquid scintillation technology.【R esults 】Hypertrophic scar fibroblasts grew at a lower rate than that of normal dermal fibrob1asts.The collagen synthetic rate of the hypertrophic scar fibroblasts was higher than that of the normal dermal fibroblasts.EGF 、PD GF and bF GF stimulated the proliferation of both cells violently.The col1agen synthesis of hypertrophic scar fibroblasts was inhibited by EGF and bF GF whereas PD GF increased both cells ′collagen synthesis.【Conclusion 】The hypertrophic scar fibroblast is a different phenotype from the normal dermal fibrob 2last.EGF 、PD GF and bF GF may play important roles in the formation of hypertrophic scars.K ey Words :Hypertrophic scar ;Fibroblasts ;Collagen ;EGF ;PD GF ;bF GF 增生性瘢痕一直是限制患者正常愈合的一个主要问题,其病因尚未完全明了。Worrall 1的研究结果显示将正常皮肤成纤维细胞长期暴露于可溶性单核细胞提取物的环境中可使成纤维细胞发生红斑 狼疮样基因表现型改变。G arner 2的研究结果揭示增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞可能具有不同的基因表现型。为了进一步明确增生性瘢痕成纤维细胞基因表现型,我们应用体外细胞培养技术研究了增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞的形态、生长曲线以及胶原蛋白的合成,并就表皮细胞生长因子(EGF )、血小板衍生生长因于(PD GF )和碱性成纤维细胞生长因子(bF GF )对增生性瘢以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞_杨俊林
一 人皮肤成纤维细胞培养
成纤维细胞
恶性纤维组织细胞瘤
成纤维细胞的培养
人皮肤成纤维细胞的获取-
滑膜性病变与骨性关节炎_陈智能
小鼠滑膜细胞使用说明
%9a%84人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用
增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较