肿瘤细胞与分化、凋亡(三)
合集下载
肿瘤与细胞凋亡PPT课件
VS
机遇
随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学等 技术的发展，我们可以更深入地了解肿瘤 细胞凋亡的机制，发现新的治疗靶点。同 时，随着免疫治疗和基因治疗等新型治疗 方法的出现，也为肿瘤细胞凋亡的研究提 供了新的思路和手段。
肿瘤细胞凋亡研究的前沿技术与方法
单细胞测序技术
可以对单个细胞进行基因组、转 录组和蛋白质组测序，从而更准 确地了解肿瘤细胞凋亡的机制和 过程。
肿瘤与细胞凋亡PPT 课件
contents
目录
• 肿瘤概述 • 细胞凋亡概述 • 肿瘤与细胞凋亡的关系 • 肿瘤细胞凋亡的研究进展 • 展望与未来研究方向
01
肿瘤概述
肿瘤的定义与分类
肿瘤的定义
肿瘤是机体在各种致癌因素作用下， 局部组织的某一个细胞在基因水平上 失去对其生长的正常调控，导致其克 隆性异常增生而形成的新生物。
肿瘤细胞凋亡的信号转导通路研究
肿瘤细胞凋亡的信号转导通路
研究肿瘤细胞凋亡的信号转导通路，包括死亡受体通路、线粒体通路等，有助于揭示肿 瘤细胞凋亡的调控机制。
肿瘤细胞凋亡信号转导通路的调控
研究肿瘤细胞凋亡信号转导通路的调控，包括各种激酶、磷酸酶等对凋亡过程的调控作 用，有助于发现新的治疗策略。
肿瘤细胞凋亡与其他生物过程的相互作用研究
肿瘤细胞凋亡与自噬的相 互作用
研究肿瘤细胞凋亡与自噬之间的相互作用， 有助于深入了解肿瘤细胞的生存与死亡平衡 。
肿瘤细胞凋亡与免疫系统 的相互作用
研究肿瘤细胞凋亡与免疫系统之间的相互作 用，有助于发现新的免疫治疗策略。
05
展望与未来研究方向
肿瘤细胞凋亡研究的挑战与机遇
挑战
肿瘤细胞凋亡的机制复杂，涉及多种基 因和信号通路的相互作用，研究难度较 大。同时，肿瘤细胞常常通过多种途径 抵抗细胞凋亡，导致治疗难度增加。
细胞凋亡与细胞分化的关系分析
细胞凋亡与细胞分化的关系分析细胞凋亡和细胞分化是生物学中常见的两个概念。
虽然这两者并非完全相关，但它们是密切相关的。
本文旨在探讨细胞凋亡和细胞分化之间的关系。
一、什么是细胞凋亡？细胞在其生命周期中会发生许多机制，其中之一是细胞凋亡。
细胞凋亡是指一类可逆或不可逆的自我毁灭性机制，该机制存在于多种细胞类型中，包括免疫细胞、神经细胞和肿瘤细胞等。
细胞凋亡通常涉及几个关键步骤，包括形成凋亡体、克隆状变、核膜破裂、染色体脱离和细胞碎片的形成。
细胞凋亡的主要功能是清除老化、受损或有害的细胞，从而保护正常组织和生理环境。
二、什么是细胞分化？相比较细胞凋亡，细胞分化是一种细胞生命周期中的可逆性现象。
细胞分化是指原始、未分化的细胞转化为特定类型的细胞，从而执行特定的功能。
这种过程涉及许多变化和机制，如基因表达、蛋白质发生改变、细胞形态学变化和发育过程等。
当细胞分化后，它们会具有特定的形态和功能，如血液细胞、肌肉细胞和神经细胞等。
三、细胞凋亡与细胞分化的关系尽管细胞凋亡和细胞分化是两个不同的生物学现象，但它们之间的联系非常密切。
尽管这种联系仍未完全研究清楚，但是当前的理论认为，细胞凋亡和细胞分化之间存在以下关系：1. 调控细胞分化的因素可以通过影响细胞凋亡来调节细胞发育。
例如，细胞分化调节蛋白（DRGs）由于在神经元分化过程中起作用而被广泛研究。
此外，在这个过程中，细胞凋亡的发生率通常与细胞类型的生存和适应相关。
因此，在特定的细胞类型和环境中，细胞凋亡和细胞分化可能会紧密相互作用。
2. 细胞凋亡和细胞分化之间的紧密联系可以通过一些共同的分子机制来解释。
例如，c-Myc和bcl-2是两种在细胞凋亡和细胞分化之间均起作用的蛋白质。
c-Myc 在细胞分化前通过促进细胞增殖来影响细胞生长，而bcl-2可以通过抑制细胞凋亡来保持细胞稳态。
3. 细胞凋亡和细胞分化也在发育过程中扮演着重要角色。
在胚胎发育过程中，凋亡可以使细胞处于正确的地址分化；而在某些生殖器官中，细胞凋亡则有助于调节器官大小和形态。
细胞分化、衰老、凋亡和癌变
只有在红细胞中，控制血红蛋白合成的基因才能选
择性的表达。而其他选项中的ATP合成酶基因、
DNA解旋酶基因、核糖体蛋白基因是在每一个具有
生命活动的细胞中都要表达而分别合成ATP合成酶、
DNA解旋酶、核糖体蛋白。
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
考点二 细胞的凋亡、坏死与癌变的比较
答案 （1）在个体发育过程中，遗传信息的执行情 况不同（或基因的选择性表达） （2）细胞含有一 整套的遗传信息 （3）分裂 分化 糖蛋白 （4）①利用皮肤干细胞可以避开利用胚胎干细胞面 临的伦理争议 ②皮肤细胞可以取自自体，不会发生 排斥反应 ③皮肤细胞比胚胎细胞更容易采集（其他 合理答案也可，任选两点）
第二讲 细胞分化、衰老、凋亡和癌变
一、细胞的分化
1.实质：是基因 选择性表达 的结果，遗传物质没有
发生改变。
2.结果：一个或一种细胞增殖的后代细胞在 形态 、
结构 和
上发生稳定性差异，功能进一步特异
化。
3.特点
（1）生物界普遍存在。
（2）可持久贯穿于生物体整个生命进程中，是不可
逆的。
二、细胞的全能性 1.高度分化的细胞仍然具有本物种全套遗传物质 ， 即具有发育成完整个体的潜能。 2.已分化的 植物细胞 和动物细胞核的全能性已得到 了证实。 三、衰老细胞的主要特征 1.结构表现：细胞 变小而细胞核 变大 ，细胞膜通透 性改变，核膜内折，染色质收缩、染色 加深 。 2.代谢表现：水分 减少 ，新陈代谢速率减慢，物质 运输速率 降低 ，酶的活性降低， 色素积累 。
例1（09·天河区测试）对于多细胞生物而言，下列 有关细胞生命历程的说法，正确的是 ( C ) A.细胞分化导致细胞中的遗传物质发生改变 B.细胞癌变是所有细胞都要经历的一个阶段 C.细胞衰老时细胞呼吸的速率减慢 D.细胞死亡是细胞癌变的结果 解析 细胞分化的实质是基因进行选择性表达；细 胞死亡是所有的细胞都要经历的一个阶段；细胞癌 变是某些细胞原癌基因被激活导致的。
肿瘤的诱导分化和凋亡疗法
个体化治疗
根据患者的具体情况，制定个性化的联合治疗方案，以提高治疗效果和患者的生存质量。
深入研究
进一步深入研究诱导分化与凋亡疗法的机制和相互作用，为临床应用提供更可靠的依据。
联合疗法的未来发展方向
04
肿瘤干细胞与诱导分化凋亡疗法
肿瘤干细胞
肿瘤组织中具有自我更新、多向分化潜能的细胞群体，是肿瘤发生、发展、复发和耐药的重要原因。
谢谢观看
肿瘤细胞凋亡受到基因的调控，包括癌基因和抑癌基因等。
基因调控
凋亡信号通过一系列信号转导途径传递，最终激活凋亡酶，导致细胞死亡。
信号转导
细胞代谢异常可能导致细胞凋亡，如能量代谢失衡、蛋白质合成异常等。
细胞代谢
肿瘤细胞凋亡的机制
诱导分化
通过药物或其他手段诱导肿瘤细胞向正常细胞分化，从而抑制肿瘤生长。
优势
诱导分化与凋亡疗法的联合应用可以同时从多个方面攻击肿瘤，提高治疗效果。此外，这种联合疗法还可以降低单一疗法的剂量，减少副作用和毒性。
挑战
联合疗法需要精确控制两种疗法的剂量和时机，以实现最佳的治疗效果。此外，由于不同肿瘤的性质和特点不同，需要对不同的患者进行个体化的治疗方案设计。
创新药物
开发更高效、低毒的诱导分化与凋亡治疗药物，提高治疗效果。
部分临床试验结果显示，诱导分化凋亡疗法对部分肿瘤具有较好的疗效，能够显著缩小肿瘤体积，延长患者生存期。
试验结果
患者情况
治疗过程
结论
成功案例分享
一位中年女性患者，被诊断为晚期肺癌，经过传统的化疗和放疗后病情仍未得到控制。
在医生的建议下，患者接受了诱导分化凋亡疗法。经过几个疗程的治疗，患者的肿瘤明显缩小，症状得到显著改善。
02
根据患者的具体情况，制定个性化的联合治疗方案，以提高治疗效果和患者的生存质量。
深入研究
进一步深入研究诱导分化与凋亡疗法的机制和相互作用，为临床应用提供更可靠的依据。
联合疗法的未来发展方向
04
肿瘤干细胞与诱导分化凋亡疗法
肿瘤干细胞
肿瘤组织中具有自我更新、多向分化潜能的细胞群体，是肿瘤发生、发展、复发和耐药的重要原因。
谢谢观看
肿瘤细胞凋亡受到基因的调控，包括癌基因和抑癌基因等。
基因调控
凋亡信号通过一系列信号转导途径传递，最终激活凋亡酶，导致细胞死亡。
信号转导
细胞代谢异常可能导致细胞凋亡，如能量代谢失衡、蛋白质合成异常等。
细胞代谢
肿瘤细胞凋亡的机制
诱导分化
通过药物或其他手段诱导肿瘤细胞向正常细胞分化，从而抑制肿瘤生长。
优势
诱导分化与凋亡疗法的联合应用可以同时从多个方面攻击肿瘤，提高治疗效果。此外，这种联合疗法还可以降低单一疗法的剂量，减少副作用和毒性。
挑战
联合疗法需要精确控制两种疗法的剂量和时机，以实现最佳的治疗效果。此外，由于不同肿瘤的性质和特点不同，需要对不同的患者进行个体化的治疗方案设计。
创新药物
开发更高效、低毒的诱导分化与凋亡治疗药物，提高治疗效果。
部分临床试验结果显示，诱导分化凋亡疗法对部分肿瘤具有较好的疗效，能够显著缩小肿瘤体积，延长患者生存期。
试验结果
患者情况
治疗过程
结论
成功案例分享
一位中年女性患者，被诊断为晚期肺癌，经过传统的化疗和放疗后病情仍未得到控制。
在医生的建议下，患者接受了诱导分化凋亡疗法。经过几个疗程的治疗，患者的肿瘤明显缩小，症状得到显著改善。
02
细胞分化与肿瘤
细胞分化与肿瘤 从受精卵发育成动物个体是通过细胞生长、分裂、死亡和分化实现的，通过细胞分化产生不同的细胞类型。是胚胎细胞分裂后未定型的细胞，在形态和生化组成上向专一和特异方向分化，或由原来较简单，具有可塑性状态向异样化、稳定状态进行分化的过程。
细胞分化（cell differentiation）是指同源细胞逐渐发育为具有稳定状态、生理功能和生化特征的另一类细胞过程。狭义讲，这种功能和形态学上逐渐特化的过程就是分化。如受精卵通过细胞分裂，经桑葚胚、中胚和原胚形成期等形成内、中、外三个胚层的细胞，这时胚层的细胞合成潜力已经受到限制。由于细胞空间关系和微环境的变化，它们只倾向发育为相应的终分化细胞，并逐渐衍生出来组织器官的轮廓。
（三 ）位置效应和细胞－细胞间的相互作用 在胚胎发育和器官形成过程中，细胞的发育分化取决于细胞所处的位置及相邻细胞所能提供的物质。 细胞粘附分子（CAM）可能具有重要意义。如钙粘连蛋白(cadherin)在维持成人上皮组织的完整性，促进细胞之间的结合方面起着关键作用。
CAM基因的表达随着细胞分化程度而发生改变。CAM作为一个细胞的受体，同时又可作为另一个细胞的配体。 内钙离子和PH 某些刺激生长的药物引起细胞分裂增殖的同时常伴有暂时性钙离子内流和细胞内PH升高。
(一)、基因的活化
真核生物DNA与组蛋白和非组蛋白组成具有紧密结合蛋白质，使RNA聚合酶不能和DNA链接触而启动转录。因此，基因的活化首先要求待活化基因所处的染色体松解，以保证RNA聚合酶直接结合相应的DNA链。细胞分化过程中，基因活化的高度特异性决定了相应部位染色质松解的特异性。这一特异的染色体松解过程涉及一系列相关事件。
包括 松解染色体DNA的５’端和３’端，产生对DNA酶１（DNase1）敏感或高敏感区域。其中，Dnase1高敏感区域大多位于待转录基因的５’旁区 。 高迁移组分（HMC）等非组蛋白与染色体特定部位的结合 DNA的甲基化和螺旋结构改变等。
细胞分化和肿瘤课件
细胞分化和肿瘤
3
肿瘤细胞:
细胞发生突变或失去控制，其分化程序发生 异常。失控的增殖和分化障碍。缺乏成熟的形态 和完整的功能，丧失某些终未分化细胞性状，对 正常的分化调节机制缺乏反应，增殖迅速
细胞分化和肿瘤
4
与细胞恶性增殖或凋亡受阻一样， 细胞分化异常在恶性肿瘤发病学上占有 重要地位。深入研究细胞分化及其异常 的发生机制可能为恶性肿瘤的治疗提供 新的手段。
在发育过程中，细胞分化潜能出现局限，失去 了发育成完整个体的能力，只具有分化成多种 细胞类型及构建组织的潜能，称细胞的多能性。
如中胚层细胞分化为本胚层的多种组织。
细胞分化和肿瘤
17
细胞的单能性(monopotency) ：
有的细胞只能分化为一种特定的细胞，如单能 造血干细胞，红系干细胞只能分化为红细胞， 这种分化潜能称之。
细胞分化与肿瘤
四川大学华西医院 肿瘤分子诊断研究室
王艳萍
细胞分化和肿瘤
1
增殖（proliferation）和分化 (differentiation)是细胞的两种基本生 命属性。
增殖: 使细胞数量增多
分化: 机体结构和功能多样化，形成 不同类型的细胞。
细胞分化和肿瘤
2
正常细胞 :
增殖与分化在时间和空间上严密协调 运行，分化基因按一定时空顺序有选择地 被激活或抑制，产生具有特殊功能的细胞。 分化基因有效调控着细胞的分裂和增殖。
全能性细胞:可表达基因组中任何基因，分化为个体的任一种细胞。 如受精卵,早期胚胎细胞
细胞分化和肿瘤
13
高度分化的植物细胞仍然有发育成完整植物株的能力(1958年， Steward,胡萝卜)
已分化的细胞→ 去分化（dedifferentiation）→重新分裂，回复到 胚胎细胞状态→再分化（redifferentiation）→形成根、茎→发育 成完整新植株
肿瘤的诱导分化和凋亡疗法
em cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。
01
干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞
02
干细胞
传统观念认为,肿瘤是由体细胞突变而成,每个肿瘤细胞都可以无限制地生长。但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象
Therapeutic implications of Cancer Stem Cells
Most therapies fail to consider the difference in drug sensitivities of cancer stem cells compared to their non-tumorigenic progeny. Most therapies target rapidly proliferating non-tumorigenic cells and spare the relatively quiescent cancer stem cells.
Distinct classes of cells exist within a tumor. Only a small definable subset, the cancer stem cells can initiate tumor growth.
Two General Models for Cancer Heterogeneity异质性
Origin of the Theory of Cancer Stem Cells
Only a small subset of cancer cells is capable of extensive proliferation Liquid Tumors In vitro colony forming assays: - 1 in 10,000 to 1 in 100 mouse myeloma cells obtained from ascites away from normal hematopoietic cells were able to form colonies In vivo transplantation assays: - Only 1-4% of transplanted leukaemic cells could form spleen colonies Solid Tumors - A large number of cells are required to grow tumors in xenograft models - 1 in 1,000 to 1 in 5,000 lung cancer, neuroblastoma cells, ovarian cancer cells, or breast cancer cells can form colonies in soft agar or in vivo
01
干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞
02
干细胞
传统观念认为,肿瘤是由体细胞突变而成,每个肿瘤细胞都可以无限制地生长。但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象
Therapeutic implications of Cancer Stem Cells
Most therapies fail to consider the difference in drug sensitivities of cancer stem cells compared to their non-tumorigenic progeny. Most therapies target rapidly proliferating non-tumorigenic cells and spare the relatively quiescent cancer stem cells.
Distinct classes of cells exist within a tumor. Only a small definable subset, the cancer stem cells can initiate tumor growth.
Two General Models for Cancer Heterogeneity异质性
Origin of the Theory of Cancer Stem Cells
Only a small subset of cancer cells is capable of extensive proliferation Liquid Tumors In vitro colony forming assays: - 1 in 10,000 to 1 in 100 mouse myeloma cells obtained from ascites away from normal hematopoietic cells were able to form colonies In vivo transplantation assays: - Only 1-4% of transplanted leukaemic cells could form spleen colonies Solid Tumors - A large number of cells are required to grow tumors in xenograft models - 1 in 1,000 to 1 in 5,000 lung cancer, neuroblastoma cells, ovarian cancer cells, or breast cancer cells can form colonies in soft agar or in vivo
肿瘤细胞程序性死亡的调控机制
肿瘤细胞程序性死亡的调控机制引言：肿瘤发生是由于细胞内部调控失衡，导致细胞无法按照正常的生长、分化和凋亡程序进行。
其中，肿瘤细胞的过度增殖和抗凋亡特点是其突出表现。
而细胞程序性死亡（Programmed cell death, PCD）是生物体内维持组织平衡的重要方式之一，可以有效限制异常细胞扩散，并保持机体稳态。
本文将介绍肿瘤细胞程序性死亡的调控机制。
一、外源性通路：凋亡受体介导的途径在肿瘤发展中，凋亡途径受到多种因素的影响和干扰，其中外源性通路通过凋亡受体介导来诱导肿瘤细胞死亡。
1. 肿瘤壁因子引发凋亡许多激素类物质在触发外源性通路中起着重要作用。
例如TNF（Tumor Necrosis Factor），与其相关受体相结合后形成复合物，激活下游信号通路并最终导致凋亡的发生。
2. 凋亡受体介导的细胞凋亡肿瘤细胞死亡还可以通过其他外源性通路诱导，如CD95/FasL、TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand)等。
这些凋亡受体与其配体结合后，触发一系列下游信号通路激活，其中包括半胱氨酸蛋白酶家族(caspase)活化，从而引发肿瘤细胞程序性死亡。
二、内源性通路：线粒体引发的凋亡途径线粒体是程序性细胞死亡中的重要参与器官，其释放的多种因子能够激活下游信号分子并促进凋亡过程。
1. 线粒体通途及Bcl-2家族蛋白调控线粒体因缺氧、DNA损伤、药物应激等原因而失去稳定的内环境时，将会释放细胞色素c（cytochrome c）。
释放的细胞色素c可以结合APAF1（Apoptotic protease activating factor 1）形成"细胞色素c-Apaf-1-caspase9"复合物，在复合物中激活caspase9，并最终激活caspase3促进凋亡过程。
此外，Bcl-2家族蛋白是调控程序性细胞死亡的重要因子，包括抑制凋亡的Bcl-2和促进凋亡的Bax等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞凋亡的生物学意义
1 2 3 4 胚胎发育和形态发生 细胞稳态和免疫机制 衰老 肿瘤发生及化学治疗
细胞凋亡和恶性肿瘤
1 Bcl-2和恶性肿瘤 - 和恶性肿瘤 2 P53和恶性肿瘤 和恶性肿瘤 3Bcr-abl和恶性肿瘤 和恶性肿瘤 4 PML-RARα蛋白和恶性肿瘤 蛋白和恶性肿瘤
细胞凋亡干预和肿瘤治疗
3 透射电镜观察
未处理的HL 60细胞 HL图8A 未处理的HL-60细胞 透射电镜× 透射电镜×6000
DADS处理的HL-60细胞 处理的HL 图8B DADS处理的HL-60细胞 透射电镜× 透射电镜×6000
4 DNA断片法或称琼脂糖凝胶电泳"梯形条带"图谱法 断片法或称琼脂糖凝胶电泳" 断片法或称琼脂糖凝胶电泳 梯形条带"
荧光显微镜观察
未处理的HL 60细胞 HL图9A 未处理的HL-60细胞 吖啶橙 ×40
DADS处理的HL-60细胞 处理的HL 图9B DADS处理的HL-60细胞 吖啶橙 ×40
3 电子显微镜观察法
电镜下超微结构观察虽可显示凋亡细胞的许多特 点,如膜发泡和某些结构如微纤毛的丢失,染色质固 缩和线粒体超浓缩等,但由于样本制备复杂,耗时, 该项技术主要用于获取细胞凋亡的定性检测.
细胞凋亡死亡受体相关信号途径
细胞凋亡死亡受体相关信号途径
表3 序号 Caspase-1 Caspase-2 Caspase-3 Caspase-4 Caspase-5 Caspase-6 Caspase-7 Caspase-8 Caspase-9 Caspase-10 Caspase-11 Caspase-12 Caspase-13 Caspase-14 caspase 家族主要成员 功能 辅助炎症 凋亡反应 凋亡反应 辅助促炎症 辅助促炎症 凋亡反应 凋亡反应 凋亡反应 凋亡反应 凋亡反应 底物特异性 WEHD DEXD DEXD WEHD WEHD (I/L/V)EXD DEXD (I/L/V)EXD (I/L/V)EXD 原名 ICE ICH-1 CPP32,Yama,apopain ICErel-Ⅱ,TX,ICH-2 Ⅱ ICErel-Ⅲ,TY Ⅲ Mch-3 Mch-3,ICE-LAP3,CMH-1 FLICE,MACH,Mch-5 ICE-LAP6.Mch6 Mch4 ICH-3 ERICH MICE(Mini-ICE)
细胞凋亡线粒体相关信号途径 MMP开放 开放
Porin 线粒体外膜 Cyclophilin D
PBR
ANT △φm 下降
Cyto C/Apaf-1/procaspase-9
AIF caspase-9-caspase-8
caspase-3
apoptosis
Bax
MitoTracker
overlay
HL-60
Time(h)
0
1
2
4
8
24
Pro-caspase3
Pro-caspase9
Cyt-c
GAPDH
作用HL-60细胞后 细胞后caspase3的表达变化 图30 DADS作用 作用 细胞后 的表达变化
K562 Time(h) 0 1 2 4 8 24
Pro-caspase3 Pro-caspase9 Cyt-c GAPDH
1 野生型 野生型P53基因介导的肿瘤治疗 基因介导的肿瘤治疗 2 Bcl-2基因介导的肿瘤治疗 - 基因介导的肿瘤治疗 3 泛素-蛋白酶体降解途径介导的肿瘤治疗 泛素- 4 三氧化二砷介导的血液系统恶性肿瘤治疗 5 DADS诱导肿瘤细胞凋亡 诱导肿瘤细胞凋亡
细胞凋亡的检测方法
1 台肦蓝(trypan blue)染色法 台肦蓝( 染色法
原理: 是一种细胞膜非通透性染料. 原理:trypan blue 是一种细胞膜非通透性染料.坏死 细胞因细胞膜受损而被台肦蓝着色染色.因此, 细胞因细胞膜受损而被台肦蓝着色染色.因此,该法能 区分细胞的生存状态,简单,便捷,常规用于细胞死亡 区分细胞的生存状态,简单,便捷, 的初步评价和细胞存活率评价. 的初步评价和细胞存活率评价. 注意事项: 注意事项:该法不能区别继发性坏死和真正意义上的 坏死细胞;也容易低估细胞死亡程度.(因为早期凋亡 坏死细胞;也容易低估细胞死亡程度.(因为早期凋亡 .( 细胞具有完整的细胞膜而被误当作活细胞) 细胞具有完整的细胞膜而被误当作活细胞)
3.3 流式细胞仪检测凋亡率
35 30 apoptotic cells(%) 25 20 15 10 5 0
untreated PD SB DADS5 DADS10 DADS10+PD DADS10+SB
Fig15 Effects of SB205980 and PD98059 on DADS -induced apoptosis in HL-60 cells
作用K562细胞后 细胞后caspase3的表达变化 图31 DADS作用 作用 细胞后 的表达变化
Raji Time(h) 0 1 2 4 8 24
Pro-caspase3 Pro-caspase9 Cyt-c GAPDH
作用Raji细胞后 细胞后caspase3的表达变化 图32 DADS作用 作用 细胞后 的表达变化
图5 不同浓度DADS作用HL-60 不同浓度DADS作用 作用HL 细胞24h后DNA梯状条带的形成 细胞24h后DNA梯状条带的形成
图6 60 molL-1 DADS作用HL-60 DADS作用 作用HL 细胞不同时间后DNA梯状条带的 细胞不同时间后DNA梯状条带的 形成
转移酶dUTP缺口末端标记法) 缺口末端标记法) 5.TUNEL法(末端 法 末端DNA转移酶 转移酶 缺口末端标记法
内源性细胞凋亡抑制物
1 Caspase-8(FLICE)抑制蛋白(FLIP) 抑制蛋白( - ( 抑制蛋白 2 SODD(silencer of death domain) 3 IAP(inhibitor of apoptosis protein) ( 4 Survivin 5 Bcl-2家族蛋白 家族蛋白
2.丫啶橙染色(acridine orange, 2.丫啶橙染色( 丫啶橙染色 bromide, EB)双染法 EB)双染法
AO)和溴化乙啶(ethidium AO)和溴化乙啶 和溴化乙啶(ethidium
原理:AO和EB都是结合 都是结合DNA的荧光染料 的荧光染料, 原理:AO和EB都是结合DNA的荧光染料,分别产生蓝色 和橙色荧光.其中,AO能透过完整的细胞膜,而EB则只 能透过完整的细胞膜, EB则只 和橙色荧光.其中,AO能透过完整的细胞膜 能染色胞膜受损的细胞.因此, AO/EB双染法能借助荧光 能染色胞膜受损的细胞.因此, AO/EB双染法能借助荧光 显微镜或流式细胞仪区分活细胞或早期凋亡细胞和坏死或 继发性坏死细胞. 继发性坏死细胞. 注意事项:应用单一形态学计数凋亡细胞数( 注意事项:应用单一形态学计数凋亡细胞数(凋亡指 数,apoptosis index)常受到主观因素的干扰,其个体间甚 index)常受到主观因素的干扰 常受到主观因素的干扰, 至同一主体的重复性较差. 测结果 TUNEL检测结果
HL图10A 未处理的HL-60细胞 10A 未处理的HL 60细胞 TUNEL ×20
处理的HL 图10B DADS处理的HL-60细胞 10B DADS处理的HL-60细胞 TUNEL ×20
6 PI染色流式细胞术测定凋亡率 染色流式细胞术测定凋亡率
原理:实验证明凋亡细胞在固定和清洗过程中降解的小分 原理: 外漏, 含量减少.因此, 子量DNA 外漏,导致细胞内DNA含量减少.因此,应用DNA 特异荧光染料(如碘化丙啶, 染色后, 特异荧光染料(如碘化丙啶,propidium iodide, PI)染色后, 进行的细胞周期分析中, 在FCM进行的细胞周期分析中,凋亡细胞常以亚二聚体形式出 细胞. 现.亚二倍体细胞群被称为亚G1期(sub-G1)细胞.它的出现 被认为是凋亡细胞的重要标志. 被认为是凋亡细胞的重要标志. 注意事项: 期细胞的同时, 注意事项:识别亚G1期细胞的同时,必须将它和细胞碎 片区分开来, 期细胞. 片区分开来,因为细胞碎片的DNA含量也明显低于G1期细胞.
MMP开放和caspase活化的"正反馈"环
膜间蛋白(如 AIF)释放 线粒体膜 屏障 功能破坏
MMP开放
刺激ceremide酶活化 剪切MMP复合物 Caspase-3活化
线粒体肿胀
Caspase-9活化 凋亡诱导剂
Cyoto C释放
Apoptosome (procaspase-9/Apaf-1/Cyto C) 结 合 Apaf-1 procaspase-9 和
图12 PI/Anexin-V双染色流式细胞仪检测DADS作用 PI/Anexin- 双染色流式细胞仪检测DADS作用 K562细胞 K562细胞12h后凋亡率的改变 细胞12h后凋亡率的改变
图13 流式细胞仪检测DADS作用K562细胞24h,48h后的凋亡率改变 流式细胞仪检测DADS作用 作用K562细胞 细胞24h,48h
原理:凋亡细胞的基因组DNA常首先被剪切为200300kb和30-50kb的片断("结构域式"剪切),再进一步 降解产生大小相当于核小体(160-200bp)的倍数的寡核小体 片断("裂解"/"梯子式"剪切).因此,在琼脂糖凝胶 电泳图谱上凋亡细胞表现为特征性"梯子"样外观. 注意事项:梯状DNA(DNA ladder)现象常被看作是细 胞凋亡的重要生物化学标志.但是,日益增多的资料显示 并不是所有表现凋亡形态学特征的细胞都是呈现这种梯子 样外观.因此,缺乏梯状DNA并不能排除细胞凋亡的存在. 据报道,某些细胞系如K562细胞凋亡常发生单链而不是双 链DNA降解,故不能形成"DNA ladder".另外,一般凋 亡率要在15%以上才能呈现典型"DNA ladder" .故有 DNA ladder可以肯定凋亡存在,没有DNA ladder不能排 除凋亡的存在.
1 2 3 4 胚胎发育和形态发生 细胞稳态和免疫机制 衰老 肿瘤发生及化学治疗
细胞凋亡和恶性肿瘤
1 Bcl-2和恶性肿瘤 - 和恶性肿瘤 2 P53和恶性肿瘤 和恶性肿瘤 3Bcr-abl和恶性肿瘤 和恶性肿瘤 4 PML-RARα蛋白和恶性肿瘤 蛋白和恶性肿瘤
细胞凋亡干预和肿瘤治疗
3 透射电镜观察
未处理的HL 60细胞 HL图8A 未处理的HL-60细胞 透射电镜× 透射电镜×6000
DADS处理的HL-60细胞 处理的HL 图8B DADS处理的HL-60细胞 透射电镜× 透射电镜×6000
4 DNA断片法或称琼脂糖凝胶电泳"梯形条带"图谱法 断片法或称琼脂糖凝胶电泳" 断片法或称琼脂糖凝胶电泳 梯形条带"
荧光显微镜观察
未处理的HL 60细胞 HL图9A 未处理的HL-60细胞 吖啶橙 ×40
DADS处理的HL-60细胞 处理的HL 图9B DADS处理的HL-60细胞 吖啶橙 ×40
3 电子显微镜观察法
电镜下超微结构观察虽可显示凋亡细胞的许多特 点,如膜发泡和某些结构如微纤毛的丢失,染色质固 缩和线粒体超浓缩等,但由于样本制备复杂,耗时, 该项技术主要用于获取细胞凋亡的定性检测.
细胞凋亡死亡受体相关信号途径
细胞凋亡死亡受体相关信号途径
表3 序号 Caspase-1 Caspase-2 Caspase-3 Caspase-4 Caspase-5 Caspase-6 Caspase-7 Caspase-8 Caspase-9 Caspase-10 Caspase-11 Caspase-12 Caspase-13 Caspase-14 caspase 家族主要成员 功能 辅助炎症 凋亡反应 凋亡反应 辅助促炎症 辅助促炎症 凋亡反应 凋亡反应 凋亡反应 凋亡反应 凋亡反应 底物特异性 WEHD DEXD DEXD WEHD WEHD (I/L/V)EXD DEXD (I/L/V)EXD (I/L/V)EXD 原名 ICE ICH-1 CPP32,Yama,apopain ICErel-Ⅱ,TX,ICH-2 Ⅱ ICErel-Ⅲ,TY Ⅲ Mch-3 Mch-3,ICE-LAP3,CMH-1 FLICE,MACH,Mch-5 ICE-LAP6.Mch6 Mch4 ICH-3 ERICH MICE(Mini-ICE)
细胞凋亡线粒体相关信号途径 MMP开放 开放
Porin 线粒体外膜 Cyclophilin D
PBR
ANT △φm 下降
Cyto C/Apaf-1/procaspase-9
AIF caspase-9-caspase-8
caspase-3
apoptosis
Bax
MitoTracker
overlay
HL-60
Time(h)
0
1
2
4
8
24
Pro-caspase3
Pro-caspase9
Cyt-c
GAPDH
作用HL-60细胞后 细胞后caspase3的表达变化 图30 DADS作用 作用 细胞后 的表达变化
K562 Time(h) 0 1 2 4 8 24
Pro-caspase3 Pro-caspase9 Cyt-c GAPDH
1 野生型 野生型P53基因介导的肿瘤治疗 基因介导的肿瘤治疗 2 Bcl-2基因介导的肿瘤治疗 - 基因介导的肿瘤治疗 3 泛素-蛋白酶体降解途径介导的肿瘤治疗 泛素- 4 三氧化二砷介导的血液系统恶性肿瘤治疗 5 DADS诱导肿瘤细胞凋亡 诱导肿瘤细胞凋亡
细胞凋亡的检测方法
1 台肦蓝(trypan blue)染色法 台肦蓝( 染色法
原理: 是一种细胞膜非通透性染料. 原理:trypan blue 是一种细胞膜非通透性染料.坏死 细胞因细胞膜受损而被台肦蓝着色染色.因此, 细胞因细胞膜受损而被台肦蓝着色染色.因此,该法能 区分细胞的生存状态,简单,便捷,常规用于细胞死亡 区分细胞的生存状态,简单,便捷, 的初步评价和细胞存活率评价. 的初步评价和细胞存活率评价. 注意事项: 注意事项:该法不能区别继发性坏死和真正意义上的 坏死细胞;也容易低估细胞死亡程度.(因为早期凋亡 坏死细胞;也容易低估细胞死亡程度.(因为早期凋亡 .( 细胞具有完整的细胞膜而被误当作活细胞) 细胞具有完整的细胞膜而被误当作活细胞)
3.3 流式细胞仪检测凋亡率
35 30 apoptotic cells(%) 25 20 15 10 5 0
untreated PD SB DADS5 DADS10 DADS10+PD DADS10+SB
Fig15 Effects of SB205980 and PD98059 on DADS -induced apoptosis in HL-60 cells
作用K562细胞后 细胞后caspase3的表达变化 图31 DADS作用 作用 细胞后 的表达变化
Raji Time(h) 0 1 2 4 8 24
Pro-caspase3 Pro-caspase9 Cyt-c GAPDH
作用Raji细胞后 细胞后caspase3的表达变化 图32 DADS作用 作用 细胞后 的表达变化
图5 不同浓度DADS作用HL-60 不同浓度DADS作用 作用HL 细胞24h后DNA梯状条带的形成 细胞24h后DNA梯状条带的形成
图6 60 molL-1 DADS作用HL-60 DADS作用 作用HL 细胞不同时间后DNA梯状条带的 细胞不同时间后DNA梯状条带的 形成
转移酶dUTP缺口末端标记法) 缺口末端标记法) 5.TUNEL法(末端 法 末端DNA转移酶 转移酶 缺口末端标记法
内源性细胞凋亡抑制物
1 Caspase-8(FLICE)抑制蛋白(FLIP) 抑制蛋白( - ( 抑制蛋白 2 SODD(silencer of death domain) 3 IAP(inhibitor of apoptosis protein) ( 4 Survivin 5 Bcl-2家族蛋白 家族蛋白
2.丫啶橙染色(acridine orange, 2.丫啶橙染色( 丫啶橙染色 bromide, EB)双染法 EB)双染法
AO)和溴化乙啶(ethidium AO)和溴化乙啶 和溴化乙啶(ethidium
原理:AO和EB都是结合 都是结合DNA的荧光染料 的荧光染料, 原理:AO和EB都是结合DNA的荧光染料,分别产生蓝色 和橙色荧光.其中,AO能透过完整的细胞膜,而EB则只 能透过完整的细胞膜, EB则只 和橙色荧光.其中,AO能透过完整的细胞膜 能染色胞膜受损的细胞.因此, AO/EB双染法能借助荧光 能染色胞膜受损的细胞.因此, AO/EB双染法能借助荧光 显微镜或流式细胞仪区分活细胞或早期凋亡细胞和坏死或 继发性坏死细胞. 继发性坏死细胞. 注意事项:应用单一形态学计数凋亡细胞数( 注意事项:应用单一形态学计数凋亡细胞数(凋亡指 数,apoptosis index)常受到主观因素的干扰,其个体间甚 index)常受到主观因素的干扰 常受到主观因素的干扰, 至同一主体的重复性较差. 测结果 TUNEL检测结果
HL图10A 未处理的HL-60细胞 10A 未处理的HL 60细胞 TUNEL ×20
处理的HL 图10B DADS处理的HL-60细胞 10B DADS处理的HL-60细胞 TUNEL ×20
6 PI染色流式细胞术测定凋亡率 染色流式细胞术测定凋亡率
原理:实验证明凋亡细胞在固定和清洗过程中降解的小分 原理: 外漏, 含量减少.因此, 子量DNA 外漏,导致细胞内DNA含量减少.因此,应用DNA 特异荧光染料(如碘化丙啶, 染色后, 特异荧光染料(如碘化丙啶,propidium iodide, PI)染色后, 进行的细胞周期分析中, 在FCM进行的细胞周期分析中,凋亡细胞常以亚二聚体形式出 细胞. 现.亚二倍体细胞群被称为亚G1期(sub-G1)细胞.它的出现 被认为是凋亡细胞的重要标志. 被认为是凋亡细胞的重要标志. 注意事项: 期细胞的同时, 注意事项:识别亚G1期细胞的同时,必须将它和细胞碎 片区分开来, 期细胞. 片区分开来,因为细胞碎片的DNA含量也明显低于G1期细胞.
MMP开放和caspase活化的"正反馈"环
膜间蛋白(如 AIF)释放 线粒体膜 屏障 功能破坏
MMP开放
刺激ceremide酶活化 剪切MMP复合物 Caspase-3活化
线粒体肿胀
Caspase-9活化 凋亡诱导剂
Cyoto C释放
Apoptosome (procaspase-9/Apaf-1/Cyto C) 结 合 Apaf-1 procaspase-9 和
图12 PI/Anexin-V双染色流式细胞仪检测DADS作用 PI/Anexin- 双染色流式细胞仪检测DADS作用 K562细胞 K562细胞12h后凋亡率的改变 细胞12h后凋亡率的改变
图13 流式细胞仪检测DADS作用K562细胞24h,48h后的凋亡率改变 流式细胞仪检测DADS作用 作用K562细胞 细胞24h,48h
原理:凋亡细胞的基因组DNA常首先被剪切为200300kb和30-50kb的片断("结构域式"剪切),再进一步 降解产生大小相当于核小体(160-200bp)的倍数的寡核小体 片断("裂解"/"梯子式"剪切).因此,在琼脂糖凝胶 电泳图谱上凋亡细胞表现为特征性"梯子"样外观. 注意事项:梯状DNA(DNA ladder)现象常被看作是细 胞凋亡的重要生物化学标志.但是,日益增多的资料显示 并不是所有表现凋亡形态学特征的细胞都是呈现这种梯子 样外观.因此,缺乏梯状DNA并不能排除细胞凋亡的存在. 据报道,某些细胞系如K562细胞凋亡常发生单链而不是双 链DNA降解,故不能形成"DNA ladder".另外,一般凋 亡率要在15%以上才能呈现典型"DNA ladder" .故有 DNA ladder可以肯定凋亡存在,没有DNA ladder不能排 除凋亡的存在.