交叉保护中和试验
流行性乙型脑炎病毒的分离和鉴定
流行性乙型脑炎病毒的分离和鉴定
根据乙型脑炎明显的季节性和地区性及其临床特征，例如高热和狂暴或 沉郁等神 经症状，流行期中不难作出诊断。但是必须与其它的病毒性、细菌性和中毒性脑炎相鉴别。 由于母猪可能发生流产，公猪可能发生睾丸炎，还需注意与布氏杆菌病、细小病毒病以及生 殖和呼吸道综合症等鉴别。为了确诊，必须进行病毒分离和血清学试验等特异性诊断。?
(1) 病毒的分离和鉴定：在动物发热初期，可采血液或血清分离病毒。动物死后， 应尽快(夏天不得超过2～3小时)采取脑组织分离病毒。各项操作以 及病料的运送，必须遵守“冷藏”和“快速”两个原则。根据作者等的经验，如将乳 鼠带到现场接种，可以明显提高病毒分离率。? 乳鼠是应用最多的实验动物，也是多年来实践证明比较有效的病毒分离动物。 应用脑内?皮下同时接种法或在脑内接种的同时，再较大量地作腹腔接种，例如0?2～0? 5ml，常可提高病毒分离率。乳鼠发病时，离群、拒食、抽筋、消瘦， 此时即可采脑作 进一步传代或鉴定。但需注意，发病乳鼠常被母鼠吃掉，故应及时将母鼠取走。也可将上述材料接种于7～9日龄的鸡胚卵黄囊内，2～3天后收获胚体，再作乳鼠接 种。 近年来常用仓鼠肾原代细胞分离乙脑病毒，即在已经长成单层的仓鼠肾细胞内 加入该培养瓶(管)原营养液量1/5～1/10的接种材料，吸附30～60分钟后，加入维持液， 继续置37℃，每天观察1次，共7天，如发现“＋＋”的细胞病变，即可收获，供传代或鉴 定用。仓鼠肾BHK?21细胞系也可被用于分离病毒，接种病料后观察1周后如无CPE出现,可作盲传。? 即使被检材料中含有病毒，但在初代接种小鼠或细胞培养物后，往往不见发病或 不出现细胞病变，这是野外毒株尚未适应实验动物或细胞培养物的缘故。 因此第1代接 种呈阴性结果时，应继续盲传2～3代，也就是经一定时间(7～10天) 而尚未发现动物发 病或细胞出现病变时，可按常法扑杀几个动物采脑，或选取几瓶细胞培养物作冻融处理， 再作下一代动物或细胞培养物的传代接种。? 欲由蚊体分离病毒时，用捕蚊管或捕蚊器捕蚊。最好先在室内饲养2～3天，待胃血 消化，抗体消失,这样可以提高病毒分离率。分离时用氯仿将蚊熏死，鉴定分类，并以 25、50或100只为1批，装入灭菌的小瓶或试管中。随后加入2～3ml25%酒精生理盐水， 充分摇洗5～10分钟，倒掉酒精液，再用灭菌生理盐水或Hanks液洗2～3次后，移入玻璃 研磨器内，加入1～2ml0?5%乳白蛋白水解物或其它稀释液，磨细后பைடு நூலகம்入离心管，以3 00 0r/min转的速度离心沉淀20分钟，吸取上清液，如上加入青、链霉素，置4℃感作1小时 后接种动物或细胞。细胞营养液内应加两性霉素，以免霉菌生长。 Hsu等在台湾南部 收集猪场的蚊，自1974年7月至1976年12月共捕蚊125 000只，分为1 650批，做成乳剂后 分别接种乳鼠和库蚊细胞培养物。在库蚊细胞培养物中分离到68株乙脑病毒，由乳 鼠脑分离到48株病毒，似乎说明库蚊细胞培养物比乳鼠更适于由蚊体分离乙脑病毒。?新分离病毒的初步鉴定按一般方法进行，请参阅本书第十四章。随后再用乙脑标准 毒株和标准免疫血清与新分离病毒进行交叉补体结合试验、交叉中和试验、交叉血凝抑 制试验。也可应用小鼠进行交叉保护试验，即用新分离毒株和标准乙脑毒株分别制备 福尔马林灭活疫苗，给3周龄小鼠皮下接种0?1～0?2ml，共2次，间隔7天， 另留部 分小鼠不免疫作为对照。于第2次注射后两周，用不同稀释度的标准乙脑毒株攻击：采用腹 腔攻击、脑内刺激法，即在腹腔注射病毒的同时，给每只小鼠脑内注射0?03ml 生理盐水或肉汤。观察3周，记录各组小鼠的死亡和保护数。如为同种病毒， 则其抵 抗标准乙脑毒株的攻击量可比对照组高100～1 000倍， 并与以标准乙脑毒株免疫的小鼠 组的保护率相近。? 检出病畜体内的病毒抗原，是快速诊断的需要，也是国内外正在探索和深入研究的 一个课题。作者等应用固相和液相补体结合试验、免疫粘附试验、反向间接血凝试验、 荧光抗体技术、免疫酶技术、?1?2?5I放射免疫测定以及反转录?多聚酶链RT?PCR反应 等方法检测乙脑感染小鼠和自 然感染病马脑内的病毒抗原，都有较高的特异性和检出率。
动物病毒学(DOC)
动物病毒学(DOC)《动物病毒学》实验课讲稿任课教师：方六荣授课对象：2002级动物医学专业1-4班授课时间：2004.09-2005.01实验一鸡胚接种一、实验目的了解鸡胚的基本结构与功能及鸡胚接种的方法，掌握常用的鸡胚接种方法。
二、鸡胚接种的作用主要用于：①分离病毒，并根据病变初步鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系（用鸡胚作中和试验和交叉保护实验）④测定病毒毒力三、材料1、鸡胚10日龄2、病毒鸡传染性支气管炎病毒（IBV）3、照蛋灯4、打孔器5、石蜡6、注射器7、蛋座8、酒精棉球、碘酊棉球四、鸡胚用于病毒培养的优缺点（一）优点1、组织分化程度低2、可选择不同的日龄和接种途径3、病毒易于增殖4、感染病毒的组织和液体中含大量病毒5、容易采集和处理6、来源充足7、设备和操作简便易行（二）缺点1、胚内可能污染细菌和病毒沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒2、母源抗体3、许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针五、鸡胚的结构与功能1、卵壳上有细孔，进行气体交换2、壳膜使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。
3、气室呼吸和调节压力4、绒毛尿囊膜起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。
5、尿囊腔胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。
6、羊膜与羊膜腔其中盛有羊水，胎体浸泡于其中7、卵黄在胚胎发育早期供给鸡胚营养。
8、卵白在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。
六、受精卵的选择1、最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响。
2、受精卵的壳最好是白色的，以便于检卵。
3、受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
七、鸡胚的孵育1、孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃2、相对湿度：50%-60%3、必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后4、从孵育后第3天开始，每天翻卵一次八、检卵自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。
病毒病的常规实验室诊断
胞现象也可被特异性抗血清所抑制，故在病毒鉴定，特别是对
某些不产生细胞病变的病毒，常用红细胞吸附和吸附抑制试验 进行快速鉴定。
2.4 补体结合试验（CFT）
原理：CFT是根据任何抗原抗体复合物可激活、固定补体的特 性，用一定量的补体与致敏红细胞来检测抗原、抗体间有无特 异性结合的一类实验。 参与本实验的五种成分分为两个系统 ①待检系统：已知抗原（或抗体）和待检 抗体（或抗原细胞代谢的测定
病毒间的干扰现象
抗原的测定
电子显微镜观察
1.5 病毒感染力的测定—半数细胞培养物感染量 （TCID50)
Reed-Muench
内插法
Karber法
细胞病变孔：50%以上细胞发生病变才可算为细胞病变孔。
病毒种类 狂犬病病毒 接种途径 卵黄囊 ++ 绒毛尿囊膜 ++ 尿囊腔 养膜腔 脑内 +++ 病变 特征 鸡胚死亡 备注
流感病毒
新城疫病毒 痘病毒 蓝舍病病毒 传支 法氏囊 鹅细小
++++
++++ +++ +++ +++ ++ +++++ ++ ++++ ++++
2.9 单扩溶血试验
是在琼脂单扩散基础上发展起来的，又称为被动溶血技术，主要用于流感 病毒血凝素和神经氨酸酶抗体的测定。 吸附在红细胞表面上的抗原与同种抗体结合，再加上补体的作用，就会使 红细胞溶血，由于糠油抗体血清的稀释度与溶血圈直径或面积的大小成直 线关系，所以可对血清抗体进行定量测定。
基因疫苗与疫苗预防交叉保护研究考核试卷
B.病毒进化分析
C.机体免疫应答分析
D.疫苗效力比较
18.以下哪些是基因疫苗研发的优势？（）
A.可以针对多种病原体
B.可以快速应对新出现的病原体
C.免疫效果持久
D.生产成本较低
19.以下哪些方法可以用来提高基因疫苗的免疫效果？（）
A.优化抗原表位
B.联合使用免疫增强剂
C.选择合适的载体
答案：__________、__________
8.基因疫苗的一种常见类型是__________疫苗，它使用DNA作为抗原。
答案：__________
9.疫苗预防交叉保护的效果可以通过__________和__________实验来评估。
答案：__________、__________
10.在进行基因疫苗的交叉保护研究时，需要考虑到__________的多样性。
C.动物实验
D.临床试验
7.基因疫苗与传统的疫苗相比，主要区别在于（）
A.产生抗体的类型
B.产生抗体的数量
C.免疫途径
D.免疫原理
8.以下哪个不属于基因疫苗的组成部分？（）
A.目的基因
B.载体
C.免疫增强剂
D.抗生素
9.疫苗预防交叉保护作用的主要机制是（）
A.抗原交叉反应
B.抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
B.直接杀死病毒
C.通过DNA重组技术使机体产生抗原
D.刺激机体免疫系统
2.下列哪种疫苗属于基因疫苗？（）
A.灭活疫苗
B.减毒疫苗
C.亚单位疫苗
D. DNA疫苗
3.交叉保护作用是指疫苗对（）的免疫保护作用。
A.同一病毒的不同亚型
B.不同的病毒
细胞培养与病毒培养试验步骤
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸背激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21 (baby hamster kidney)细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3X105个/ml2）pH 范围最适 pH7.0-7.4,耐受 pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的竣基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠任01人）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和竣肽酶的混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、喀啶、辅助生长因子。
2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。
用前56℃灭活30min。
3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
鸭肝炎病毒变异株的分离鉴定试验
摘 要 ： 四 川 某鸭 场疑 似 鸭肝 炎的病 死 雏 鸭 中分 离到一 株病 毒 ， 过 中和试 验 、 鸭 交叉保 从 经 雏 护试 验 ， 明该病 毒是 Ｉ 证 型鸭肝 炎病毒 变异 株 。用 Ｉ 型鸭肝 炎病 毒 和分 离毒 制备 的 高免 卵黄抗体 在部 分 养鸭 场进行 预 防及 治 疗试验 ， 获得 了 良好 的 防治效 果 ， 效地 控 制 了鸭病 毒性 肝 炎的发 生 有
毒 标 准株 ， Ｌ ∞ １ －ｓ．ｍ ， Ｅ Ｄ ＝ ０７ ０１ Ｌ 本 ２ ／ 院实验室保存 ： 鸡抗 Ｄ Ｖ １ Ｈ 一 型高 免 卵黄 抗 体 ，鸡胚 中和 效 价 为 ６ ７ｏ １ ， 自制 ； ． １ｇ ０ ６ ２日龄 雏 鸭 、０ １ 日龄 鸭胚均购 自非免 疫鸭场。 １ ． 细 菌分 离 从 病 死 雏 鸭肝 ２ 脏 、 血 中无 菌操 作取 样 接种 于 心 营 养琼 脂 平板 、鲜 血 琼脂 平 板 、 麦 康 凯 琼 脂 平板 上 ，分 别 进 行 ３ 厌氧和 ３ 恒 温培 养。 察 ７Ｃ ｑ ７Ｃ ｑ 观
有 无细 菌生 长
０ ｍ／ ， 下１ ． Ｌ只 余 ５ ０只不接 种作为 对照组 。隔离饲养 ，观 察雏 鸭发
肝 炎 标准 毒 株 、 分离 的 变异 株 制 成 灭活苗 ， 疫 蛋鸡 获得 高 免 卵 免
病、 死亡情况 ， 并记录剖 检变化 。
１ ． 病毒 的鸡 胚 适 应 试 验 ５ 取 Ｈ ０ ＹＤ １毒 株 经 尿 囊 腔 接 种 鸡
黄抗体 。 在雏 鸭 出壳后 １ ２ ， ～ ｄ 注
射 ０５ １ ．～ ． ０ｍＬ高 免 卵 黄 抗 体 预 防 ， 时对发 病 鸭群 用高 免 卵黄 同
胚 ，．ｍＬ胚 ，观 察 鸡胚 病 变和 ０２ ／ 死亡 情况 ， 收获胚 体 及尿 囊 液进
基因Ⅶ型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究
动物医学进展,2021,2(2):12-18ProgressinVeterinary Medicine基因W型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究薛景景12A，侯瑞卿12A，王婉冰12,张盼涛12,袁月12,郭丽霞2,张哲3，田辉12,刘武杰，田克恭(1.国家兽用药品工程技术研究中心，河南洛阳471000； 2.普莱柯生物工程股份有限公司，河南洛阳471000；3.河北省动物卫生监督所，河北石家庄050000)摘要：旨在分离筛选免疫原性好的新城疫病毒(NDV)流行毒株。
从发病鸡组织中分离到4株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定为NDV,进而完成致病指数测定、F基因高变区测序和遗传进化分析，并通过鸡胚交叉中和试验和攻毒试验研究PLK-N-06株对比La Sota疫苗株的抗原差异和免疫保护效力。
结果显示，4个分离株的致病指数均属速发型NDV范围，且PLK-N-06株毒力最强；F蛋白裂解位点均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株特征。
遗传进化分析表明，分离株均为呱d亚型。
交叉中和试验结果显示,PLK-N-06株和La Sota株存在显著的抗原性差异。
用PLK-N-06株油乳剂灭活苗免疫接种SPF鸡后产生的HI 抗体效价几何平均值为1:338,显著高于La Sota疫苗(1:69),且其对PLK-N-06株感染的排毒率为0/10,明显低于La Sota株油乳剂灭活苗的4/10,结果表明PLK-N-06株具有良好的免疫原性，为新城疫基因呱型新型疫苗的研发奠定了基础。
关键词：新城疫病毒；基因呱型；分离鉴定；抗原相关系数；免疫原性中图分类号：S852.659.5；S852.4文献标识码:A文章编号：1007-5038(2021)02-0012-07新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的以呼吸道症状、消化道症状、神经症状等为特征的烈性传染病,是严重危害世界和我国养鸡业的重要疫病之一，每年造成巨大的经济损失［13］o NDV亦被称为禽I 型副黏病毒(Avian paramyxovirus type1,APMV-1),属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽腮腺炎病毒属＜Aulavirus)［，基因组由一条单股不分节段的负链RNA分子组成，分别编码包括核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)、大分子聚合酶蛋白(L)在内的6种结构蛋白，其中F蛋白在NDV致病性中起重要作用曰。
动物微生物学中常见的病毒和细菌病诊断
陈双钊一常见的致动物疾病性病毒狂犬病病毒狂犬病病毒（Rabies virus）属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus），是引起人和动物狂犬病的病原，该病在世界各地均有发生。
一、生物学特性病毒子长140～180nm，宽75～80nm，一端钝圆，另端平凹，呈子弹头形或试管形。
在螺旋对称的衣壳中，含有负股单股RNA。
具有脂蛋白的囊膜，在膜上有血凝素的穗状突起。
该病毒只有一个血清型。
二、抵抗力病毒在pH为7～9的范围内比较稳定，在56℃经30min可使病毒灭括。
五、致病性狂犬病病毒几乎可以感染所有的温血脊椎动物，同样也能感染人。
本病主要由患病动物咬伤后而感染。
当健康动物皮肤粘膜有损伤时，接触病畜的唾液亦可以感染。
病犬的唾液于症状出现前1～2周便可能会有病毒。
存在于病畜唾液中的病毒，通过咬伤而进入易感动物的皮下组织，然后沿着神经纤维由外周进入神经中枢。
也有人认为病毒是由外周经血液侵入脑组织。
病毒在脊髓和脑组织中增殖，并可按离心方向由中枢神经向外扩散，而脑脊髓液在病毒扩散中，亦起着重要作用，使所有器官都能查出病毒。
抵达唾液腺的病毒，在其上皮细胞内又大量增殖，并进入到唾液中。
病毒在中枢神经系统中的继续繁殖，损害神经细胞和血管壁，引起血管周围的细胞浸润。
神经细胞受刺激后，首先引起兴奋症状，如神经紊乱和反射性增高，后期神经细胞变性，逐渐引起麻痹，当呼吸中枢麻痹后即可造成死亡。
六、微生物学诊断常用的特异性检查方法有包涵体检查，动物试验，荧光抗体检查等三种。
（一）包涵体检查取大脑、小脑，特别是海马角部分，用刀片切开印片，趁印片未完全干燥时，以塞勒（Seller）氏液染1～5s，水洗、干燥、镜检。
内基氏小体呈鲜红色、间质呈粉红色、红细胞则为桔红色。
内基氏小体为圆形、卵形、核形、阿米巴形。
大小为24～27μm，位于细胞浆内。
用姬姆萨氏（Giemsa）染色，小体为红色（图10-1）。
由于有些犬、猪和草食兽的病例及病初死亡或早期剖杀动物中可能不见包涵体，所以并不是所有的病例都能检查出包涵体来。
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附件7 交叉保护中和实验
试验目的：血清分型
标本：出血热恢复期病人血清
材料：
1. 毒株：汉滩病毒标准株 76－118，汉城病毒标准株 Seoul。
2. 标准血清:兔抗汉滩病毒、汉城病毒血清。
3. 空斑减少中和试验常用试剂。
步骤：
1. 将待检血清用牛血清Hanks 氏液稀释成1：10，56℃灭活30分钟，
2. 进一步2倍稀释血清成1：20、1：40、1：80……，对照血清1：10稀释。
3. 稀释两种病毒（在冰浴中进行）至含200pfu/ml.
4. 各连续稀释度血清分别与200pfu/ml的两种病毒液等量混合（各0.3ml），置37℃中作用1小时（每15分钟振荡一次）。
5. 吸出各细胞培养孔中维持液。
6. 接种长满单层的Vero-E6细胞（24孔板），每孔接种血清病毒混合液、标准血清对照及两种病毒对照，每稀释度两孔，100ul/孔。
37℃吸附1小时，每隔15分钟摇动一次。
7. 加第一层琼脂糖覆盖液（需冷置42℃左右），每孔1ml，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培养7—9天。
8. 加第二层含中性红琼脂糖覆盖液，1ml/孔，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO2 孵箱培养2——5天，从第二天开始观察空斑数。
9. 抗体滴度的判定，以比病毒对照的空斑数中和或减少50%的血清最高稀释度倒数判为待检血清中和抗体滴度。
10. 型别判定：根据同一份血清与两种病毒的反应滴度不同来区分，如果一份血清与汉滩病毒（或汉城病毒）反应的抗体滴度高于与汉城病毒（汉滩病毒）的抗体滴度4倍或以上，即判为汉滩病毒型，反之则为汉城病毒型。
两者滴度相差无几时，则不好分型。
不足4倍时亦不能定型。
配方：
第一层琼脂糖覆盖液：
2×Eagle MEM液 50ml(Gibco-BRL)
灭活胎牛血清 10ml
L-谷氨酰胺 4ml（200mmol/L,100X）
MEM非必需氨基酸 1ml(Gibco,100x)
1mol/L HEPES缓冲液 2ml
青链霉素 1ml(青霉素10000u/ml,链霉素10000ug/ml)
制霉菌素（一般可以不加） 0.1ml
临用前配制，放入42℃水浴中，另取
琼脂糖 0.6g(Sigma, Type II medium EEO) 超纯水 34ml(适用于细胞培养的纯化水)
8磅高压灭菌15min，置42 ℃水浴15min，加入上述配制的组分中，即可使用；
第二层琼脂糖覆盖液：基本上同第一层琼脂糖覆盖液，仅将灭活胎牛血清改为5ml，另加中性红溶液1ml(333.0ug/L中性红钠盐Gibco) 。