鲜乳中抗生素的检验
生鲜乳中抗生素残留的检测
徐 华敏
（ 淮安 市产 品质量监督检验所 ， 江苏淮安
ＸＵ Ｈｕ ａ －ｍｉ ｎ
２ ２ ３ ０ ０ １ ）
（ Ｈ ｕ ａ ｉ ａ ｎ ｃ ｉ ｔ ｙ ｆ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｑ ｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ ｓ ｕ ｐ ｅ ｒ ｖ ｉ ｓ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｉ ｎ ｓ ｐ ｏ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｓ ｕ Ｈ ｕ ａ ｉ ｎ ２ ａ ２ ３ ０ ０ １ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
ｒ ａ ｗ ｆ ｒ ｌ ｅ ｓ ｈ ｍｉ ｌ ｋ ．Ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ＨＰ Ｌ Ｃ ｉ ｓ ａ ｌ ｌ ｅ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｎｄ ａ ｓ ｉ ｍｐ ｌ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ｅ ｎｔ ａ ｉ ｂ ｉ ｏ ｉ ｔ ｃ ｒ ｅ ｓ ｉ ｄ ｕ ｅ ｓｉ ｎ ｒ ａ ｗｆ ｒ ｅ ｓ ｈｍ ｉｌ ｋ 。 Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ ａ ｎｔ ｉ ｂ ｉ ｏ ｉ ｔ ｃ ｓ ； ＨＰ Ｌ Ｃ；ｆ ｒ ｅ ｓ ｈ ｉｌ ｍ ｋ； ｒ ｅ ｓ ｉ ｄ ｕ ａ ｌ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ
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确 的特 点 。
关 键词
《食品微生物检验技术》教学课件—鲜乳中抗生素的检测
工作任务九
1、容易引起过敏反应 2、造成环境平衡紊乱或菌群失调 3、在药物治疗中产生耐药性 4、发酵异常
检验依据：国家标准《GB/T 4789.27-2008 鲜乳中抗生素残留检验》
检测范围：国标中规定
第一法适用于鲜乳中能抑制嗜热链球菌（Streptococcus thermophislus）的 抗生素的检验；
第二法适用于鲜乳中能抑制嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种（Bacillus stearothermohpilus var.calidolactis）的抗生素的检验，也可用于复原乳、消 毒灭菌乳、乳粉中抗生素的检测。”
检测原理：
样品经过80℃杀菌后，添加嗜热链球菌菌液。培养一段时间后，嗜热链球 菌开始增殖。这时候加入代谢底物2,3,5-氯化三苯四氮唑（TTC），若该样 品中不含有抗生素，或抗生素的浓度低于检测限，嗜热链球菌将继续增殖， 还原TTC 成为红色物质。相反，如果样品中含有高于检测限的抑菌剂，则 嗜热链球菌受到抑制，因此指示剂TTC不还原，保持原色。
（2）HLPC法：
高效液相色谱法是世界上迄今为止公认的农残药残的定量方法，同时也是世界 上主要的仲裁标准方法。
1、加强对饲料的检测，防止饲料中出现抗生素药物 2、控制奶牛乳腺炎的发病率 3、严格遵守休药期规定 4、加强饲养管理 5、加强法规体系建设
检验报告： 最终观察时，培养基依然保持原有的紫色，可以报告为抗生素残留性。
鲜乳中抗生素残留检测
1.原理 细菌生物氧化有三种方式，即加氧、脱氢和脱电子。 当样品中加入嗜热链球菌后，如果样品中没有抗生素残 留，嗜热链球菌就生长繁殖，在新陈代谢过程中进行生 物氧化，其中脱出的氢可以和加在样品中的氧化型TTC 结合而成为还原型TTC，氧化型TTC是无色的，还原型 TTC是红色的，所以可以使样品变红色。相反，如果样
鲜乳中抗生素残留检测
注：嗜热链球菌的筛选方法
（1）培养 培养基配方：酵母膏7.5g 、蛋白胨7.5g、葡萄糖10g 、KH2PO4 2g、西红柿 汁100mL 、吐温80 0.5mL、 蒸馏水900mL pH 7.0 ★ 西红柿汁的制作方法： 将新鲜番茄洗净，去皮切碎（切勿捣碎），放入锥形瓶，置4℃冰箱8~12h，取 出后用纱布过滤。如一次使用不完，可将其置入0℃冰箱，可保存四个月。使 用时让其在常温下自然溶解。 制法：将上述各成分加热溶解，校正pH，分装于灭菌锥形瓶中，在115℃下高 压灭菌20min。取适量酸奶（3~5mL）接种于培养基，进行培养分离。
品中存在抗生素，嗜热链球菌就不能生长繁殖不变色。
鲜乳中抗生素残留检测
2.设备与材料
水浴锅 恒温培养箱
温度计
试管架 灭菌10mL吸管
灭菌1mL吸管
灭菌15×150mm试管 杀菌锅
鲜乳中抗生素残留检测
3.培养基和试剂
菌种：嗜热链球菌 脱脂乳：脱脂奶粉按10%含量（W/V）加蒸馏水调
鲜乳中抗生素残留检测
5. 判断方法
准确培养30min，观察结果，如为阳性，再继续培养30min做第二次观 察。在观察时要迅速，避免光照过久干扰，乳中有抗生素存在，则在向 检样中加入菌液培养时细菌不增殖，此时由于加入的指示剂TTC不还原， 所以不显色。与此相反，如果没有抗生素存在，则加入菌液即进行增殖， TTC被还原而显红色，也就是说检样呈乳的原色时为阳性，成红色为阴 性。
乳中抗生素的检验
利用特定微生物对抗生素的敏感性，将微生物与待测乳样混合培养，根据微生物的生长情况来判 断乳中抗生素的残留。
酶底物法
利用抗生素对特定酶的抑制作用，将酶底物与待测乳样混合，观察底物的水解情况来判断乳中抗 生素的残留。
理化检验方法
高效液相色谱法（HPLC）
利用高效液相色谱技术对待测乳样进行分离和检测，通过对比标准品色谱图来判断乳中抗 生素的种类和含量。
积极参加国内外权威机构组织的能力验证活 动，提高实验室检验能力。
实验室间比对
定期与其他实验室进行比对试验，评估实验 室检验结果的准确性和一致性。
外部审核和认可
接受外部审核机构的审核和认可，确保实验 室管理体系的持续改进和有效运行。
客户满意度调查
定期开展客户满意度调查，收集客户反馈意 见，及时改进服务质量。
依据国家颁布的乳制品中抗生素 残留限量标准及相关法规进行判 定。
02
国际标准和指南
参考国际食品法典委员会(CAC)、 欧盟等国际组织和地区的相关标 准和指南进行结果判定。
03
企业标准和内控指 标
结合企业自身制定的产品标准和 内部控制指标，对检验结果进行 综合判定。
误差来源分析及消除策略
样品处理误差
07 结论与展望
本次研究主要成果总结
1
成功建立了乳中抗生素残留的高效液相色谱检测 方法，该方法具有灵敏度高、准确性好的特点。
2
通过对市售乳制品进行抽样检测，发现部分样品 中存在抗生素残留超标的情况，为乳制品安全监 管提供了有力依据。
3
研究了不同种类抗生素在乳制品中的残留规律， 为制定更加科学合理的乳制品安全标准提供了参 考。
疾病。
氨基糖苷类
牛奶中抗生素残留的几种常用检测方法
牛奶中抗生素残留的几种常用检测方法1.高效液相色谱法（HPLC）：高效液相色谱是一种基于溶剂流动的液相色谱方法，具有灵敏度高、分离能力强等特点。
在牛奶中检测抗生素残留时，首先将牛奶样品经过样品前处理，去除干扰物，然后使用适当的洗脱液将抗生素从固相萃取柱中洗脱出来，最后用高效液相色谱对抗生素进行分离和定量。
2.毛细管电泳法（CE）：毛细管电泳法是一种基于电场作用下溶液中离子迁移速度的分析方法。
该方法具有高分离能力、快速分析速度等特点。
在牛奶中检测抗生素残留时，首先将牛奶样品进行前处理，然后通过毛细管电泳仪器进行分析。
该方法不仅可以同时检测多种抗生素，而且样品准备过程相对简单。
3.气相色谱法（GC）：气相色谱法是一种基于色谱柱分离原理的分析方法，通过适当的蒸发和衍生反应可以将抗生素样品转换为易于气相色谱分析的衍生化物。
该方法具有高度选择性、高灵敏度等优点。
在牛奶中检测抗生素残留时，通常需要进行样品前处理。
首先将牛奶样品中的脂肪物质去除，然后使用适当的溶剂将抗生素从样品中提取出来，并通过气相色谱进行分离和定量分析。
4.酶联免疫吸附法（ELISA）：酶联免疫吸附法是一种基于抗原-抗体反应原理的免疫学方法。
在牛奶中检测抗生素残留时，首先利用适当的蛋白质工程技术制备特异性抗生素抗体，然后将牛奶样品中的抗生素与抗体结合，通过酶标记的二抗或亲和素染色法对特异性抗体进行检测。
该方法具有灵敏度高、操作简单等特点。
5.高分辨质谱法（HRMS）：高分辨质谱法是一种基于质荷比检测的方法，具有高灵敏度、高分辨率等优点。
在牛奶中检测抗生素残留时，首先将牛奶样品经过适当的前处理，然后通过质谱仪对抗生素进行定性和定量分析。
该方法不仅可以同时检测多种抗生素，而且可以准确测定其残留量。
总结起来，牛奶中抗生素残留的检测方法包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法、酶联免疫吸附法和高分辨质谱法等。
这些方法具有不同的优点和适用范围，可以根据具体需求选择合适的方法进行检测。
鲜乳中抗生素残留检验
鲜乳中抗生素残留检验鲜乳中抗生素残留检验张志诚 060409123（常熟理工学院，苏州常熟，215500）摘要：利用TTC快速检测法对牛奶中抗生素检测结果进行比较分析，根据检测结果认为样品牛奶中不含青霉素G类抗生素。
关键词：牛奶；抗生素残留；TTC；青霉素GAbstract：The TTC method is used to detect the antibiotic residue in milk.According to testresults,there’s no Penicillin-G class antibiotic residue.Key words：milk; antibiotic residue; TTC method; Penicillin-G class antibiotic 育，引言随着人们对食品安全问题的逐步关TTC不能还原，试验液为无色状态。
根据待注．长期饮用抗生素残留超标乳制品可能引测牛奶的着色情况判定是否有抗菌素存在。
起的菌群失调、产生耐药性。
该问题已引起该法简便、快速，无需特殊设备，2h～3 h消费者和乳品生产企业的高度重视。
虽然我可见报告。
检测各种抗生素所用的TTC法试国《生鲜牛乳收购标准》中并未对抗生素残验的灵敏度(最低检出量)分别为：青霉素留作出要求．。
但绝大部分乳品生产企业在 0．004U／mL，链霉素0．5 U／mL，庆大霉原料乳收购环节都已开展抗生素残留检测素0．4 U／mL，卡那霉素5 U／mL。
工作。
本文利用TTC法(嗜热链球菌抑制法)对牛奶中抗生素残留进行检测。
2.材料和方法1.原理TTC法，即氯化三苯基四氮唑法(tripheye tetrazolium chloride)，是目前我国食品卫生标准中规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法 (GB5409．85)。
样品经80℃杀菌后加入嗜热链球菌菌液。
培养一段时间后加入TTC( 2,3,5-氯化三苯四氮唑），若样品中不含抗菌素或其浓度低于检测限，试验菌繁殖，TTC被还原，试验溶液变成红色。
乳品中抗生素的检测方法
乳品中抗生素的检测方法引言：抗生素是一种用于治疗和预防疾病的药物，但在食品中的残留量超标可能对人体健康造成负面影响。
乳制品是人们日常生活中常见的食品之一，因此对乳品中抗生素残留的检测方法至关重要。
本文将介绍几种常用的乳品中抗生素检测方法。
一、高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是一种常见的用于检测乳制品中抗生素残留的方法。
该方法能够在短时间内对多种抗生素进行分离和定量。
具体操作步骤如下：1.准备样品：将待测乳制品样品样品加入适量的提取剂中，经过摇晃和离心等操作，获得样品提取液。
2.样品的制备：将样品提取液进行蒸发浓缩，得到浓缩样品。
3.高效液相色谱分离：将浓缩样品溶解于适量的溶剂中，并通过高效液相色谱仪器进行分离，获得不同抗生素的峰。
4.定量分析：通过标准曲线法，根据峰的面积或高度进行定量分析，得出样品中抗生素的浓度。
优点：高效液相色谱法能够同时检测多种抗生素，具有较高的定量精度和分辨率。
二、酶联免疫吸附试验法（ELISA）酶联免疫吸附试验是一种利用抗生素与酶标记物结合来检测乳制品中抗生素残留的方法。
具体操作步骤如下：1.制备测定板：首先将具有抗生素特异性的抗体固定在微孔板上。
2.加样：将待测样品加入微孔板中，经过一定的反应时间，让样品中的抗生素与抗体结合。
3.洗涤：用洗涤缓冲液清洗微孔板，去除未结合的物质。
4.酶标记：加入酶标记抗体，使其与结合到微孔板上的抗生素形成复合物。
5.底物溶液：加入底物溶液，通过底物的催化反应，将其转变为有颜色的产物。
6.测定：通过酶标仪器测定样品中产生的颜色和强度，得出抗生素的浓度或者阳性相关性结果。
优点：酶联免疫吸附试验法具有操作简便、快捷、敏感性高等优点，能够检测到低浓度的抗生素残留。
三、质谱法（MS）质谱法是一种通过对乳品样品中的物质进行化学分析的方法，它能够精确地分析样品中的抗生素成分。
该方法结合了质谱仪和色谱仪的特点，具体步骤如下：1.样品制备：将待测乳制品样品加入适量的提取剂中，经过摇晃和离心等操作，获得样品提取液。
鲜乳中抗生素的检验
TTC检测法操作步骤
菌液制备:将菌种移种脱脂乳,经36±1℃培养15h后,以灭 菌脱脂乳1:1稀释待用。 检验：取检样9mL,置15mm×150mm试管内,80℃水浴加热 5min冷却37℃以下,加菌液1mL,36±1℃水浴培养2h,加 TTC0.3mL,36±1℃水浴培养30min,观察如为阳性,再于水 浴中培养30min作第二次观察,每份检样作二份,另外再作 阴性和阳性对照各一份,阳性对照管用无抗生素的乳8mL 加抗生素及菌液和TTC。阴性对照管用无抗生素乳9mL加 菌液和TTC。 判断方法：准确培养30min观察结果,如为阳性,再继续培 养30min作第二次观察。观察时要迅速,避免光照过久发 生干扰。乳中有抗生素存在,则检样中虽加菌液培养物, 但因细菌的繁殖受到抑制,因此指示剂TTC不还原,不显色。 与此相反,如果没有抗生素存在,则加入菌液即行增 殖,TTC被还原而显红色,也就是说检样呈乳的原色时为阳 性,呈红色为阴性，见表1，检测各种抗生素的灵敏度见 表2 。
表1 显色状态判断标准
显色状态 未显色者 徽红色者 桃红色至红色者 判断 阳性 可疑 阴性
表2 检测各种抗生素的灵敏度
抗生素名称 青霉素 链雹素 庆大霉素 卡那霉素 最低检出量 0.004单位 0.5单位 0.4单位 5单位
注意事项
• 1、配制培养基应注意的问题 • 2、嗜热链球菌的保存
TTC检测法
TTC法，即氯化三苯基四氮唑法( tripheye tetrazolium chloride)，是目前我国食品卫 生标准中规定的检查牛乳中抗生素残留的 检测方法(GB5409—85)。该法简便、快 速，无需特殊设备，3～4h可见报告，很 适合牧场、乳品厂及食品卫生检测部养基和试剂 菌种:嗜热乳酸链球菌。 脱脂乳:经113℃灭菌20min。 4%2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)水溶液:称取 1gTTC,溶于5mL灭菌蒸馏水中,装褐色瓶内于7℃ 冰箱保存,临用时用灭菌蒸馏水稀释至5倍。如 遇溶液变为玉色或淡褐色,则不能再用。 • 仪器 水浴锅、培养箱、不锈钢锅、温度计、蜡笔、 试管架、1ml和10ml的灭菌吸管、灭菌试管
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TTC检测法操作步骤
菌液制备:将菌种移种脱脂乳,经36±1℃培养15h后,以灭 菌脱脂乳1:1稀释待用。
检验：取检样9mL,置15mm×150mm试管内,80℃水浴加热 5min冷却37℃以下,加菌液1mL,36±1℃水浴培养2h,加 TTC0.3mL,36±1℃水浴培养30min,观察如为阳性,再于水 浴中培养30min作第二次观察,每份检样作二份,另外再作 阴性和阳性对照各一份,阳性对照管用无抗生素的乳8mL 加抗生素及菌液和TTC。阴性对照管用无抗生素乳9mL加 菌液和TTC。
牛奶中抗生素残留的来源
一般认为，对泌乳牛用药不当或不注 意安全时间是牛乳中抗生素残留的重 要因素，尤其是使用乳房灌注法治疗 乳腺炎时，易造成牛乳中抗生素残留。 在牛饲料中添加饲料添加剂已十分普 遍，其中含有一定比例的抗生素，主 要作用是预防疾病，这是牛奶抗生素 残留的重要原因。
鲜乳中抗生素残留量检验程序
表1 显色状态判断标准
显色状态 未显色者 徽红色者 桃红色至红色者
判断 阳性 可疑 阴性
表2 检测各种抗生素的灵敏度
抗生素名称
最低检出量
青霉素 链雹素
0.004单位 0.5单位
庆大霉素
0.4单位
卡那霉素
5单位
注意事项
• 1、配制培养基应注意的问题 • 2、嗜热链球菌的保存
TTC检测法
TTC法，即氯化三苯基四氮唑法( tripheye tetrazolium chloride)，是目前我国食品卫 生标准中规定的检查牛乳中抗生素残留的 检测方法(GB5409—85)。该法简便、快 速，无需特殊设备，3～4h可见报告，很 适合牧场、乳品厂及食品卫生检菌种:嗜热乳酸链球菌。 脱脂乳:经113℃灭菌20min。 4%2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)水溶液:称取 1gTTC,溶于5mL灭菌蒸馏水中,装褐色瓶内于7℃ 冰箱保存,临用时用灭菌蒸馏水稀释至5倍。如 遇溶液变为玉色或淡褐色,则不能再用。
• 仪器
水浴锅、培养箱、不锈钢锅、温度计、蜡笔、 试管架、1ml和10ml的灭菌吸管、灭菌试管
判断方法：准确培养30min观察结果,如为阳性,再继续培 养30min作第二次观察。观察时要迅速,避免光照过久发 生干扰。乳中有抗生素存在,则检样中虽加菌液培养物, 但因细菌的繁殖受到抑制,因此指示剂TTC不还原,不显色。 与此相反,如果没有抗生素存在,则加入菌液即行增 殖,TTC被还原而显红色,也就是说检样呈乳的原色时为阳 性,呈红色为阴性，见表1，检测各种抗生素的灵敏度见 表2 。