维生素B2(核黄素)测定示例
维生素b2生物利用度实验报告
维生素b2生物利用度实验报告一、荧光试验1、方法原理维生素B2（核黄素）具芳香环和杂环，有长共轭结构的π-→π＊跃迁，具有荧光性，在酸、碱性条件下及加入各种还原剂均会使维生素B2（核黄素）转变为无荧光的物质。
2、试剂和材料盐酸溶液：1＋2.氢氧化钠溶液：40g／L。
连二亚硫酸钠。
3、分析步骤取约0.05g实验室样品，加100mL水溶解后，溶液显淡黄绿色并有强烈的黄绿色荧光；加盐酸溶液，摇匀后，黄色即消褪，荧光亦消失。
二、紫外-可见吸收光谱鉴别1、方法原理维生素B2（核黄素）具苯环结构，有多个共轭双键，其紫外-可见吸收光谱中有三个吸收峰（444nm，375nm与267nm），用A444mm ／A267mm及A375mm／A267mm的比值来鉴别维生素B2（核黄素）。
2、试剂和材料冰乙酸。
乙酸钠溶液：14g／L。
实验室样品溶液：取约0.075g实验室样品，精确至0.001g，置烧杯中，加1mL冰乙酸与75mL水，加水稀释，冷却至室温，移置500mL棕色容量瓶中，再加水稀释至刻度，摇匀。
3、仪器和设备紫外-可见分光光度仪。
石英池（1cm）。
4、分析步骤取实验室样品溶液扫描，点击光谱扫描，设定波长范围，测出光谱曲线，在波长444mm±1nm、375nm±1nm与267nmtlnm处有最大吸收，并测定吸光度（A），计算A375mm／A267mm的比值为0.31～0.33和A444m／A267mm的比值为0.36～0.39.5、测定结果A373/A267=0.342/1.039=0.33A445/A267=0.404/1.039=0.39三、维生素B2的测定1、方法原理维生素B2（核黄素）具苯环结构，有多个共轭双键，在波长444nm 处有最大吸收，将样品溶液于该波长处测定吸光度，以百分吸光系数（E／m）计算即得其质量分数。
2、试剂和材料冰乙酸。
乙酸钠溶液：14g／L。
3、仪器和设备紫外-可见分光光度仪。
荧光光度分析法测定维生素B2---全.ppt优制材料
（2）具有刚性平面结构分子有利于荧光发射 分子的共平面越大，其π电子的共轭程度越大。
如荧光素和酚酞结构十分相似，荧光素有很强的 荧光，而酚酞没有，这是由于荧光素有刚性平面 结构，减少了分子振动，减少了去活化的概率。
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（3）取代基的作用
给电子基增强荧光: －OH, －NH2,－NHR, －NR2,－C≡N
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3.样品池
荧光分析的比色皿通常用石英材料做成，荧 光比色皿四面均为磨光透明面，同时一般仅有 一种厚度为1cm的液池。
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4. 检 测 器
荧光计多采用光电倍增管进行检测。检测器 的方向应与激发光的方向成直角，以消除样品 池中透射光和杂散光的干扰。
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5. 记录、显示装置
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实验一 荧光法测定医用维生素B2中核 黄素的含量
一、实验目的：
1.学习和掌握荧光光度分析法的基本原理和方法 2.学会使用荧光分光度计
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二、实验原理
核黄素易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂， 在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热 稳定。核黄素在碱性溶液中经光线照射会发生 分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素 的荧光强的多，故测核黄素时溶液要控制在酸 性范围内，且在避光条件下进行。
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1. 激 发
通常在室温下物质分子 大部分处于基态的最低振动
能级（ =0）。当电子吸
收一定频率的电磁辐射发生 能级跃迁时，可上升至不同 激发态的各振动能级，其中 大部分分子上升至第一激发 单重态（ S1 ），这一过程 称为激发。
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2.去活化过程
荧光分光光度法测定维生素B2的含量
荧光分光光度法测定维生素B2的含量华南师范大学实验报告课程名称：仪器分析实验实验项目：荧光分光光度法测定维生素b21．掌控荧光物质的标准曲线法定量测量含量的操作方法和原理；2．了解分子荧光光谱定量分析与定性分析的特点及区别；3．熟识荧光光度计定量法测量软件的数据处理。
含有荧光基团的化学物质，其分子吸收了辐射能成为激发态分子，再从激发态返回基态时发射光的波长比吸收的入射光波长更长，分子荧光就是发光方式中较常见的光致发光。
在一定频率和一定强度的激发光照射下，当溶液的浓度很小同时光被吸收的分数也不太大时，稀溶液体系将符合朗伯-比尔定律，该溶液所产生的荧光强度与溶液中这种荧光物质的浓度呈线性关系，可用公式表示：if=2.3k'kbci0当入射光强度i0一定时if=kc以上两式中k'为荧光量子效率；k为荧光分子的摩尔吸光系数；b为液槽厚度；c以为荧光物质的浓度。
分子荧光标准曲线法就是挑一定未知量的标准物质与等待分析试样溶液经过相同的处置后，酿制成一系列的标准溶液，测量其荧光强度，并以荧光强度为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标绘制其工作曲线，再由所测获的试样溶液的荧光强度对工作曲线作图从而谋出来试样溶液中该被分析检测物质的实际浓度含量。
此法适用于于痕量分析，并且标准溶液和试样溶液的荧光强度必须就是在荧光仪已计入空白溶液的荧光强度的读数。
维生素b2，又称核黄素。
分子式c17h20n4o6。
它是人体必需的13种维生素之一，作为维生素b族的成员之一，微溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液。
可以用荧光光度法测维生素b2的含量的原因:维生素b2溶液在430～440nm蓝光的反射下，收到绿色荧光，荧光峰在535nm。
维生素b2在ph=6～7的溶液中荧光强度最小，在ph=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素b2的含量。
该实验的控制条件:维生素b2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素b2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
荧光法测定维生素B2含量
西安文理学院化学工程学院实验报告实验编号： 2014 年 4 月 24 日化学类专业13级1班实验名称:荧光光度法测定食品中维生素B2的含量姓名：秦阳成绩：同组人: 指导老师：———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————一．实验目的1.学习荧光光度法测定“高乐高”固体饮料中维生素B2的分析原理。
2.熟悉荧光分光光度计的操作技术。
二．实验原理维生素B2，又叫核黄素，是橘黄色无臭的针状结晶。
维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂。
在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
维生素B2水溶液在430~440nm蓝光或紫外光照射下会发生绿色荧光，荧光峰在535nm，在pH 6~7的溶液中荧光强度最大，在pH 11的碱性溶液中荧光消失。
由于维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生光分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多。
因此，测量维生素B2的荧光时，溶液要控制在酸性范围内，且须在避光条件下进行。
三．仪器与试剂970CRT荧光分光光度计。
10μg/ml维生素B2标准溶液：准确称取10.0mg维生素B2，用热蒸馏水溶解后，转入1L 棕色容量瓶中，冷却后加蒸馏水至标线，摇匀，置于暗处保存。
冰乙酸（AR）；多维葡萄糖粉试样。
四. 实验步骤(1) 标准曲线的绘制于6只50mL容量瓶中，分别加入10μg/ml维生素B2标准溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mL，再各加入冰乙酸2.0mL，加水至标线，摇匀。
在970 CRT荧光分光光度计上，用1cm荧光比色皿于激发波长440nm，发射波长540nm处，测量标准系列溶液的荧光强度。
(2) “高乐高”固体饮料中维生素B2的测定准确称取一定量的“高乐高”固体饮料试样，用少量水溶解后转入50mL容量瓶中，加冰乙酸2mL，摇匀。
维生素B2含量的测定方法--荧光分光光度法
维生素B2含量的测定方法--荧光分光光度法含量测定为例介绍荧光分光光度法测定维生素Ｂ2含量的以饲料中维生素B2方法。
采用标准：GB/T5009.85——2003，本标准规定了饲料中维生素B2测定方法。
1.1方法原理（即核黄素C17H20N4O6）在440nm紫外光激发下产生绿色荧光，维生素B2在一定浓度范围内其荧光强度与核黄素浓度成正比。
用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与内标荧光强度的比值，计算样品核黄素的含量。
1.2试剂和溶液除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。
1.2.1盐酸溶液，0.1mol／L，将8.5mL盐酸（GB 622）用水稀释至1000mL。
1.2.2盐酸溶液，1mol／L，将85mL盐酸用水稀释至1000mL1.2.3氢氧化钠溶液，1mol／L，将40gNaOH（GB 629）溶于水定容至1000mL1.2.4冰乙酸（GB 676）。
1.2.5冰乙酸溶液，0.02mol／L：将1.8mL冰乙酸用水稀释至1000mL。
1.2.6高锰酸钾（GB 643）溶液，40g／L。
1.2.7过氧化氢（HG 3─1082）溶液，100mL／L。
现用现配。
1.2.8核酸素标准溶液核黄素贮备液Ⅰ：将核黄素于五氧化二磷干燥器中干燥24h，称取0.0500g，溶解于0.02mol／L乙酸溶液（3.2.5）中，在蒸汽浴上恒速搅动直至溶解，冷却后稀释至500mL。
盛入棕色瓶滴加甲苯覆盖，低温（4℃）保存。
该溶液每毫升含0.1mg核黄素。
核黄素贮备液Ⅱ：取核黄素贮备液Ⅰ10mL用0.02mol／L乙酸溶液稀释至100mL，盛于棕色瓶中滴加甲苯覆盖，低温（4℃）保存。
该溶液每毫升中含10μg 核黄素。
核黄素标准工作液：取核黄素贮备液Ⅱ10mL，用水稀释至100mL。
现用现配。
该溶液每毫升中含1μg核黄素。
1.2.9荧光素标准溶液1.2.9.1荧光素贮备液：称取荧光素（Q／HG 22─786）0.0500g，用水稀释至1000mL，盛于棕色瓶中，低温（4℃）保存。
维生素B2的含量测定
2.样品溶液制备 2.样品溶液制备 称取50g新鲜蔬菜， 40mL水压汁， 称取50g新鲜蔬菜，加40mL水压汁，将菜 50g新鲜蔬菜 水压汁 汁加入20mL1mol.L HCl和10mL水煮沸1h， 水煮沸1h 汁加入20mL1mol.L-1HCl和10mL水煮沸1h， 冷却，不断搅拌滴加2mol.L NaOH， 冷却，不断搅拌滴加2mol.L-1NaOH，调节 pH为 再用稀HCl调节pH 4.5，过滤， HCl调节pH至 pH为6，再用稀HCl调节pH至4.5，过滤，用 水洗涤样品， 水洗涤样品，洗涤液和过滤液合并定量转移 至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。 100mL容量瓶中，加水稀释至刻度 容量瓶中
维生素B 维生素B2的分子荧光测定 一、目的要求
１、了解分子荧光分析法的原理。 了解分子荧光分析法的原理。 掌握用荧光法测定维生素的分析方法。 ２、掌握用荧光法测定维生素的分析方法。 掌握荧光光度计的基本操作方法。 ３、掌握荧光光度计,在W为0.05的乙酸溶 0.05的乙酸溶 维生素B 又称核黄素,溶于水, 液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中， 液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中，对热稳 在碱性溶液中较易被破坏。 定，在碱性溶液中较易被破坏。通过实验确定它的最佳 激发波长（370nm和440nm）和发射波长（560nm）， 激发波长（370nm和440nm）和发射波长（560nm）， 在所确定的波长条件下，测定维生素B2 B2标准系列溶液 在所确定的波长条件下，测定维生素B2标准系列溶液 的荧光强度和浓度的工作曲线。 的荧光强度和浓度的工作曲线。用标准曲线法测定生物 样品（蔬菜）中的维生素B 含量。 样品（蔬菜）中的维生素B2含量。
3.工作曲线绘制 3.工作曲线绘制 取标准系列溶液之一，试验实验条件， 取标准系列溶液之一，试验实验条件，找 出最佳荧光发射波长。在所确定的波长条件 出最佳荧光发射波长。 下测定标准系列溶液的荧光强度， 下测定标准系列溶液的荧光强度，绘制荧光 强度与浓度的工作曲线。 强度与浓度的工作曲线。 4.测定 4.测定 分别吸取10.00mL样品溶液三份， 10.00mL样品溶液三份 分别吸取10.00mL样品溶液三份，依次置 于三只25.00mL容量瓶中，加入1.25mL冰醋 于三只25.00mL容量瓶中，加入1.25mL冰醋 25.00mL容量瓶中 1.25mL 再加入KMnO 溶液(3%)0.5mL (3%)0.5mL， 酸，再加入KMnO4溶液(3%)0.5mL，放置 2min，边摇边滴H (30%)， 2min，边摇边滴H2O2(30%)，使KMnO4刚 好褪色，用纯水稀释至刻度， 好褪色，用纯水稀释至刻度，在荧光光度计 上分别测定其荧光强
荧光法测定维生素B2(0802)
补充实验荧光法测定维生素B2片剂中核黄素含量一、实验目的1、了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理2、掌握荧光光度计的操作技术和测定维生素片B2中核黄素的实验方法二、实验原理某些物质被某种波长的光（如紫外光）照射后，会在极短时间内，发射出较入射光波长为长的光，这种光称为荧光。
吸收什么波长范围的光和发射什么波长范围的光，这与被照射的物质有关。
而所发射的荧光的强度与该物质的浓度有如下关系：I f=KфI0（1-e-alc）式中：I f为荧光强度；K为仪器常数；ф为荧光物质的荧光量子产率；I0为入射光强度；l为样品池厚度；c为荧光物质的浓度（mol•l-1）；a为荧光物质的摩尔吸光系数。
当溶液浓度较稀时，则I f=KфI0alc可见，在稀溶液中，当入射光强度、样品池厚度、仪器工作条件不变时，测得的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。
维生素B2，又叫核黄素，是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为核黄素易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
核黄素B2在230～490nm范围波长的光照射下，激发出峰值在526nm左右的绿色荧光，在pH 为6～7范围内荧光强度最大，在pH=11的碱性溶液中荧光消失。
基于上述性质建立维生素B 2的荧光分析法，选择合适的激发波长、荧光波长和实验条件，即可进行定量测定。
三、实验用品1、 仪器 荧光分光光度计，离心机，离心管，酸度计或pH 试纸，移液管，容量瓶（25ml 、50ml 、100ml ），比色管（25ml ），烧杯（50ml ）2、 试剂 50μg •ml -1核黄素，冰醋酸（5%），盐酸（1：1），氢氧化钠（10%），市售维生素B2片剂四、实验步骤1、配制1·10-mL g μ的核黄素标准溶液： 移取1·50-mL g μ核黄素（维生素2B ）10mL ，用5％醋酸溶液稀释定容到50.00mL 。
2、实验条件的选择（1）、激发光波长和荧光波长的选择 准确移取10μg •ml -1的核黄素标准溶液1.0ml 于25ml 容量瓶中，用5%醋酸溶液稀释至刻度，摇匀。
荧光分光光度法测定药液维生素B2的含量
仪器部件
a.光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度 计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。
b.单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定 量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可 获得激发光谱和荧光光谱。
c.检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光 光度计采用光电倍增管作检测器。
药液维生素B2含量的测定
故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件
下进行。
H3C
R
N
N
O
[O]
CH3
H
H
H3C
C
CH
C
CH2
C
C
C
C
H3C
NH N
O
C
C
C
CH2
H3C
C
C
C
H 光黄H 素
CH2
实验预习
❖ 预习荧光分光光度法测定维生素B2的分析原 理。
❖ 了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素B2 的方法。
仪器与试剂
2011
激发光谱
荧光光谱
激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与
照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，
荧光强度最大。
发射光谱
发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与 发射光波长关系曲线。
固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定 激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长 和发射荧光波长的选择是本实验的关键。
1. 解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。 2. 维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何 在酸性溶液中测定？
医学营养专业《实训七、维生素B2的测定8》
维生素B2的测定1 原理：核黄素在370nm和440nm的光照下产生荧光,发射波长是560nm在稀溶液中荧光强度与核黄素浓度成正比用连二亚硫酸钠将核黄素复原,根据复原前后的荧光差数,计算核黄素的含量色素的干扰可用高锰酸钾氧化法除去2 仪器：荧光分光光度计3 试剂：〔1〕1NNaoH溶液:取40gNaoH溶于1000ml水中。
〔2〕1NHCl溶液：取50ml分析纯HCl以水稀释至600ml。
〔3〕3%高锰酸钾溶液：溶解3g高锰酸钾于水中，再稀释至100ml，每周配一次。
〔4〕1%双氧水：取1ml双氧水稀释至100ml。
〔5〕冰醋酸〔6〕连二亚硫酸钠〔又称粉〕〔7〕核黄素标准储藏液：准确称取２５mg核黄素标准品，用水溶解于1000ml容量瓶中，用水稀释至刻度，此液浓度为２５ug／m1。
〔8〕核黄素标准应用液：取储藏液１ml于５０ml，用水稀释至刻度，／ml。
４操作方法：〔1〕提取：称取含核黄素10ug的均匀样品液样可取50~100ml 于250ml带塞三角瓶中，加1N盐酸15ml、盐酸35ml沸水浴加热1小时。
〔2〕沉淀杂质：样品冷却后，滴加1NNaoH溶液，边加边摇防止局部碱性过强，调节l容量瓶，用水稀释至刻度，如果样品体积很大，可以过滤到100ml容量瓶中，用水洗样品屡次，滤液一并倒入容量瓶中，最后加水至刻度。
〔3〕酸化和纯化：将一样品分装入三个试管中，向每管中准确参加10ml滤液，其中第一只管准确参加1ml核黄素标准应用液，另二支管分别参加1ml蒸馏水。
最后，再向三支试管各参加1ml冰醋酸。
向每支试管滴加1%双氧水，用力摇匀，使高锰酸钾颜色褪去，假设不能马上褪色，可以稍等一会儿，切不可把双氧水加多，以免影响荧光读数。
〔4〕测定：根据仪器具体情况，在激发波长440nm，发射波长560nm条件下，调节零点，使记录位于“0〞处，分别测定三只管中的核黄素的荧光强度。
5 计算：A-C 标准液浓度 1维生素B2含量〔ug/g=——×——————×稀释倍数×—— B-A 10ml滤液样重A：滤液加水管读数B：滤液加标准品管读数C：滤液加水、加2021连二亚硫酸钠管读数。
荧光分光光度法测定维生素B2含量
一、实验目的1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。
2、了解荧光分光光度计基本原理、结构及性能，掌握基本操作。
二、实验原理维生素B2(又叫核黄素，VB2)是橘黄色无臭的针状结晶。
其分子式为：C17H20N4O6，分子量：376.4。
VB2分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。
VB2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
VB2溶液在430～440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。
VB2在pH＝6～7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与VB2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测VB2的含量。
VB2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比VB2的荧光强得多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
在稀溶液中，当实验条件一定时，荧光强度F与荧光物质浓度c 呈线性关系：F=Kc，这是荧光光谱法定量分析的依据。
注意：高浓度时，荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线性关系。
三、主要仪器与试剂主要仪器：荧光分光光度计；1cm石英皿；25mL比色管；1mL、5mL移液管试剂：VB2标准溶液5.0μg/mL；待测样品溶液四、实验步骤1、系列标准溶液的制备取VB2标准溶液0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL 分别置于25mL比色管中，各加入去离子水稀释至刻度，摇匀。
得浓度依次为0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.30μg/mL、0.40μg/mL、0.50μg/mL 的一系列VB2标准溶液。
待测。
2、激发光谱和荧光发射光谱的绘制设置λem＝540nm为发射波长，在250～500nm范围内扫描，记录荧光发射强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。
从激发光谱图上可找出其最大激发波长λex。
从得到的激发光谱中找出最大激发波长，在此激发波长下，在450～700nm范围内扫描，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。