工作细胞库(WCB)制备
动物细胞工程制药
有该细胞系的历史资料 有该细胞特性的资料，要求100代以上传代稳定 无细菌、真菌、支原体和各种病毒
动物细胞产品质量要求——工程细胞
3.5.4 动物细胞产品质量要求——纯化工艺
生产厂房条件必须符合国家GMP规定 细胞培养尽量少用或不用小牛血清，要使用无热原水和无离子超净水 操作环境、柱体、洗脱液等的温度尽可能保持4度左右 所有器材、载体都需经无菌、无热源处理 应记录产品纯度、提纯倍数和回收率
3.5 动物细胞产品的纯化方法和质量要求
3.5.1 动物细胞产品纯化
工程细胞表达的产品与其它复杂成分混在一起，分离纯化难度大； 由于产品要用于人，对产品纯度要求高； 产物产量低，生物活性不稳定，增加纯化工艺的难度和复杂性； 细胞产品多样性，必须根据每一产品特点，研发专用的分离纯化技术。
3.5.2 常用纯化方法
生产用细胞库（MWCB）或称工作细胞库（WCB）
3.2 动物细胞培养的基本方法
细胞分离：离心分离和消化分离 细胞计数：自动细胞计数器计数、血球计数版计数、结晶紫染色细胞核计数法、MTT染色计数法。 细胞传代：悬浮细胞传代、贴壁细胞传代 细胞冻纯：采用液氮低温冻存法 细胞复苏：要求快融。
3.3 动物细胞大量培养的方法和操作方式
杂质检测：1）宿主细胞残余蛋白小于1/1000；2）残余DNA量小于100pg；3）血清残余小于100ppm；4）其他物质；5）细菌、病毒和支原体检测阴性；6）热源检测。 稳定性 临床前安全性和有效性评价 临床实验的安全性和有效性评价
3.6 动物细胞制药前景与展望
采用更强的启动子和增强子 更好的利用扩增系统或寻找高表达位点 采用或改造更好的宿主细胞
生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程
细胞培养操作要求（新增）
细胞来源的供体 原材料的选择 细胞培养的体系 细胞收获及传代 • 体外培养细胞龄的计算 二倍体细胞龄以细胞群体倍增水平计算，也可以每个培养容器细胞群体细 胞数为基础，每增加一倍作为一世代粗略估算，即1瓶细胞传2瓶(1:2分 种率)，再长满瓶为1世代；1瓶传4瓶(1:4分钟率)为2世代；1瓶传8瓶 (1:8分种率)则为3世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前2/3内。 连续传代细胞系的细胞龄可以群体倍增水平计算，也可以按照固定的传代 比率进行传代，每传一次为一代。（传代细胞系则以一定稀释倍数进行 传代） 细胞系的建立 细胞冻存 人员
一、对生产用细胞基质总的要求
• • • • • • • （一）细胞系/株历史资料 （二）细胞培养操作要求 （三）细胞库 1、细胞库的建立 2、细胞库的管理 （四）细胞检定 （五）生产细胞培养
（三）细胞库
• 1、细胞库的建立 三细胞库管理包括细胞种子、主细胞库（MCB）及工作 细胞库（WCB）。在某种情况下，也可采用细胞种子及 MCB二级管理，但须得到国务院药品监督管理部门的批准。 • 2、细胞库的管理 • 非生产用细胞应与生产用细胞严格分开存放。 • 冻存前的细胞活力应不低于90%，冻存后应取一定量的可 代表冻存全过程的冻存管复苏细胞，复苏后细胞的活力应 不低于80%。
（四）细胞检定
• 细胞检定主要包括以下几个方面：细胞鉴别、细菌、真菌 检查、分支杆菌检查、支原体检查、外源因子和内源因子 的检查、成瘤性/致瘤性检查等。必要时还须进行细胞生长 特性、细胞染色体检查、细胞均一性及稳定性检查。 • 细胞库建立后应至少对MCB细胞及生产终末细胞（EOPC） 进行一次全面检定。
细胞库管理
2010版 细胞库为三级管理，即原始细胞库、主细胞库及 工作细胞库。如为引进的细胞，可采用 主细胞 库和工作细胞库组成的二级细胞库管理。在某些 特殊情况下，也可使用MCB一级库，但须得到 国务院药品监督管理部门的批准。
ICH生物技术生物药品的质量要求
精品课件
1
基因工程药物的质量控制
基因工程产品的质量控制与传统生产方法所 得产品有本质的差别。可能会含有用传统生产 方法不可能存在的有害杂质。例如在细菌中表 达的产品可能有内毒素、致敏原，在动物细胞 中表达的产品可能有ＤＮＡ杂质和病毒。
精品课件
2
基因工程产品审评的要点
(1)化学物理鉴定的一致性 (2)污染物限度控制的重要性（热原、病毒、宿主细胞DNA） (3)全过程控制质量的必要性 (4)效价测定的重要性 (5)标准化的趋势
以上所规定的测试次数适用于产品在批准前的稳定性试验，如在该产
品批准后，提供的数据说明产品仍是相当稳定的，则可减少稳定性试验
次数。
精品课件
19
细胞基质的来源和鉴定（Q5D）
“细胞基质”是指微生物细胞或来自于人或动物的细胞系。 动物来源的细胞系是指所有后生动物，包括体外无限生长的传代
细胞系以及体外有限代次的二倍体细胞。 微生物的来源包括细菌、真菌、酵母和其他单细胞生物。
由于用的模型病毒不会与实际污染病毒相同，因此要根据 生产品种和知识加以判断。
研究的模型病毒要有针对性
病毒污染可来自起始材料，亦可能来自工艺过程。
精品课件
11
去除或灭活病毒安全性指南 (Q5A)
评价灭活或去除病毒的能力，应考虑
滴度降低
灭活的速度，灭活曲线形状
方法耐用性，即条件改变后的适用性
对不同种类病毒的可选择性
18
生物技术/生物制品稳定性试验（Q5C）
6. 生物技术产品及生物制品的货架寿命一般在半年到5年之间。
如预定货架寿命在1年或1年以内，真实时间稳定性研究应为前3个月 每月进行一次，以后每3个月一次。
如预定货架寿命在1年以上，稳定性试验应在贮藏期的第一年每3个 月进行一次；第二年每6个月进行一次，以后每年进行一次。
用于生物技术产品及生物制品生产的细胞基质的来源和鉴定
Q5d人用药品注册技术要求国际协调会ICH三方协调指导原则ICH指导委员会在1997年7月16日ICH进程第四阶段推荐采纳该指导原则由相应的ICH专家小组制定，按照ICH进程，已递交管理部门讨论。
在ICH进程第四阶段，最终草案被推荐给欧盟、日本和美国的管理机构采纳。
用于生物技术产品及生物制品生产的细胞基质的来源和鉴定目录1.前言 (158)1.1 目的 (158)1.2 基本原理 (158)1.3 范围 (158)2.指导原则 (159)2.1 细胞基质的来源、历史和产生 (159)2.1.1前言 (159)2.1.2细胞的起源、来源和历史 (160)2.1.3细胞基质的产生 (161)2.2 细胞库 (161)2.2.1 细胞库系统 (162)2.2.2 细胞建库的步骤 (163)2.3 细胞库鉴定和检测的一般原则 (164)2.3.1 鉴别试验 (165)2.3.1.1 后生动物细胞 (165)2.3.1.2 微生物细胞 (166)2.3.2 纯度的检测 (166)2.3.2.1 后生动物细胞 (166)2.3.2.2 微生物细胞 (167)2.3.3 细胞基质的稳定性 (168)2.3.4 细胞核学和致瘤性试验 (169)3.术语 (170)附件：原代细胞基质 (171)用于生物技术产品及生物制品生产的细胞基质的来源和鉴定1. 前言1.1 目的本指导原则的目的是对用于生产生物技术产品及生物制品的人和动物细胞系、微生物细胞系及其细胞库的制备和鉴定建立合适的标准提供指导意见。
本文件还为申请产品上市时在这些方面应申报哪些资料提出了建议。
1.2基本原理历史上，由于细胞源性的生物制品存在外来污染或出于对用于制备产品的细胞特性的担忧，引发了一些对产品质量的关切。
重组DNA (rDNA)制品的质量也与细胞基质中构建的表达载体有关。
由此，业界达成共识，认为细胞基质的特性以及与之相关的事件将影响产品的质量和安全性。
生物技术制药复习知识点
生物技术制药复习知识点第一章绪论1.生物制药的研究内容包括基因工程制药, 细胞工程制药, 酶工程制药和发酵工程制药。
2.生物技术制药, 是采用现代生物技术人为地创造一些条件, 借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
3.生物技术药物, 是采用DNA 重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、治疗性抗体或核酸类药物。
4.生物药物, 指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分, 甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品。
5.现代生物药物四种类型: ①应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂。
②基因药物, 如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。
③来自动植物和微生物的天然生物药物。
④合成与部分合成的生物药物。
6.生物药物按功能用途分为三类: 治疗药物, 预防药物和诊断药物。
7.生物技术药物的特性：分子结构复杂, 具种属特异性, 治疗针对性强、疗效高, 稳定性差, 基因稳定性, 免疫原性、重复给药会产生抗体, 体内半衰期短, 受体效应, 多效性和网络效应, 质量控制的特殊性, 生产系统的复杂性。
8.生物技术制药特征：高技术, 高投入, 长周期, 高风险, 高收益。
9.基因诊断: 指采用分子生物学的方法在DNA水平或RNA水平对基因的结构和功能进行分析从而对特定的疾病进行诊断。
第二章基因工程制药1.利用基因工程技术生产药品的优点: （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等）, 为临床使用提供有效的保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质, 以便对其生理、生化和结构进行深入的研究, 从而扩大这些物质的应用范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处, 可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物, 扩大药物筛选来源。
细胞库建立标准
细胞库建立概况一、对细胞库细胞基质总的要求(一)细胞系／株历史资料1．细胞系／株来源资料应具有细胞系／株来源的相关资料，如细胞系／株制备机构的名称，细胞系／株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。
这些资料最好从细胞来源实验室获得，也可引用正式发表文献。
人源细胞系／株须具有细胞系／株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及生理状况的相关资料。
动物来源的细胞系／株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、病原体检测结果及供体的一般生理状况的相关资料。
2．细胞系／株培养历史的资料应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系／株过程的相关资料，包括所使用的物理、化学或生物学手段，是否有外源添加序列，以及细胞生长特征、生长液成分、选择细胞所进行的任何遗传操作或选择方法等。
同时还应具有细胞鉴别、检定、内源及外源因子检测结果的相关资料。
应提供细胞培养液的详细成分。
如使用人或动物源成分，如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其他生物学活性的物质，应具有这些成分的来源、制备方法、质量控制、检测结果和质量保证的相关资料。
(二)细胞库的建立细胞库的建立可为生物制品的生产提供已标定好的、细胞质量相同的及能持续稳定传代的细胞种子。
1．原材料的选择建立细胞库的各种类型细胞的供体均应符合细胞库细胞的检定中相关规定。
神经系统来源的细胞不得用于生物制品生产。
培养细胞用牛血清应来源于无牛脑海绵体脑病流行地区的健康牛群，其质量标准应符合规定(附录XIII D)。
不得使用人血清作为细胞培养液。
如需使用人血白蛋白，则须使用有批准文号的合格制品。
消化细胞用胰蛋白酶应进行检测，证明其无细菌、真菌、支原体或病毒污染。
特别应检测胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒，如细小病毒等。
用于生物制品生产的培养物中不得使用青霉素或β- 内酰胺(β-Lactam)类抗生素。
2．细胞培养操作的要求细胞培养生产人员应定期检查身体。
在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作；在同一工作日进行细胞操作前，不得操作或接触有感染性的微生物或动物。
来源于人或动物细胞系的生物技术产品的病毒安全性评价
1.主细胞库…………………………………………(107) 2.工作细胞库………………………………………(107) 3. 达到体外细胞传代限次细胞…………………(108) B 对病毒检测和鉴别方法的建议……………………(108) 1.逆转录病毒测试…………………………………(109) 2.体外检测…………………………………………(109) 3.体内检测…………………………………………(109) 4.抗体产生试验……………………………………(109) C 细胞系的可接受性…………………………………(110) Ⅳ.未加工品的病毒测试…………………………………(110) Ⅴ.对纯品进行病毒清除研究和病毒检测的 基本原理和操作方案……………………………………(111) Ⅵ.病毒清除程序的评价和鉴定…………………………(113) A 评价和鉴定病毒清除率用的病毒选择………………(114) 1.“相关”病毒和“模型”病毒………………………(115)
F 病毒清除的再评价………………………………………(122)
Ⅶ.小结……………………………………………………(123)
Ⅷ.术语………………………………………………………(123)
表1 不同级别细胞进行的病毒测试方法…………………(125)
表2 用于病毒检测的测定方法的应用
与局限性举例…………………………………………
中对病毒的清除或灭活作用进行评估，才可能得到确实的保证。
生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程
生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程本规程适用于人用生物制品生产/检定用动物细胞基质，包括具有细胞库体系的细胞及原代细胞。
细胞基质系指可用于生物制品生产/检定的所有动物或人源的连续传代细胞系、二倍体细胞株及原代细胞。
生产非重组制品所用的细胞基质，系指来源于未经修饰的用于制备其主细胞库的细胞系/株和原代细胞。
生产重组制品的细胞基质，系指含所需序列的、从单个前体细胞克隆的转染细胞。
生产的细胞基质，系指通过亲本骨髓瘤细胞系与另一亲本细胞融合的杂交瘤细胞系。
一、对生产用细胞库细胞基质总的要求用于生物制品生产的细胞系/株均须通过全面检定，须具有如下相应资料，并经国务院药品监督管理部门批准。
（一）细胞系/株历史资料的要求1.细胞系/株来源资料应具有细胞系/株来源的相关资料，如细胞系/株制备机构的名称，细胞系/株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。
这些资料最好从细胞来源实验室获得，也可引用正式发表文献。
人源细胞系/株须具有细胞系/株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及生理状况的相关资料。
动物来源的细胞系/株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、病原体检测结果及供体的一般生理状况的相关资料。
如采用已建株的细胞系/株，应从具有一定资质的细胞保藏中心获取细胞，且应提供该细胞在保藏中心的详细传代过程，包括培养过程中所使用的原材料的相关信息，具有细胞来源的证明资料。
2．细胞系/株培养历史的资料应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系/株过程的相关资料，包括所使用的物理、化学或生物学手段，是否有外源添加序列，以及细胞生长特征、生长液成分、选择细胞所进行的任何遗传操作或选择方法等。
同时还应具有细胞鉴别、检定、内源及外源因子检查结果的相关资料。
应提供细胞培养液的详细成分，如使用人或动物源成分，如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其他生物学活性的物质，应具有这些成分的来源、制备方法及质量控制、检测结果和质量保证的相关资料。
细胞库建立标准
细胞库建立概况一、对细胞库细胞基质总的要求(一)细胞系／株历史资料1.细胞系／株来源资料应具有细胞系／株来源的相关资料,如细胞系／株制备机构的名称,细胞系／株来源的种属、年龄、性别与健康状况的资料。
这些资料最好从细胞来源实验室获得,也可引用正式发表文献。
人源细胞系／株须具有细胞系／株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及生理状况的相关资料。
动物来源的细胞系／株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、病原体检测结果及供体的一般生理状况的相关资料。
2.细胞系／株培养历史的资料应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系／株过程的相关资料,包括所使用的物理、化学或生物学手段,就是否有外源添加序列,以及细胞生长特征、生长液成分、选择细胞所进行的任何遗传操作或选择方法等。
同时还应具有细胞鉴别、检定、内源及外源因子检测结果的相关资料。
应提供细胞培养液的详细成分。
如使用人或动物源成分,如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其她生物学活性的物质,应具有这些成分的来源、制备方法、质量控制、检测结果与质量保证的相关资料。
(二)细胞库的建立细胞库的建立可为生物制品的生产提供已标定好的、细胞质量相同的及能持续稳定传代的细胞种子。
1.原材料的选择建立细胞库的各种类型细胞的供体均应符合细胞库细胞的检定中相关规定。
神经系统来源的细胞不得用于生物制品生产。
培养细胞用牛血清应来源于无牛脑海绵体脑病流行地区的健康牛群,其质量标准应符合规定(附录XIII D)。
不得使用人血清作为细胞培养液。
如需使用人血白蛋白,则须使用有批准文号的合格制品。
消化细胞用胰蛋白酶应进行检测,证明其无细菌、真菌、支原体或病毒污染。
特别应检测胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒,如细小病毒等。
用于生物制品生产的培养物中不得使用青霉素或β- 内酰胺(β-Lactam)类抗生素。
2.细胞培养操作的要求细胞培养生产人员应定期检查身体。
在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作;在同一工作日进行细胞操作前,不得操作或接触有感染性的微生物或动物。
生物技术制药复习知识点
生物技术制药复习知识点第一章绪论1.生物制药的研究内容包括基因工程制药，细胞工程制药，酶工程制药和发酵工程制药。
2.生物技术制药，是采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
3.生物技术药物，是采用DNA 重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、治疗性抗体或核酸类药物。
4.生物药物，指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品。
5.现代生物药物四种类型：①应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂。
②基因药物，如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。
③来自动植物和微生物的天然生物药物。
④合成与部分合成的生物药物。
6.生物药物按功能用途分为三类：治疗药物，预防药物和诊断药物。
7.生物技术药物的特性：分子结构复杂，具种属特异性，治疗针对性强、疗效高，稳定性差，基因稳定性，免疫原性、重复给药会产生抗体，体内半衰期短，受体效应，多效性和网络效应，质量控制的特殊性，生产系统的复杂性。
8.生物技术制药特征：高技术，高投入，长周期，高风险，高收益。
9.基因诊断：指采用分子生物学的方法在DNA水平或RNA水平对基因的结构和功能进行分析从而对特定的疾病进行诊断。
第二章基因工程制药1.利用基因工程技术生产药品的优点：（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
2.基因工程技术就是将目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
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工作细胞库（WCB）制备
1. 根据SOP，提供工作细胞库（WCB，冻干管）制备的工艺过程与中间控制的描述资料，必要时对SOP修订或补充。
工作细胞库由主细胞库（MCB）制备。
工艺过程如下：
上一年留存冻干管（主细胞库）
↓
制备若干斜面
↓
摇瓶发酵水平测定
↓
选定满意的斜面
↓
制备冻干管（今年的工作细胞库）
在制备主细胞库过程中，制备的斜面在温度３４℃、湿度４０％～５０％的培养箱中培养７天。
检测发酵水平时，摇瓶于３２±１℃的摇床上培养８天。
对于选定的斜面，其化学效价应和上一年主细胞库效价的差距≤５％，并且斜面外观和其摇瓶中菌丝的形态也要符合相应的特征。
2. 参照ICH Q5D和EP中“PRODUCTS FO FERMENTATION”的要求，提供现有主细胞库鉴别、纯度和生产能力的数据，并与历史数据比较，提供由此主细胞库制备的工作细胞库的鉴别、纯度和生产能力的数据，并与主细胞库比较。
主细胞库的稳定性包括鉴别、纯度和生产能力的检测。
利用16S rRNA测定菌种的基因序列来进行MCB的鉴别。
和已知基因序列相比，如果两者相同比率≥98%，则说明MCB没有发生变异。
利用平板菌落分离来检测菌种的纯度。
如果分离平板中没有1个杂菌菌落生长，则说明MCB没有受到其它菌种的污染。
利用摇瓶发酵来检测MCB的生产能力。
将菌种接种到发酵瓶后，在32±1℃培养8天，如果与去年主细胞库效价差距≤5%，则说明MCB的生产能力是稳定的。
主细胞库以冻干管形式保存于2~6℃冰箱中，保存时间不超过3年。
在工作细胞库方面：
菌种鉴别主要靠肉眼观察和显微镜观察来进行。
肉眼观察成熟单菌落，菌落具有一定的花瓣形状，边缘不规则，中间隆起，且颜色偏灰。
将菌种接种到摇瓶并且培养，用显微镜观察菌丝，发现菌丝微直，呈一定放射状，和分枝菌丝一起构成网状。
和MCB一样，利用平板菌落分离来检测WCB的纯度。
如果分离平板中没有1个杂菌菌落生长，则说明WCB没有受到其它菌种的污染。
利用摇瓶发酵来检测菌种的生产能力。
将菌种接种到发酵瓶后，在32±1℃培养8天，如果和制备工作细胞库的主细胞库效价差距≤5%，则说明WCB的生产能力是稳定的。
工作细胞库以冻干管形式保存于2~6℃冰箱中，保存时间不超过1年。