TEM操作步骤及注意事项

FEI TECNAI 20透射电镜

电镜操作面板...................................... - 2 - 使用步骤：.......................................... - 4 -

一.放置样品 ..................................... - 4 -

二.合轴 ............................................. - 4 -

三.拍形貌 ......................................... - 5 -

四.踩带轴 ......................................... - 6 -

五、拍衍射 ...................................... - 6 -

六、能谱分析 .................................. - 7 -

七、高分辨 ...................................... - 7 -

八、拔样品杆及关机 ...................... - 8 -

电镜操作面板

镜筒

注意事项

1. 使用电镜时，首先要观察电镜的状态。

2. 有黄色背景的按钮，要谨慎。

3. 观察一系列数值，包括：最佳电流值、Spot size 、样品各坐标是否都归零等。

使用步骤：

一.放置样品

1.放样品时，夹子不能碰到银环，放置后，用手振动玻璃管，使样品至中间状态，然后用螺丝帽压紧（不可过紧，固定住即可）

2.插入样品杆时，要使杆上小柱的位置对准左上角螺丝，插至凹槽完全进入，然后连上数据线。确认在双束（双倾台不是双束）下，点两下回车。打开抽真空示意图→Vacuum Overview ，开始抽真空。

3.两次抽真空完毕后，逆时针旋转小柱对准Close ，插入。抽真空共分成两段时间，第二个倒计时结束后，即红灯一灭，必须在20秒内将样品杆逆时旋入。旋入样品杆时，要一手拿着，一手托着，放置进入过快。然后点Tube on 。然后点Col Values Closed 。

检查

4．关灯，取下蒙皮。

5.点击→Search ，即可看到样品所在位置。开始找样品中心空洞。

二.合轴

1.在Spot size 为1，低倍（6200X 或8700X ）下找到薄区（朝着光亮处找）。然后调焦。选择最佳物镜电流值9

2.5854（按Eucentric focus ）。 2.放大倍数至86000X ，然后将光斑移至孔区域，开始合轴。观察光斑是否为圆形，非圆形时要进行调圆→condenser ，调圆后点→

None

3.即2.6合轴。在Tune菜单下进行操作。

（1）Spot size 2→Gun shift→光斑移至中间→Done

（Spot size大小用R3和L3进行加减。）

（2）Spot size6→Beam shift→光斑移至中间→Done

重复以上步骤，直至光斑在中间位置。

（3）然后将Spot size 降至1→光斑缩小并移至中心(确认光斑在顺时针放大逆时针缩小状态)→点击

Beam shift PPX→调动多功能钮至两个圆重合→Done

Beam shift PPY→调节多功能钮至两个圆重合→Done （4）移动样品杆，将样品边缘对准中间小黑点，然后抬起左侧的小镜子→Rotation Center→调节多功能钮至视野中样品上下跳动（不能左右晃动）→Done

三.拍形貌

1.找空洞

2．2、6合轴，散开光斑。

3.倍数在2250X—86000X下都可以进行拍摄。套上物镜光阑，先用最大的光阑找区域，然后换成小号。用物镜光阑套住感兴趣的区域。

4.然后将光斑散开，时刻注意右边的红绿条，要保证方框始终在绿色区域（其目的是为了保护相机）。

5.相机参数：Camera View 为0.5，Camera Acquire为1.0。按钮

R1进行抬屏，然后点Start view，加载相机，调焦，然后点Acquire，进行拍照。

6.拍完后点击stop view R1放下屏幕。在拍照期间禁止调节放大倍数。

四.踩带轴

1、2，6合轴，调焦。

2、86000X，找到薄区且带有特点易记的区域（踩带轴过程中样品会动，这样便于识别出自己感兴趣的区域）。

3、将光斑汇聚到一点。

4、按diffraction，寻找菊池线。菊池线汇聚的焦点一般为一正带轴，菊池线汇聚数目越多，晶带指数越低。再按diffraction，散开光斑。用左键盘左上角四个按钮调节样品位置，不断按diffraction查看带轴是否踩正。不断调节，直至踩正，踩正后的衍射斑点中心在屏幕小黑点处，并且周围斑点亮度应对称。

五、拍衍射

1.先调数值，Camera View为0.03，Camera Acquire为0.3.

2.踩正带轴，低指数。

3.加上选区光阑，亮斑套住要拍衍射区域。

4.调Spot size大于等于5，在底屏看不见，在抬起的小屏上可看

见。

5.点Start view加载相机→左手抬屏→Stop view→立即放下屏。

6.查看光强，Analysis→Statics→Mininum→min and max，观察最大值不超过50000，如过大应继续散开光斑或者继续调大spot size。

7.确认最大强度不超过50000时，即可进行拍照。

8.关闭选区光阑、关闭Diffication、降低Spot size到1（具体看下一步操作的要求）。

六、能谱分析

1.找感兴趣的点

2.把光斑缩小到一点，放大倍数86000倍，spotsize调到6以上。Cps值小于20000（先RTEM Control in才能看CPS值）。

3.点击电脑屏幕下方RTEM Contor→in→Acquire(左上方，区别于拍形貌及衍射时的acquire)。

4.能谱中最高峰到2000时，点击Acquire停止。

5.若换别的区域做EDS，直接移样品杆移动到相关区域。重复Acquire→最高峰到2000→Acquire。

若不再做EDS，点击out，降低spotsize到1，散开光斑。

七、高分辨

1、感兴趣的区域，踩正带轴吗，越正越好。

2、最佳物镜电流值。

3、用Z调焦（略欠焦）。

4、放大倍数在25万倍消象散（在44万倍以上拍高分辨像），采用一般的照相模式，相机常数0.5和1.0。

5.点击左下角MF X: image shift x（做完高分辨时记得调回Beam shift X）。

7.点击start view

8.点击Process→live→FFT

9.调焦距，用多功能钮将光斑移到样品边缘（不可用样品杆移动样品），一般样品边缘呈非晶态。调到欠焦时的一个圆环的样式。

10.点击Tune中的objective，用多功能钮将非晶环调圆，欠焦过程是中心白圆不断扩大，过焦状态时白圆缩小。

11.用高分辨图片与FFT图片确定好正焦后，按左键盘L2使Defoucs归0，我们一般的最佳欠焦值是-70。

12.消象散后将放大倍数调到44万倍，拍高分辨像。

八、拔样品杆及关机

1、将倍数调至6200×

2、将光斑散开

3、Search—Holder

4、Setup—Col Valued Closed（若有事临时外出可暂时保留在此状态）。

5、盖上蒙皮，开灯。

6.拔样品杆：取下数据线→往外轻拔样品杆（此时有一个微弱的吸力）

→露出凹槽（与进入时看见的相同）→顺时针旋转，将小柱转到底（大概左上角螺丝）→轻轻彻底拔出样品杆（控制好力度，应一下拔出但

又不至于力过大使样品杆拔出时甩飞样品）→（当天电镜不再

使用时才倒液氮烘烤，烘烤会持续4小时左右）倒液氮→点击→cryo →cryo cycle（烘烤电镜）等大约5分钟colum真空度掉到99变红可离开。

细胞培养的操作步骤

传代细胞培养的视频拍摄脚本一、实验准备器材液氮冷冻灌、恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、分析天平、倒置显微镜、超净工作台、弯头吸管（1个）、胶头滴管（9个）、离心管（9个）、带塞培养瓶（不定个）、试管架、量桶、烧杯、酒精灯、抽滤瓶、G6型号细菌过滤漏斗、带塞小玻璃瓶，大三角瓶、无菌冻存管、液氮瓶（一）、器皿 1玻璃器皿的清洗灭菌：种类：小玻璃瓶、弯头吸管、滴管（3个）、培养瓶、量桶、烧杯、抽滤瓶、大三角瓶，细菌过滤器接口管药品：5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml （1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。（镜头一：实验人员将器皿放进加有5％盐酸溶液的盆内，并以字幕和配音的形式显示浸泡或煮沸时间和浸泡目的）（2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干（镜头二：实验人员刷洗器皿，使用正规的清洗方法，并烘干，只示范其中2--3种即可，实验人员必须介绍操作示范烘干箱的使用方法和相关数据的设置方法）（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作

用，操作过程需戴防护用具。（镜头三：带好橡胶手套将清洁液加入到盆中，让后进行酸浸，并以字幕的形式显示浸泡时间）（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。（镜头四：自来水冲洗，蒸馏水清洗，烘干一起完成，在这个过程中可在装器皿的盘中放入一定量的玻璃器皿，只对其中一种进行自来水冲洗、蒸馏水清洗，洗好后就将所有仪器放入烘干箱中烘干，并在每一个步骤中以字幕或语音的形式显示相关操作次数和时间）（5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。（镜头五：实验人员对实验器皿中的1—2种进行包装示范，然后将其他包装过的器皿一起放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌）（实验人员必须示范操作高压灭菌锅和恒温干燥箱的用法，示范操作步骤，只示范一次即可，在下面的不同灭菌温度和不同灭菌时间可以字幕的形式显示）2、橡胶制品清洗消毒种类：玻璃瓶橡胶塞、培养瓶瓶塞、皮管、滴管头新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤（一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。（二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。

细胞培养操作步骤

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMS018ml+胎牛血清2ml。依次比例酌量配置。超净工作台常规配置移液器1套（2.5小20 d、200 pl> 1ml）,酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个，常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,枪头（1ml、200小 10 d）,培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO,胰酶，苯扎溴氨，75% 酒精…… 实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。实验步骤一、原代细胞的培养 1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。 2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3. 取1 个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6?将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。、培养液的更换

细胞培养基本操作

细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。一、实验前准备实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。消毒双手和超净台。取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。二、制备细胞悬液吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。离心：1000rpm，室温离心3min。注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。三、细胞培养离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。四、注意事项 1、解冻速度要快在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。 2、一次复苏细胞不宜过多细胞在解冻时，需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。并且一次复苏细胞过多，容易忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 3、培养瓶上注明细胞类型，日期，人名。

细胞培养的流程

细胞培养的流程，从购买试剂、分装，到无菌操作、实验、观察的过程？对于新手来说，细胞培养真是太难了，很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到，因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌，试剂的购买、配制、分装，细胞的分离，无菌操作，培养细胞的观察，实验的设计，及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高，要求非常严格。如果你正在培养细胞，或曾经培养过细胞，你一定有很多的经验值得大家分享，你一定有你自己的一套培养细胞的流程，从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此，你不妨说说你的细胞培养流程，以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。于此，我先代表广大细胞培养新手谢谢各位园丁里的奉献者！有空整理一下再写写。。呵呵谢了先版主建议不错，我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了，解决困难耗费了大量地时间，可惜呀！养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程，作起来不易，要真正详细的写出来示人更难！书上的规范和标准很多，但作起来每人都有自己的方法，适宜就好。我看还没有人跟帖，我就先说一点，从最初阶段开始：（自己的做法）（一）仪器的清洗总的分为两大类：可泡酸的和不可泡酸消毒的。酸指消毒的清洁液（由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液）可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子，离心管等塑料器皿。消毒过程：自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜（不少于6h）----→自来水冲洗15－20遍----→蒸馏水洗3-5遍，烘干备用。不可泡酸的主要是胶塞和盖子，虑器等，先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜，自来水冲洗，5%HCl濅泡三○min，流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。消毒好的器具一定找个干净的柜子保存，使用前高压消毒灭菌，我科室主要使用铝制饭盒分装器具，挺方便的，用前高压。今天暂说一点，以后有机会再续，望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道，现在知道为什么没有别的战士跟贴了么？我怎么也耗了几十分钟打的字，你就这样打击别人的信心，还有可能往后面延续么！再说，经验何止这些这点...... 您的帖子我看见了，您的抱怨我也接受！并且跟您补上一分！每个斑竹给分的标准有一定的差别，但是可以肯定的是：我们有自己的加分原则，大原则是不变的！比如：版内讨论得很多的东西，重复发帖一般不予以加分！您的这个帖子属于改范畴！感谢您对细胞版的支持！如果有问题可以直接pm我们！再次感谢！再多说点啊！呵呵接着说呀，很好，很有帮助，我是新手，要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。 1、首先说清洗：对于玻璃器皿（如移液管、盖玻片之类）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍，除去残留酸液，再用双蒸水冲洗3-5遍，彻底洗净后放入不锈钢筒中，双层牛皮纸扎口，高压灭菌20min，烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液（重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL）配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗3-5遍，再用双蒸水漂洗3次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、

细胞培养标准流程

细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO 放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞 2 脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培）（细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。

2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后）细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。以6 孔板为例，转染前细胞先换液，加4ml全培。取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL，混匀（转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。 (转染试剂需加在培养液中部，切忌勿贴壁;静置时间不可超过20 min）无血清无双抗DMEM量＝全培体积的10％。如6孔板加4mL培养液培养，即转染体系为400ul无血清无双抗DMEM。缓慢均匀加到培养液后，轻轻晃动圆盘，使其均匀分布。转染后6h后细胞换液，排除试剂的毒性影响。 24～48 h 后收集细胞用于后续实验。 Note：如果用这种方法转染效率一直不佳，可以在接种细胞前，把转染试剂配好，把转染试剂加到培养盘上，再把细胞接种上。该方法不适用所有细胞，这种方法会导致细胞死亡，不贴壁。 HiPerFect转染试剂转染（用于siRNA的转染，说明书附后） For transfection of eukaryotic cells with siRNA and miRNA 以6 孔板为例，转染之前，以2mL全培接种1.5-6×105细胞于6孔板每孔。将细胞放置在培养箱中培养，直至转染。（前50%---染90%）取1.5 ml 离心管，加入100 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入 siRNA(20uM浓度，相当于0.25ug/μL)5uL,转染试剂12μL，轻轻混匀，室温静置5-10 min。 siRNA：转染试剂：无血清无双抗DMEM 5uL：12ul：100ul。（比例待定）

细胞培养标准流程

精品文档细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞2 脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10?S的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培）（细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 . 精品文档 2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后）细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。

细胞传代标准操作规程版

细胞传代培养SOP（消化法）具体步骤如下： 1. 传代前准备： 1.1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴锅内预热。 1.2 用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 1.3 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.4 点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 1.5 准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8 分钟再次消毒。 1.6 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 1.7 从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 1.8 打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶-EDTA消化： 2.1加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶-EDTA液）,注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37T < 2.2 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 2.3 吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞： 3.1 吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 3.2吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.3 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8 分钟。 3.4弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞： 4.1 分装：将细胞悬液吸出分装至2-3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 4.1 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5X 105/ml。最后要做好标记。 5. 继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO培养箱中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时

细胞培养的操作步骤

细胞培养的操作步骤一、原代培养及其操作步骤原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。 1.剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。 2.消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。 3.培养细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为（2～5）×105 cells／ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。一般3～5d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3d后换液，一般7～14d可以长满瓶壁，进行传代。 4.注意事项（1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。（2）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。（3）小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。（4）胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间过长(即使是-20℃低温保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。

细胞实验的基本操作

细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。具体操作如下： 1、实验前准备： 1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。 1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 2、取出冻存管及迅速解冻： 2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。 3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟； 4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；

5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。 6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。 1、贴壁细胞的传代具体操作如下： 1.1、传代前准备： 1.1.1、预热培养用液：把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 1.1.2、用75％酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台 1.1.3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.1.4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。实验步骤： 1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。实验材料

细胞培养的一般过程

细胞培养的一般过程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。培养细胞的细胞生物学一、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。且不论其有许多性状仍与体内相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启引起的现象，这并非是绝对缺陷。恰恰相反，

细胞培养的过程及注意事项

细胞的培养过程及注意事项根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。一、原代培养（一）过程原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。 1、组织块培养法 (1)基本操作过程 1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS 或Hanks液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。 2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上； 3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞； 4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置； 5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。 2、注意事项 1）、组织块接种后的前3天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。 2）、加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。 3）、用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。

HepG2细胞培养方法

HepG2细胞培养方法细胞复苏：材料：HepG2细胞、RPMI-1640、胎牛血清、PS（青霉素+链霉素） 35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜试剂配制： 100ml完全培养基：90mlRPMI-1640 + 10ml胎牛血清+1支PS，4℃保存步骤： 1．罗口离心管加入含10%胎牛血清的完全培养基3ml.。 2．从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置37℃水浴1min至融化。 3．打开冻存管，吸取细胞悬液至离心管，轻轻混匀。 4．800rpm离心5min,弃上清。 5．细胞沉淀中加入4ml完全培养基，转入35cm培养瓶37℃常规培养，第二天观察细胞生长情况。细胞传代与换液：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、 35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜试剂配制： 100ml终止液：90mlRPMI-1640 + 10ml小牛血清+1支PS，4℃保存步骤： 1．对数增长期汇合度80%-90%的细胞可以传代，4ml PBS清洗两次。 2．加入0.25%胰酶1ml,37℃孵育5min。 3．加入3ml终止液，吹打细胞使其脱落并单个化，再移至罗口离心管。 4．离心5min,800rpm，弃上清。 5．罗口离心管加入完全培养基，混匀后分瓶培养。 6．细胞隔日可以用PBS清洗后更换培养基。细胞冻存：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、消毒的冻存管、水浴箱、计时器、离心机、过滤器、光学显微镜试剂的配制： 10ml冻存液：7ml完全培养基+2ml胎牛血清+1ml DMSO,混匀后过滤，4℃保存步骤： 1．去除培养瓶中旧的培养基，加入4ml PBS清洗两次。 2．混匀胰酶，每瓶加入1ml,37℃孵育5min。 3．每瓶加入3ml终止液，反复抽打细胞使其脱落并单个化，移至罗口离心管。 4．800rpm离心5min,弃上清。 5．每管加入1ml冻存液，混匀细胞，移至冻存管中。将细胞冻存管放于-20℃保存2hrs。6．细胞冻存管-80℃过夜。

细胞培养试剂及操作流程

实验规范化流程一、细胞培养所需 1、10%FBS 1640培养液。 2、10%FBS DMEF/12培养液。 3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。 4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于2L 去离子水中，高压后4℃保存。 5、胰酶 6、冻存液：10%DMSO 、>10%FBS ，其余成分为1640 7、真核抗生素： G418: 50mg/ml MDA-MB-231 800ug/ml MCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/ml T47D 400ug/ml) 嘌呤霉素（Puromycin ）:10mg/mL 、 MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/ml MDA-MB-231 5ug/ml 潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/ml MDA-MB-231 800ug/ml MCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液）环丙沙星左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml ，使用浓度5ug/ml ） 9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml ） 10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM ）一、细胞培养相关技术 1、细胞复苏准备：37℃水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程：（1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。（2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml 离心管内。（3）将离心管以1000rpm 转速离心5min 。（4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml ，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。 2、细胞传代

细胞培养操作流程

细胞传代培养操作流程细胞复苏： 1. 将新鲜培养基置于37℃水浴锅中回温，回温后喷以75%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。如配置：50mL完全培养基(含10%FBS，1%青链霉素双抗) 44.5mL基础培养基+ 5mL FBS + 0.5mL青链霉素双抗。 2. 戴防护手套后，自液氮罐中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，立即放入37℃水槽中快速解冻（避免冰晶重新结晶而造成细胞死亡），轻摇冷冻管使其在2分钟内全部融化，以75%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。 3. 将解冻的1mL细胞悬液缓缓加入细胞培养瓶内，再向瓶中加入10mL完全培养基(稀释比例为1:10)，混合均匀，放入37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养。取0.1ml解冻细胞悬液作存活测试。(Sf9细胞在27℃生长，可不需CO2) 4. 一般而言，细胞大都不需立即去除冷冻保护剂(例如DMSO)。若要立即去除，则将解冻的细胞悬液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1300rpm，5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。传代培养： 1.37℃恒温培养约48小时，待细胞长满80-90%后，从培养箱取出75cm2培养瓶，倒掉培养基。加入5mLPBS缓冲液吹打以洗去残留血清，倒掉缓冲液。 2.沿壁（无细胞的一面）缓缓加入1mL胰酶溶液消化细胞约1min，轻轻摇晃，倒掉残余胰酶，将培养瓶置于恒温箱中约1min，拿出培养瓶轻轻拍打一下细胞贴壁的一面。注意：最佳消化温度是37℃，加液后用移液管反复吹打分散细胞。 3.向瓶中加入5mL完全培养基，反复吹打均匀2min，从中取出20μl至0.5ml 小离心管中，向管中加入80μl台盼蓝溶液，混匀，从混合液中取出10μl至盖好盖玻片的计数板上，计算细胞密度及活率。 4.将5mL细胞悬液全部吸出，分别接种1mL悬液到原培养瓶和另一新的培养瓶中，其余舍弃。再向两瓶中各加入10mL完全培养基，置于CO2培养箱培养。（细胞传代时按1：5或更大比例稀释）

平滑肌细胞培养实验步骤解读

原代平滑肌细胞培养Protocol 实验准备：器材：注射器（10mL），玻璃吸管，胶头（用于细脚吸管，吹匀组织块用），枪头（蓝色、黄色），移液器（1000μL，100μL），电动移液器，玻璃培养皿（2-3个），小烧杯（10 mL或5 mL），青霉素瓶（配鼠尾胶原），剪刀（大，小，弯）多把，镊子（大，小，弯）多把，纱布，六孔板（真空包装），托盘（放老鼠），酒精棉球，乳胶手套试剂：平滑肌细胞专用培养基，生理盐水，D-hank’s 液，鼠尾胶原，戊巴比妥钠（麻醉用），75%酒精步骤： 1. 高压灭菌实验所需器材，超净台紫外照射30mins，吹风； 2. 配制鼠尾胶原应用液，一般1:15-1:19稀释，六孔板中每孔加入1mL稀释液待用（可省去）； 3. 大鼠（200g左右，一百五六十克较好）腹腔注射一定体积戊巴比妥钠（0.5mL/100g）麻醉，麻醉好后将大鼠全身（尤其是胸腹部）用酒精棉球擦拭干净，放入托盘置于超净台中紫外照射15mins左右，开始试验； 4. 用已消毒的剪刀将大鼠腹部表皮剪开，充分暴露出整个胸部，再换用干净的剪刀打开胸腔。将肝脏及肺脏等组织拨开（小心操作以避免伤到血管）。用小弯镊及小直镊分离胸主动脉外壁贴附的结缔组织及外膜等。分离干净后，用眼科剪小心剪断血管，去除血管中的血，置于干净玻璃培养皿中； 5. 用生理盐水多次冲洗分离出来的血管。冲洗干净后，将血管剪开，小心刮除血管内膜，去掉内皮细胞； 6. 将处理好的血管放入平滑肌细胞专用培养基（约200μL）中，用眼科剪将组织尽量剪碎成1mm3大小的小块，用细脚吸管吹匀后，均匀种入加了鼠尾胶原的六孔板中； 7. 用黄枪头小心吸弃多余的液体（避免将组织块吸起来），然后将六孔板盖好颠倒放在培养箱中约2h（待组织块粘牢培养板底）后，再加入培养基； 8. 过3-4d后拿出细胞在显微镜下观察，看其是否已长出。

细胞培养的过程及注意事项

36细胞培养的过程及注意事项细胞的培养过程及注意事项；根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种；1、组织块培养法；(1)基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪；2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞的培养过程及注意事项根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。一、原代培养（一）过程原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。原代培养的方法很多，基本和最常见的是组织块培养法和分离细胞法。 1、组织块培养法

(1)基本操作过程 1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks 液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。 2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上； 3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞； 4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置； 5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。 2、注意事项 1）、组织块接种后的前3天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引