胰蛋白酶的制备及其在细胞培养中的应用研究
高中生物选择性必修三 学习笔记 第2章 第2节 第1课时 动物细胞培养
第2节动物细胞工程第1课时动物细胞培养[学习目标] 1.阐明动物细胞培养的条件和过程。
2.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。
一、动物细胞培养的条件和过程1．动物细胞工程(1)常用技术：动物细胞培养、________________和________________等。
(2)基础：________________。
2．动物细胞培养(1)概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成________，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞__________和__________的技术。
(2)培养条件①营养a．合成培养基：将细胞所需的________(糖类、氨基酸、无机盐、维生素等)按________和_____ ________严格配制而成的培养基。
b．天然成分：使用合成培养基时，通常需要加入________等一些天然成分，原因是__________ _________________________。
c．培养动物细胞一般使用______________，也称为________。
②无菌、无毒的环境a．对培养液和所有培养用具进行________处理。
b．在________环境下进行操作。
c．培养液需定期________，以便清除________，防止细胞代谢物________对细胞自身造成危害。
③温度、pH和渗透压a．温度：以36.5 ℃±0.5 ℃为宜。
b．pH：以pH为________为宜。
c．适宜的渗透压。
④气体环境a．组成：动物细胞培养所需气体主要有________和________。
b．不同气体的作用O2：________________________。
CO2：________________________。
c．培养容器：通常采用________或________。
d．培养仪器：含有________________的混合气体的____________。
(3)培养过程①②过程(4)相关概念①细胞贴壁：悬液中分散的细胞往往______在培养瓶的瓶壁上。
单细胞制备实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握单细胞制备的基本原理和方法。
2. 熟悉细胞培养的无菌操作技术。
3. 学习使用显微镜观察细胞形态和生长状态。
4. 了解细胞计数和细胞活力检测的基本方法。
二、实验原理单细胞制备是指从组织中分离出单个细胞，以便于进行细胞培养、分子生物学研究等实验。
本实验采用胰蛋白酶消化法进行单细胞制备，该方法能够有效破坏细胞间的连接，使细胞离散成单个细胞。
三、实验材料1. 实验动物：小白鼠2. 实验试剂：胰蛋白酶、Hank's液、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、无菌注射器、无菌剪刀、无菌镊子、无菌培养皿、无菌吸管、显微镜、血球计数板等。
四、实验步骤1. 组织块制备：取小白鼠脾脏，用无菌剪刀剪成1mm³大小的组织块，放入无菌培养皿中。
2. 消化：向组织块中加入适量胰蛋白酶，在37℃水浴中消化10-15分钟。
3. 分散：用无菌吸管轻轻吹打组织块，使细胞离散成单个细胞。
4. 计数：用血球计数板计数细胞数量，计算细胞活力。
5. 洗涤：用Hank's液洗涤细胞悬液3次，去除未消化的组织碎片和残留的胰蛋白酶。
6. 调整细胞浓度：用DMEM培养基调整细胞浓度至1×10⁵细胞/毫升。
7. 接种：将细胞悬液接种于无菌培养皿中，放入培养箱中培养。
8. 观察：用显微镜观察细胞的生长状态，包括细胞形态、大小、核质比等。
五、实验结果1. 细胞形态：接种后24小时，可见细胞开始贴壁生长，细胞呈圆形、椭圆形或不规则形。
2. 细胞活力：计数结果显示，细胞活力达到95%以上。
3. 生长状态：接种后3-4天，细胞开始分裂增殖，形成致密的单层细胞。
六、实验讨论1. 胰蛋白酶消化法是单细胞制备的常用方法，具有操作简单、效率高等优点。
2. 消化时间和温度对细胞活力和细胞形态有重要影响。
消化时间过长或温度过高可能导致细胞损伤。
3. 细胞计数和活力检测是评估细胞质量的重要指标。
4. 单细胞制备是细胞生物学研究的重要基础，对于细胞培养、分子生物学研究等实验具有重要意义。
细胞传代培养实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞传代培养的基本操作流程。
2. 熟悉细胞传代培养过程中的注意事项。
3. 了解细胞传代培养在生物科学研究中的应用。
二、实验原理细胞传代培养是指将已经生长到一定阶段的细胞，通过特定的方法进行分离、洗涤、消化、计数和稀释等步骤，将细胞转移到新的培养容器中继续培养的过程。
细胞传代培养是维持细胞生长、扩大细胞数量和保持细胞特性的重要手段。
三、实验材料1. 细胞：HeLa细胞2. 培养基：DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清）3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、10%FBS、PBS缓冲液、酒精4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、移液枪、培养瓶/皿、吸管等四、实验步骤1. 准备阶段（1）将HeLa细胞从培养瓶中取出，用PBS缓冲液轻轻洗涤一次，去除残留的培养基。
（2）准备胰蛋白酶工作液，将其置于37℃水浴中预热。
（3）准备含有10%FBS的培养基，将其置于37℃水浴中预热。
2. 分离细胞（1）用移液枪吸取适量胰蛋白酶工作液，滴加到细胞培养皿中的细胞层上。
（2）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中消化2-3分钟。
（3）倒置显微镜下观察细胞，当大部分细胞变圆且亮时，加入等体积含有10%FBS的培养基终止消化。
（4）用移液枪轻轻吹打细胞，使其成为细胞悬液。
3. 计数（1）取适量细胞悬液，使用细胞计数仪或显微镜配合琼脂滴定法计数。
（2）根据计数结果，调整细胞密度至所需的浓度，一般为每毫升105-106个细胞。
4. 传代（1）向含有预热的培养基的离心管中加入细胞悬液，并轻轻混匀。
（2）离心管离心，在1500 rpm速度下离心3-5分钟，以沉淀细胞。
（3）弃去上清液，保留沉淀的细胞。
（4）加入适量的新鲜培养基，将细胞重新悬浮。
（5）将细胞悬液转移到新的培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
五、实验结果1. 成功完成细胞传代培养，观察到细胞在新的培养瓶中继续生长。
2. 细胞生长状态良好，细胞密度符合预期。
动物细胞培养用“胰蛋白酶”还是“胶原蛋白酶”2023——2024学年度第一学期高中生物学选择性必修三
动物细胞培养用“胰蛋白酶”还是“胶原蛋白酶”人教版高中生物学《选择性必修3·生物技术与工程》，对于细胞培养提到用“胰蛋白酶”、“胶原蛋白酶”处理，但没有说明二者区别并辨析相关原因。
从学生对相关问题的作答情况来看，不清楚“胰蛋白酶”和“胶原蛋白酶”的作用特点及情况。
那么，“胰蛋白酶”和“胶原蛋白酶”有什么区别？尽管胰蛋白酶和胶原蛋白酶都是细胞培养中常用于将体积较小的组织块分散成细胞团或单细胞的消化液，但它们的作用机制及适用情况并不相同。
1. 胰蛋白酶和胶原蛋白酶的作用特点1.1 胰蛋白酶的作用特点胰蛋白酶分离自牛、猪等动物的胰，作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽链，除去细胞间黏蛋白及糖蛋白，从而使细胞分离，是应用广泛的消化物，适于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织以及传代细胞等。
胰蛋白酶的消化作用与酶的浓度、pH、温度、组织块的大小以及组织的硬度都有关系。
胰蛋白酶浓度过大或消化时间太长，会导致细胞被消化；但反之消化不充分也达不到分散细胞的目的。
此外，血清明显抑制胰蛋白酶的活性，Ca2+和Mg2+对胰蛋白酶的活性有一定抑制作用。
1.2 胶原蛋白酶的作用特点胶原蛋白酶是能在一定的pH 和温度下切割胶原蛋白主体螺旋多肽链的酶类，主要用于水解结缔组织中的胶原蛋白，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。
当拟消化的组织较硬，内含较多的结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞效果较差，可采用胶原酶解离细胞法。
钙、镁离子以及血清不会影响胶原酶的消化作用，其消化作用缓和，且无需机械振荡（表1）。
与胰蛋白酶不同的是许多动物的组织细胞和微生物都是它的来源，其中细菌是微生物胶原蛋白的主要来源，已发现40 多种。
目前商业化提供的细菌胶原酶主要根据胶原酶活性的差异，分为 4 种类型：（1）胶原酶Ⅰ型：含有比较均匀的各种酶活力（包括胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性），通常用作上皮细胞、肝、肺、脂肪和肾上腺组织细胞的制备。
甲胰蛋白实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 探究甲胰蛋白对动物细胞培养的影响；2. 比较甲胰蛋白与对照实验的细胞生长情况；3. 评估甲胰蛋白在动物细胞培养中的应用价值。
二、实验原理甲胰蛋白是一种从胰腺中提取的蛋白酶，具有分解蛋白质的作用。
在动物细胞培养过程中，添加甲胰蛋白可能有助于细胞的生长和分裂。
本实验通过比较添加甲胰蛋白与未添加甲胰蛋白的细胞培养情况，评估甲胰蛋白对动物细胞培养的影响。
三、实验材料1. 活的小白鼠胚胎组织；2. 甲胰蛋白；3. 胰蛋白酶；4. 消毒灭菌的锥形瓶、培养皿；5. 培养液；6. 显微镜、细胞计数板等。
四、实验方法1. 制备细胞悬液：将小白鼠胚胎组织用胰蛋白酶处理，制成细胞悬浮液；2. 分组培养：将细胞悬液分为三组，A组添加甲胰蛋白，B组未添加甲胰蛋白，C 组作为对照；3. 培养过程：将三组细胞分别接种到锥形瓶中，放入培养箱中培养；4. 观察与记录：定期观察细胞生长情况，记录细胞数量、形态等指标；5. 数据分析：对实验数据进行统计分析，比较各组细胞生长情况的差异。
五、实验结果1. A组细胞生长旺盛，细胞数量逐渐增多，形态正常；2. B组细胞生长较慢，细胞数量较少，部分细胞形态异常；3. C组细胞生长情况与A组相似，但细胞数量略少于A组。
六、实验分析1. 添加甲胰蛋白的A组细胞生长旺盛，说明甲胰蛋白对动物细胞培养具有促进作用；2. 与未添加甲胰蛋白的B组相比，A组细胞数量更多，形态更正常，说明甲胰蛋白可以改善细胞培养条件；3. 与C组相比，A组细胞数量略少，可能是由于培养时间较短，细胞尚未达到最佳生长状态。
七、实验结论1. 甲胰蛋白对动物细胞培养具有促进作用，可以改善细胞培养条件；2. 在动物细胞培养中，添加甲胰蛋白可以提高细胞生长速度和细胞质量；3. 甲胰蛋白在动物细胞培养中具有一定的应用价值。
八、实验讨论1. 本实验结果表明，甲胰蛋白可以促进动物细胞生长，但具体作用机制尚需进一步研究；2. 在实际应用中，应根据细胞类型和培养条件，合理调整甲胰蛋白的添加量；3. 本实验仅研究了甲胰蛋白对动物细胞培养的影响，未来可以进一步研究其对其他细胞类型的影响。
细胞培养技术及其在医学研究中的应用
细胞培养技术及其在医学研究中的应用细胞培养技术是指将来自人类或动植物体内的细胞在实验室中进行体外培养的方法。
这种技术的出现标志着生命科学的一个重要里程碑。
近年来，随着生命科学的不断发展和深入研究，细胞培养技术在医学研究、药物开发等方面的应用越来越广泛。
本文主要介绍细胞培养技术的原理、基本方法及其在医学研究中的应用。
一、细胞培养技术的原理和基本方法1. 原理细胞培养技术的基本原理是利用体细胞生存和增殖所需的基础条件，包括合适的培养基、精细的温度控制、气体控制、营养物质和细胞因子等，来维持和促进人体或动植物体内的细胞生长。
细胞培养容器内提供适当的环境和养分，使细胞得以在体外进行生长和分裂。
而培养基的成分对于不同种类的细胞有很大影响，因此配方应该根据不同细胞的营养成分要求制定，以符合细胞生长的需要。
2. 基本方法细胞培养技术的基本方法分为两种：原代细胞培养和细胞系培养。
原代细胞培养指的是将组织中的细胞分离、培养，多次传代后达到规模才被称为细胞系。
而细胞系培养则是在已有的细胞系上进行传代，使其规模扩大。
细胞培养需要准备培养基、培养器具和酶解剂等。
实验操作中，通常采用胰蛋白酶对细胞进行消化，去除外在的细胞外基质以保证细胞发挥生理功能的正常性。
此外，为保证细胞在新的环境中正常生长，应注意以下因素：（1）培养条件控制：控制好实验室中的温度、湿度、 CO2 浓度等条件，以使细胞生长处于合适的环境中。
（2）培养前细胞处理：培养前的细胞处理包括细胞的分离、接种和培养基处理等，以保证细胞生长的顺利进行。
（3）细胞鉴定：细胞是人体的基本单元，不同细胞种类的形态和特性不同，根据形态学、免疫学及分子生物学等方法进行细胞鉴定，以确保实验的实施和结果的可靠性。
二、在医学研究中的应用细胞培养技术在医学研究中应用广泛，主要包括以下方面：1. 用于疾病诊断细胞培养技术可应用于细胞学诊断和生物化学诊断。
细胞学诊断依靠细胞形态学变化进行分类和诊断。
体外细胞的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在研究体外细胞培养技术，通过观察细胞在不同条件下的生长、形态变化和生物学特性，探讨细胞培养方法在生物学研究中的应用。
二、实验材料与仪器1. 材料：- 人胚胎肾细胞（HEK293细胞）- DMEM培养基- 胎牛血清（FBS）- 0.25%胰蛋白酶- 10%胎牛血清- 无菌培养皿- 移液器- 吸管- 显微镜- 紫外可见分光光度计2. 仪器：- 培养箱- 恒温培养箱- CO2培养箱三、实验方法1. 细胞培养：- 将HEK293细胞接种于无菌培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
- 每2-3天更换一次培养基。
2. 细胞传代：- 当细胞生长至80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞。
- 将收集到的细胞用DMEM培养基稀释至所需浓度，接种于新的培养皿中。
3. 细胞形态观察：- 使用显微镜观察细胞在不同培养时间下的形态变化。
- 拍照记录细胞形态。
4. 细胞活力检测：- 使用MTT法检测细胞活力。
- 将细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入MTT溶液，继续培养4小时。
- 使用酶标仪检测吸光度值。
5. 细胞增殖实验：- 将细胞接种于培养皿中，培养不同时间后，收集细胞，进行细胞计数。
- 计算细胞增殖率。
四、实验结果1. 细胞形态观察：- 初始接种的细胞呈梭形，细胞间连接紧密。
- 随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，细胞间连接变稀疏，部分细胞出现变圆、萎缩等现象。
2. 细胞活力检测：- 细胞活力随培养时间的延长而降低。
3. 细胞增殖实验：- 细胞增殖率随培养时间的延长而降低。
五、实验讨论本实验成功培养了HEK293细胞，并通过观察细胞形态、细胞活力和细胞增殖实验，初步了解了细胞在不同条件下的生物学特性。
细胞培养技术在生物学研究中具有重要意义，可以用于研究细胞生物学、分子生物学、药理学等领域。
六、实验结论1. 体外细胞培养技术可以成功培养HEK293细胞。
2. 细胞在不同培养条件下表现出不同的生物学特性。
原代细胞培养实验报告
3.1 材料和标本 乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)
3.2 器材和仪器 手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。
2.3 试剂 含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。
③．将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。
4.2.3 结果
一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
4.1.3 结果
细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
4.2 传代细胞培养
4.2.1 原理
体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
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天然产物研究与开发N at Prod R es D ev 2009,21:101121014文章编号:100126880(2009)0621011204 收稿日期:2009202216 接受日期:2009206202 基金项目:西北民族大学校级中青年项目(XBMU 220062BD 282)3通讯作者Tel:862931229383112609;E 2mail:li m ingsheng@xb mu .edu .cn胰蛋白酶的制备及其在细胞培养中的应用研究李明生13,李 倬1,乔自林1,冯若飞1,马忠仁1,冯玉萍1,侯兰新1,张福梅21西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室;2西北民族大学理科实验中心,兰州730030摘 要:无菌采集健康牛胰脏,用0.125mol/L 的硫酸对牛胰脏进行预处理和保存,并对原材料的细菌、真菌、内毒素、支原体、噬菌体和一些病毒外源因子进行检测,筛选合格原料。
通过盐析、C M 2Sephar ose 2FF 层析、超滤等方法对胰蛋白酶进行提取和纯化。
结果表明:经筛选原料提纯的胰蛋白酶通过细胞传代实验240h 后,细胞生长良好,形态正常,而未经筛选直接提取的胰蛋白酶通过细胞传代实验144h 后,细胞出现拉丝、病变等异常情况。
关键词:胰蛋白酶;原料;控制中图分类号:Q814.1;Q814.9;R285文献标识码:APrepara ti on and Trypsi n i n Cell Culture Appli ed ResearchL IM ing 2sheng 13,L I Zhuo 1,Q I A O Zi 2lin 1,FE NG Ruo 2fei 1,MA Zhong 2ren 1,FE NG Yu 2p ing 1,HOU Lan 2xin 1,ZHANG Fu 2mei21Key B io 2engineering &Technology L aboratory of S tate Ethnic A ffairs Co mm ission of N orthw est U niversity for N ationalities ;2Science Experi m ent Center of N orthw est U niversity for N ationalities,L anzhou 730030,ChinaAbstract:A sep tic acquisiti on healthy cattle pancreas,with 0.125mol/L sulfate of bovine pancreas p r ocessing and p res 2ervati on,and the ra w material of bacteria,fungi,endot oxin,Mycop las ma,phage and s ome virus detecti on of exogenous fact ors,screening qualified ra w materials .Thr ough salting 2out,FF 2C M 2Sephar ose chr omat ography,ultrafiltrati on method of tryp sin t o extract and purify,the results showed that the selecti on of ra w materials thr ough the purificati on of tryp sin and experi m ental cells 240h (5generati ons ),the cell gr owth good,nor malmor phol ogy,and without screening tryp sin di 2rectly fr om the cells thr ough the experi m ental 144h,the cells were drawing lesi ons such as abnor mal .Key words:tryp sin;ra w materials;contr ol 胰蛋白酶是一种动物来源的蛋白水解酶,广泛存在于动物的胰脏,是一些生物制药的主要原辅材料。
随着生物制药的不断发展,因胰蛋白酶质量问题造成生物制药的质量安全问题也越来越引起人们的关注。
目前,胰蛋白酶在细胞工程方面的应用主要体现在疫苗的生产与研究,最终产品直接或间接的用于人体,因此,胰蛋白酶的质量好坏直接关系到人类的健康,甚至生命安全。
要控制好胰蛋白酶的质量安全,对原材料的把关是关键,由于胰蛋白酶来源于生物体,其成分复杂,单靠检验标准很难达到质量安全。
一旦由胰蛋白酶途经带入,会大大影响到细胞培养,甚至影响到疫苗的产量和质量。
国内对细胞培养用胰蛋白酶制备尚不成熟,且大都对原材料没有进行严格的筛选,质量控制的研究内容也不够全面。
本实验选择健康的牛源,在无菌环境下进行采集牛胰脏;采用合理、有效、安全的方法对原材料进行处理和保存,并对采集的原料进行细菌、真菌、内毒素、支原体、噬菌体和一些病毒外源因子的检测,通过检验筛选合格的原料,为后续的胰蛋白酶提取工艺和质量控制提供保障。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 主要材料试剂牛胰脏、实验用所有细胞、实验用所有培养基(均由兰州民海生物工程有限公司提供)、N 2苯甲酰2L 2精氨酸乙酯盐酸盐(上海如吉科技发展有限公司)、胰蛋白酶1:250(Hycl one )、鲎试剂(湛江,安度斯)1.1.2 主要设备超滤仪(M illi pore,型号:XX8200230);层析装置(上海嘉鹏科技有限公司);;紫外/可见分光光度计(美国The mer,bi omate5);倒置相差显微镜(CK402 32PH,日本O ly mpus);生物安全柜(A3/B3,新加坡);层析柜(RE VCO;美国)1.1.3 对照品及菌种溶血性链球菌(S treptococcus he m olyticus)C M2 CC32210、白色念珠菌(Candida albicans) AT CC10231、大肠杆菌C3000(E.coli,中检所提供)、BVDV O regon C24V标准株(中国兽药监察所提供)、肺炎支原体(M.pneum oniae)ATCC15531、人型支原体(M.ho m inis)AT CC23714(上海汉尼生物有限公司);支原体、BVDV病毒外源因子、内毒素、噬菌体阴性血清(兰州民海生物工程有限公司提供)。
1.2 方法1.2.1 牛胰脏采集从牛颈动脉无菌采血致死,迅速去头剥皮后,将其移至层流罩下,开腹,无菌取出胰脏,去脂肪、结缔组织等,浸入预冷的0.125mol/L硫酸中,保存约30 m in,从酸中取出,绞成胰浆,按照《药典》2005版附录Ⅺ2J[1],取样约10g,其余迅速冷冻保存,同法采集5份,备用。
再以普通环境下采集牛胰脏,不浸入预冷的硫酸中,同法采集5份,备用。
1.2.2 原材料筛选将上述取样样品分别在无菌环境下研磨,并加入无菌生理盐水100mL,混匀,500r/m in离心5 m in,取全部上清后进行以下实验。
1.2.2.1 无菌检查依据《中华人民共和国药典》附录Ⅶ2A无菌检查法[1]。
1.2.2.2 细菌内毒素检查根据《中华人民共和国药典》附录Ⅻ2E,细菌内毒素检查方法[1]。
1.2.2.3 病毒外源因子2BVDV检测依据《中华人民共和国药典》细胞病变法[1]。
1.2.2.4 支原体检测依据《中华人民共和国药典》附录Ⅶ2A支原体检查法2培养法[1]。
1.2.2.5 大肠杆菌噬菌体检查取8mL胆盐乳糖增菌培养基加入1mL C3000菌液再加入2mL待检品,塞紧管口,置37℃振荡培养18h。
将无菌琼脂培养基在60℃水浴中完全溶化,取适量加入90mm培养皿中,备用。
铺板点样:取l mL大肠杆菌C3000菌液,加8mL 胆盐乳糖增菌培养基,混均,取适量加入(2)中备好的培养皿中,铺匀,将多余的菌液吸出,自然晾干置37℃恒温培养l h。
将(1)中经18h培养好的待检品经0.22μm过滤后点样,自然干燥后,置37℃恒温培养8h后判定结果。
待检样品如有噬菌体污染则出现噬菌斑,即判为阳性(+),反之判为阴性(2)。
1.2.3 胰蛋白酶原粗品的制备[2]1.2.4 胰蛋白酶原的活化[2]1.2.5 C M2sephar ose2FF离子交换层析取200mL C M2sephar ose2FF用蒸馏水将其保护液洗净即可。
其余方法参照文献[3]进行。
1.2.6 超滤浓缩纯化将层析液用蒸馏水40倍稀释,并参考文献[4],进行低压超滤。
2 结果2.1 胰蛋白酶原料微生物检查结果表1 胰蛋白酶原料微生物检查结果Table1 Result of sterility test on ra w meterial经无菌操作和硫酸处理样品Sa mp le are asep tic and p r ocessed by sulfuric acid普通操作未经硫酸处理样品None p r ocessing with sulfuric acid1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#阳性对照Positivecontr ol阴性对照Negativecontr ol无菌-----++++++-病毒外源因子-----±-+--+ -支原体------+--±+ -噬菌体-----++++++ - 注:“+”代表阳性,“-”代表阴性,“±”代表可疑。
Exp lanati on:+:Positive,-:Negative,±:Bet w een Positive and Negative.2101天然产物研究与开发 Vol1212.2 胰蛋白酶原料内毒素检查结果表2 胰蛋白酶原料内毒素检查结果Table2 Tryp sin ra w materials endot oxin test results内毒素含量(EU) Endot oxincontent经无菌操作和硫酸处理样品Sa mp le are asep tic and p r ocessed by sulfuric acid普通操作未经硫酸处理样品None p r ocessing with sulfuric acid1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#阳性对照Positive contr ol阴性对照Negative contr o<5+--+-++++++-5～10---+-++++++-10～50-----++++++-50～100-----++++-+-100～200------+++-+->200------++--+- 注:“+”,“-”代表内毒素含量在该范围内为阳性或阴性。