实验报告一 产酶微生物的发酵与保藏
发酵工程实验
发酵⼯程实验发酵⼯程实验 Prepared on 24 November 2020实验⼀酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时）实验⽬的：1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与⽅法。
2、了解市售酸奶的⽣产⼯艺。
3、掌握乳酸菌活菌计数⽅法与操作。
实验原理：乳酸菌在乳中⽣长繁殖，发酵分解乳糖产⽣乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋⽩在其等电点附近发⽣凝集。
乳酸菌属于兼性厌氧微⽣物，在⽆氧条件下⽣长繁殖较好，实验室条件下利⽤混菌培养的⽅法，尽可能让乳酸菌在⽆氧条件下⽣长，每个单菌落代表⼀个微⽣物细胞。
实验内容：（⼀）酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热⽔（80℃左右）中，充分搅拌均匀，配成调制乳；2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶⼝味，在调制乳中加⼈4-8％的蔗糖。
3、灭菌：⽅法有两种：将乳加热⾄90℃，保温5min；4、接种：往冷却到43-45℃灭过菌的乳中加⼊乳酸菌，接种量为2%-5%。
5、分装：酸奶受到振动，乳凝状态易被破坏，因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进⾏分装，须是将含有乳酸菌的⽜乳培养基先分装到⼩容器中，加盖后送⼊恒温室培养，在⼩容器中发酵制成酸奶。
6、发酵：发酵的温度保持在40-43 ℃，⼀般发酵时间为3-6h。
发酵终点的确定有两种⽅法：1）检测发酵奶的酸度，达到65-70 T°。
2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，⽽且瓶中部有细微颗粒出现。
7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，⽤冷风迅速将其冷印到10℃以下，⼀般2 h，使酸奶中的乳酸菌停⽌⽣长，防⽌酸奶酸度过⾼⽽影响⼝感。
8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。
9、感官指标1）⾊泽：⾊泽均匀⼀致，呈乳⽩⾊，或稍带微黄⾊。
2）组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，⽆⽓泡，允许少量乳清析出。
3）⽓味：具有清⾹纯净的乳酸味，⽆酒精发酵味，⽆霉味和其他外来不良⽓味。
（⼆）乳酸菌活菌检测①、检测培养基：蛋⽩胨15g，⽜⾁膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g，琼脂粉20g，⽔1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置⽔浴52℃保温备⽤。
微生物工程实验报告
实验1 培养基的配制和灭菌一、目的要求1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。
4.每2人一组，每人一份实验报告。
二、实验材料1.药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、1N HCl、1N NaOH2.设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。
3.材料：天平、药匙、电炉、pH 试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、移液器（1mL 0.2mL）、牛皮纸、线绳、标签等。
三、实验内容(一) 培养基的配制1．培养基的配制方法和步骤1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。
2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。
3)调pH 值：用1N NaOH 或1N HCl 调pH，用pH 试纸对照。
4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。
5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。
6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。
7)灭菌：在高压锅中， 115 °C 高温灭菌30min。
2．培养基的配制A.富集培养基（液体）：海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH 8.0。
取50mL 分装250mL 三角瓶后，8 层纱布封口，外包1层牛皮纸，121℃，高温灭菌20min。
B. 2216E 斜面（固体）：海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内。
加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。
C. 无菌生理盐水和保种液：生理盐水： NaCl 0.85% 蒸馏水配制。
每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121°C 高温灭菌20min。
保种液：生理盐水，加25%甘油D. 碳源优化培养基：以海水2216E 液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。
发酵实验报告(根霉曲的制备及根曲霉糖活力的测定)
签名：2013年04月日
2、糖化酶是诱导酶。淀粉能诱导酶的形成，培养基中淀粉浓度与糖化酶的酶活及糖化酶的mRNA 含量成正相关，在培养基中适当提高培养基中淀粉含量，可以
增加产酶的量，酶活也有所提高。本实验没有添加任何诱导物。
3、实验人员的在吸取、滴定等操作存在误差，导致实验结果有所偏差。
4、制备5%固体曲浸出液时，糖化酶没有完全浸出，造成分解淀粉量减少，滴定所用标准葡萄糖溶液增多，计算所得酶活力减少。
①空白对测定结果的影响：空白的制备原则是使糖化酶不催化分解可溶性淀粉,即反应液中不存在葡萄糖。
②酶液稀释倍数对测定结果的影晌：在制备待测酶液时,稀释倍数不同对测定结果有较大影响。
③糖化时间长短对测定结果的影响。
④试剂加入顺序对测定结果的影响。
⑤酶制备液存放时间长短对测定结果的影响：试验是指从向酶中加缓冲液开始至糖化反应开始这段时间的长短对测定结果的影响。据试验,该酶在缓冲液中是非常稳定的。从半小时后开始测定酶活力,间隔一定的时间连续测定,直到存放三天后为止,结果测得酶活力基本一致,并没有因存放时间延长而活力下降。
小组合作
XX
XX
XX
XX
1、实验目的
1.1掌握固体发酵的基本操作步骤；
1.2了解根霉曲制作工艺和基本原理；
1.3了解糖化酶的测定方法；
1.4对糖化酶的糖化产物及糖化DE的计算；
1.5了解根霉曲在发酵生产过程中主要应用依据。
2、实验设备及材料
2.1材料：麦麸、根霉AS3.866
2.2试剂：柠檬酸缓冲液、DNS、1%淀粉
4.2.1.1先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。
土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏
——土壤中微生物的分离纯 化、培养观察及保藏
实验流程
土 壤 分样 离品 纯中 化微 生 物 的
细菌 酵母菌 放线菌 霉菌
形态结构观察
生理生化反应
nisin效价测定
生长曲线测定
菌
种
形态观察
保
直接计数
藏
死活细胞鉴定
形态结构观察
土壤中微生物的分离、纯化 和培养
土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖 产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后 者在强碱环境下，被空气中的氧气氧化为二乙酰，二 乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+） 反应。
细菌细胞的生理生化反应
吲哚实验- 1
细菌细胞的生理生化反应
吲哚实验- 2
细菌细胞的生理生化反应
其基本原理是选择适合于微生物生长的培养条件如营养成分酸碱度温度和氧等或加入某种抑制剂在平板上培养微生物当平板上长出单菌落后挑取得到纯种的微生物土壤中微生物的分离纯化培养观察及保藏试剂与器材1材料含大肠杆菌枯草芽孢杆菌乳酸乳球菌黑曲霉根霉青霉和放线菌的土壤样品牛肉膏蛋白胨培养基斜面液体半固体马丁氏培养基查氏培养基等2试剂10酚4水琼脂3器材盛9ml无菌水的试管盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶涂布器无菌吸管接种环酒精灯无菌培养皿显微镜细胞计数板等
细菌的革兰氏染色
试剂与器材
1、材料
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
2、试剂
结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红等。
3、器材
显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（内 装香柏油及二甲苯）、擦镜纸、生理盐水等。
Procedures of Gram Staining
食品微生物8 微生物分离、纯化与保藏技术
（一）菌种保藏的目的
保持其原有性状和活力的稳定； 确保菌种不死亡、不变异、不被污染；
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
（二）菌种保藏依据：
根据菌种的生理、生化特点，人为地创造低温、干燥、 缺氧、缺乏营养条件，使菌种的代谢活动和生长繁殖处 于受抑制的休眠状态。 保藏菌种的选取：选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢 子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
沙土管保藏流程：
菌种 斜面产孢 孢子悬浮液（≥106/ml ） 减压干燥
加入沙土管（ 0.3～0.5ml/管） 密封 4℃低温保藏
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
砂土管保藏法的特点
包藏初期，菌死亡率高，后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后 保存期间稳定性较好。 适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌 对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。
(二)通过寄主体进行复壮
对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒 等，由于长期使用，其毒力下降，导致杀虫效率降低及 衰退现象。 可以用菌种去感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上 重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复 和提高毒力。
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告
蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告学院：生物科学与工程学院专业：生物技术班级： 1班姓名：学号：摘要：蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。
当前，食品工业用酶主要来自微生物，尤其是蛋白酶的应用最为广泛。
作为一种生物催化剂,它具有催化反应速度快,无工业污染,催化反应条件适应性宽等的性质和优点。
由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[2] 。
微生物由于具有生长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点,因而备受人们青睐。
本文主要进行了菌种的生长曲线的绘制与菌种最佳发酵产酶时间等方面的研究。
关键字：蛋白酶生长曲线酶活力第一章前言1.1研究的目的与意义蛋白酶是工业酶中用得最多的一种酶，是催化蛋白质肽键水解的一类酶,它作用于蛋白质,将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸[1] ，约占酶总量的 60%，其中碱性蛋白酶就占25%。
有调查显示，酶制剂市场量最大的是洗涤剂用酶，第二位是淀粉加工用酶，以后依次为乳制品加工业、制酒工业、纺织工业和饮料加工业等用酶[2]。
与动、植物来源的蛋白酶相比，利用微生物产的蛋白酶有易于培养、生长快、产量高、易于提取，适于大规模工业化生产，培养基的成本相对较低等优点，使微生物成为生产蛋白酶的重要来源和首选材料。
1.2 国内外研究概况1.2.1 微生物蛋白酶的分类由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[3]。
当前工业用酶主要来源于微生物，微生物来源的蛋白酶按其作用的 pH 值的不同可分为三类，即碱性蛋白酶、中性蛋白酶及酸性蛋白酶，它们作用的最适 pH 值分别为碱性、中性及酸性。
1.2.2在食品工业中的应用蛋白酶在食品工业上的应用主要是用在制干酪，蛋白质水解调味液，烤焙食品，肉类嫩化，功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成等。
酶工程 第三章酶的发酵生产 第三节发酵工艺条件及控制
第三节 发酵工艺条件及控制
无机元素是通过添加无机盐来提供的，一般采用水溶 性的硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐等。有时也使用硝酸盐，在 提供无机氮的同时，提供无机元素。
4．生长因素 生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化 合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动 植物生长激素等。各种氨基酸是蛋白质和酶的组分；嘌呤 和嘧啶是核酸和某些辅酶的组分；维生素主要起辅酶作用； 动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分 裂起调节作用。有的细胞能够自己合成各种生长因素，而 有的细胞则缺少合成一种或多种生长因素的能力，需由外 界供给，才能正常生长繁殖，这样的细胞称为营养缺陷型。
第三节 发酵工艺条件及控制
在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆、酵 母膏等，以提供各种必需的生长因素。有时，也加进纯化 的生长因素，以供细胞生长繁殖之需。
现举例几种酶发酵培养基： （1）枯草杆菌BF7658α—淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氧化钙 0.2%，氯化铵0.15%。 （2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米 粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%，米糠1%，磷酸氢二钠0.4%， 磷酸二氢钾0.03%。 （3）黑曲霉糖化发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%， 麸皮1%（PH4.4—5.0）。
第三节 发酵工艺条件及控制
不同细胞生长繁殖的最适PH有所不同。一般细胞和放 线菌的生长最适PH为中性或微碱性（PH6.5—8.0）；霉菌 和酵母的生长最适PH为偏酸性（PH4.0—6.0）；植物细胞 生长的最适PH为5—6。
微生物发酵技术
• 缓慢氮源：延长产物合成期。
• 发酵培养基一般采用速效与缓慢氮源的混 合物，且中间还要补充。
• (1) 补加有机氮源 • (2) 补加无机氮源(补氮和调pH双重功效)。
• 三 磷酸盐的影响和控制 • 适合微生物生长的磷盐浓度偏高； • 适合微生物药物合成的磷盐浓度偏低。 • 发酵过程一般采用亚适量。
九 (2) 生长的pH较宽，而合成的pH较窄 ；
十 (3) 二者都敏感，但最适点相同；
十一 (4) 二者都敏感，但最适点不同。
• pH的控制方法：
• 1 培养基配比适当，使pH在合适的范围 内变化；
• 2 直接补加酸碱或补料；
• 其中采用补料的方法可以同时实现补 充营养、延长发酵周期、调节pH和改变 培养基性质等几种目的。
过调节培养基的营养基质浓度。
五
第五节 营养基质影响及其控制
一 碳源的影响及其控制 1 碳源的种类影响代谢情况 迅速利用的碳源：迅速参与代谢，合成菌体和产
生能量，并产生分解产物，因此有利于菌体生 长，但对产物(特别是次级代谢)有抑制作用(例 如葡萄糖)。 缓慢利用的碳源：可被菌体缓慢利用，有利于延 长代谢产物的合成(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖、 糊精、饴糖等)。
• (4) 一种理论研究方法。
(一) 可以控制抑制性底物的浓度
高密度的生物量需要投入几倍的基质， 但高浓度的基质有抑制作用。抑制原因 ：
(1) 有的基质浓度过浓使渗透压过高，细胞 因脱水而死亡；
(2) (2) 高浓度基质能使微生物热致死；
(3) (3) 对代谢关键酶或细胞组分产生抑制 作用；
• (4) 改变菌体的生化代谢而影响生长。 • 部分前体物有毒性，部分是由于溶解度
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产酶微生物的发酵与保藏
实验目的1、了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；
2、了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶
活力测定方法。
3、了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点；
4、学习几种常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏
方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥保藏方法。
实验原理将活化好的试验菌种制成菌悬液，转接到产蛋白酶发酵培养基，直接进行发酵，30-32 ℃震荡培养48 h，将发酵液过滤或离心，取
清液检测蛋白酶活力。
蛋白质或多肽在OD680nm波段处具有最大
吸收值，利用蛋白酶同酪蛋白底物反应前后在三氯乙酸中可溶物的紫
外吸收增殖，可表示蛋白酶活力高低。
微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其
不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代
谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三
个因素而设计的。
材料试剂实验一所得的菌种、液体酪素培养基、牛肉蛋白胨培养基、L-酪氨酸实验仪器紫外分光光度计、恒温水浴锅、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、冰箱、三角烧瓶、无菌试管、无菌吸管、无菌滴管、接种环
方法步骤1、液体牛肉膏蛋白胨培养基的配置：牛肉膏0.15g、NaCl0.25g、
蛋白胨0.5g，PH7.4-7.6，先用少量蒸馏水充分溶解，后补足蒸馏水至50ml，调整PH，灭菌备用。
固体牛肉膏蛋白胨培养基的配置：牛肉膏0.3g、NaCl0.5g、蛋白胨1.0g、琼脂15g，PH7.4-7.6，先用少量蒸馏水充分溶解，后补足蒸馏水至100ml，调整PH，灭菌备用。
液体酪素的配置：牛肉膏0.3g、NaCl 1.5g，酪素3g，水300mL，pH 7.6-8.0。
配制方法：称取酪素4g，先用少量2%NaOH 润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至1000mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。
2、菌种保藏：将菌种接种在牛肉膏蛋白胨的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。
3、种子液的制备：从菌种保藏处选取长势良好斜面，取两环至种子培养基，摇匀放在转速为180R的摇床培养16个小时。
4、产酶的微生物的发酵：分别吸取10ml的种子液至有100ml发酵液的1号、2号瓶中，将1号、2号放在转速180R的摇床上培养，种子液放在冰箱保存12小时后，吸取10ml的种子液至有100ml 发酵液的3号瓶中，3号瓶也放在转速为180R摇床发酵。
以上操作在超净台上完成。
5、生长监测：1号瓶从接种开始每隔2小时吸取5ml的发酵液至离心管放在冰箱保存，2号瓶发酵24小时后每隔2小时吸取5ml发酵液至离心管至冰箱保存，3号瓶发酵12小时后每隔2小时吸取5蜜
发酵液至离心管放在冰箱中保存。
6、标准曲线的制作：按配方配置好福林试剂、0.4mol/L的碳酸钠溶
液1000ml、0.3mol/L的三氯乙酸1000ml、0.5mol/L的氢氧化钠、
磷酸缓冲液500ml、10g/L的酪素溶液、100ug/ml的L-酪氨酸。
制作浓度为0、10……50ug/ml的酪氨酸标准液，将制作好的酪氨酸
标准液做紫外分光光度计测试，并做好记录。
7、产酶微生物生长曲线的制作：将上述保藏的发酵液取出3000rpm
离心10min，取沉淀。
每份沉淀加5ml的蒸馏水，震荡溶解。
进行
紫外分光光度计中用OD600检测，做好记录。
8.产酶微生物酶活力的测定：分别取出经离心好0、6、12、20、30
小时发酵液的上清液。
取1ml酶液于1、1’、1’’试管,，40 ℃预
热2min后加入1试管加入三氯乙酸2ml，1’、1’’试管加入酪素
1ml，40 ℃反应10 min后，1试管加酪素1ml，1’、1’’试管加
三氯乙酸2ml以终止反应，并静止10min沉淀残余底物，用漏斗加
滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定OD680nm的吸光值。
其中1
试管为对照试管，1’试管为实验试管，1’’试管为平行试管。
其它
的按以上方法进行操作。
数据处理生长曲线
OD600
培养时间对
照
0 2 4 6 8 10 12 14 16
光密度
值
OD600 0 0.08
6
0.09
1
0.09
9
0.11
5
0.13
8
0.10
9
0.1
83
0.38
4
0.76
2
培养时18 20 22 24 26 28 30 32 34
酪氨酸标准曲线 OD680
酪氨酸标准溶液浓度（ug/ml) 0 10 20 30 40 50
吸光度A
0.129
0.249
0.291
0.356
0.454
当吸光度A=1时，即y=1；x=113.765, 即K=113.765
间 光密度值
OD600 0.912
1.101
1.286
1.166
1.243
1.232
0.958
0.682
0.222
酶活力吸光度测定
其中2
平行组吸光度
实验组吸光度平均吸光度+=
对照组吸光度平均吸光度相对吸光度-= n 5/210/4⨯⨯⨯=⨯⨯⨯=K A n K A X 式中X ——样品的酶活力， A ——样品相对吸光度 K ——吸光常数
4——反应世纪的总体积，ml
培养时间
6
12
20
30
吸光度
平均吸光度 相对吸光度 吸光度 平均吸光度 相对吸光度 吸光度 平均吸光度 相对吸光度 吸光度 平均吸光度 相对吸光度 吸光度 平均吸光度 相对吸光度 对照组 0.216
0.020
0.252
0.034
0.312 0.078
0.686
0.217
0.798 0.117
实验组 0.238
0.236
0.287
0.286 0.393 0.390 0.907 0.903
0.897 0.915
平行组 0.234
0.285
0.387 0.899 0.933 酶活力 1 2
4
10
5
10——反应时间10min，以1min记
n——稀释倍数
所得结果表示值整数
实验结论1、芽孢杆菌生长经历了迟缓期、对数期、稳定期、衰落期；
2、芽孢杆菌在对数期末开始大量产酶，在稳定期产酶数量达到最大，
随着芽孢杆菌进入衰落期产酶减少。
3、产酶微生物在20小时左右产酶量最大，活性高。
误差分析1、芽孢生长还经历了迟缓期，且时间较长，可能是所配置的培养基过碱，倒置期不能正常的生长；
2、标准曲线的R=0.9706可能是水浴的温度过高，使其活性改变。