细胞培养的操作流程

实验题目：细胞传代

实验材料：细胞培养箱，安全柜，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml，10ml），50mL离心管，培养瓶（25cm2），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅，

记号笔，冰箱

实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种

实验的必经过程。

实验步骤：以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤

一．实验前准备工作：

进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒；

检查酒精灯有无95%酒精，电枪有无电；

将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验前安全柜开紫外照15~20min；

将细胞培养液放于37℃水浴中预热；

抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋。

二．.准备实验：

先关闭紫外等30min后再进行实验；

75%酒精喷于纸上，将超净工作台仔细擦试干净；

点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出。

1．吸除旧的DMEM培养液：

拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。注意：一定要吸除干净，否则消化时间过长，细胞损伤过大。

2．消化：

拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶加入培养瓶中，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。

取下用后的移液管。

3．中和：

从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mL

DMEM培养液终止消化。

反复吹打混匀；吸出中和液转移到50mL离心管中。

4．离心收集细胞：

配平后离心200×g，3min。将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm2）。

5．重悬细胞：

离心后吸出中和液，（先吸出表面泡沫，一定注意不要吸出细胞）。加入新DMEM培养液（按2mL／瓶和细胞传代数计算加入的培养液体积），用电枪反复吹打使细胞充分混匀，要尽量减少产生气泡。

6.分装：

混匀后将细胞分装，按2mL/瓶得体积加入培养瓶中，充分混匀。记号笔标记细胞名称，培养液，细胞传代数，传代日期，实验人员。

7．培养：

将细胞放于37℃,4% CO2细胞培养箱培养。将0.25%胰酶，细胞培养液密封好放于4℃冰箱中保存。

8．清洁安全柜

实验完毕后，盖灭酒精灯，关闭真空泵，用酒精棉球擦干净操作台表面。

9．观察：

每天观察细胞，并记录细胞生长状态。

实验注意事项：

1．紫外消毒过程中会产生臭氧分子，对人体有害。一般情况下，消毒后至少半小时后再进入。

2．所有的实验器材都要经过消毒处理；所有的细胞操作都在安全柜中进行，每一步都要注意不能用手碰到瓶口，培养液不能碰到瓶口，拿培养瓶时要使培养瓶的瓶口微微翘起。3．细胞消化时间不能太长，要让细胞尽快脱离不舒服的环境；离心时离心机转速不能太高，实验前要设定好离心转速和时间；重悬细胞时要保证细胞完全混匀，在显微镜下观察细胞是一个一个的。

4．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

5．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

实验题目：细胞复苏

实验原理：细胞复苏的原则－快速融化：

必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅

速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

实验材料：水浴锅，安全柜，冻存细胞，细胞冻存管，培养瓶，移液枪，移液管（5ml，10ml），DMEM细胞培养液，细胞培养箱

实验操作:

一. 实验前准备：

1.将水浴锅预热至37℃

2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶。

二．取出冻存管：

1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞.

三．迅速解冻：

1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。同时配培养液：向50mL离心管内加入9mlDMEM细胞培养液+1mL血清+100uL抗生素。

2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。向离心管中加入4mL培养液，充分混匀。

四.平衡离心配平后，放入离心机中200×g，离心3min

五.制备细胞悬液：

1. 吸弃上清液（先吸出气泡）。

2．将剩余的6mL细胞培养液加入到离心后的细胞中，使细胞重悬，充分混匀。

六.细胞计数：细胞浓度以5×105/ml为宜。

七.培养细胞

将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，培养瓶标明细胞名称，培养液，实验人员，实验时间；将培养瓶放入37℃和4％CO2的培养箱内培养。24-48h后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。

实验注意事项：

1.一定要提前打开水浴锅，预热到37℃。

2.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

3.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

4.依据冻存细胞相应的培养基种类、血清种类和其它指定的成份和比例，制备培养基。绝大多数的细胞均无法立即适应不同的基础培养基或不同的血清种类，若因实验需要，必须有所不同时，务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，确定细胞适应后，进行所需之实验。

5. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定的血清种类培养。