73株弧菌的分离与鉴定
海产品中副溶血性弧菌的分离、鉴定及与临床分离株的生化性状比较
海产品中副溶血性弧菌的分离、鉴定及与临床分离株的生化性
状比较
宁喜斌;刘代新;张继伦
【期刊名称】《微生物学通报》
【年(卷),期】2008(35)6
【摘要】利用TCBS和科玛嘉两种选择性培养基从60份海产品中初筛得到27株疑似副溶血性弧菌,经生化鉴定,27株均为副溶血性弧菌,其中22株是从鲜活海产品中分离得到,5株从冷冻海产品中分离得到.进一步与临床上得到的32株副溶血性弧菌进行了四个特殊生化试验的比较,结果发现副溶血性弧茵临床分离株与海产品分离株在溶血、脲酶及枸橼酸盐利用3个生化试验上存在差异,而阿拉伯糖利用试验无差异,这为根据生化性状研究不同来源副溶血性弧菌提供基础.
【总页数】5页(P918-922)
【作者】宁喜斌;刘代新;张继伦
【作者单位】上海水产大学食品学院,上海200090;上海水产大学食品学院,上海200090;上海出入境检验检疫局,上海201202
【正文语种】中文
【中图分类】Q93
【相关文献】
1.纳米免疫磁分离-实时荧光聚合酶链式反应快速检测海产品中副溶血性弧菌 [J], 张蕾;曾静;魏海燕;马丹;程晋霞;张西萌;张海予
2.武汉市市售淡水小龙虾中副溶血性弧菌的分离鉴定及多位点序列分型 [J], 周颖;高耿;李智;竺倩;宋颖颉;李锦铨
3.重庆市水产品中副溶血性弧菌分离株的毒力基因研究 [J], 侯立杰;李林
4.海产品中副溶血弧菌的分离与鉴定 [J], 马光刚;郭福生;王娟;王玉东;张衍海
5.广州市售海产品中副溶血弧菌分离菌株的鉴定及其耐药性分析 [J], 刘欢;谢婷;何美珊;丁楠;钟青萍
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微生物菌种分离和鉴定技术
在琼脂柱表面倾倒一层灭菌 液体石蜡和固体石蜡的混合物
培养后，菌落形成在琼脂柱的中间
液体培养基分离
不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液 体培养基分离来获得纯培养。
稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。
在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数 （一般应超过95%）表现为不生长。
单细胞（孢子）分离
Technology
Erko Stackebrandt, DSMZ, Braunschweig, Germany
微生物菌种鉴定技术
1923(1)、1925(2)、1930(3)、1934(4)、1939(5)、1948(6)、1957(7)、 1974(8)、1994(9)
伯杰氏鉴定细菌学手册
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology
Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 1925–1932
图: Rep-PCR条码系统发育树(DiversiLab平台) Figure 2: Dendrogram of Rep-PCR Barcoding (DiversiLab Platform) . 注：图片来源于Reclassification of ATCC® 16404TM and ATCC® 9642TM as Aspergillus brasiliensis.
Sequence Analysis (MLSA)
基因型鉴定技术水平
不同指纹图谱和DNA分析技术的鉴定水平
多相鉴定实例 ATCC16404黑曲霉 Aspergillus niger
2007年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表 2008年 ATCC 16404 鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov. 2010年 WDCM 将ATCC 16404 更名 2010年 USP 将ATCC 16404 更名
宁波地区贝类产品中副溶血弧菌的分离与鉴定
采用 Ｄ ＮＡ－ｔｒ中 的 ＭｅＡｌ ｎ软 件 ， 靠 Ｊｔｎ Ｓａ ｇ ｉ ｇ 依 ｏｕ
试 验用 样 品牡 蛎 （ ｓｒａｇ ｇ ｓ 、 蚶 （ ｇ ｌ ＨｅｎＭｅｈ ｄ 析 方法对 疑似 菌株 和标 准菌株 进行 Ｏ ｔｅ ｉａ ） 泥 Ｔｅ ｉ — ｉ ｔｏ 分
ｌｒａｇ ａ ｏａ 、 ａ ｃ ｒ ｎ ｓ ） 毛蚶 （ ｃ ｐ ａ ｃ ｕ ｃｅａａ） 青 蛤 分析 比较 ， Ｐ ｙｏ ｅ ｅｉＴｒｅ 建 分 离菌 株 的系 Ｓ ａ ｈ ｒａｓｂｒｎ ｔ 、 用 ｈ ｌｇｎｔ ｅ 构 ｃ （ ｙ ｌ ａｓ ｅ ｓ ） 文蛤 （ ｒｔｉ ） 蛤 仔 （ ｅ ｅｕ 统发 育树 。 Ｃ ｃｉ ｎ ｎ ｉ 、 ｎ ｉ ｓ Ｍｅｅｒｘ 、 Ｙ ｎｒ—
６ Ｒ Ｉ Ｔ— Ｃ 定 法和基 于 １ Ｓｒ ＮＡ、ｏ Ｒ序 列 的 Ｐ Ｒ测定 法对 成 。１Ｓ ｒ ＮＡ 引 物 序 列 ：上 游 引 物 ５＿ Ｇ ６ Ｒ ｔｘ Ｃ 宁波 地 区海 产 品尤其 是 贝类 中的副溶 血 弧菌进 行 了 ＴＡＧＣ ＧＡＣ ＡＧＡＡ ＧＡＡＧＣ ３ ；下 游 引 物 ５一 Ａ－ 分离 和鉴定 ， 旨在 为 研 究该 菌在 当地 海 产 品 中 的分 ＧＧ ＡＡＡＣ Ｃ ＡＡＧＧ ＡＡＧＧＧ Ｔ ３ 。ｔ ｘ 引 物 ＡＴ Ｔ一 ｏ Ｒ
布和 流行情 况提供 参考 。 序 歹 ： 游 引 物 ５ ＧＴ ＴＴ ＴＧ ＧＣ Ⅱ上 Ｃ Ｃ ＡＣ ＡＡＴＣ 一 ＧＴ—
ＴＧ ３ ； 游 引 物 ５＿ － 下 ＡＴＡＣ ｒ ＧＡＧＴ ＧＧＴ ＧＣ ＧＴ— Ｔ Ｔ
１ 材 料 与 方 法
１１ 试验材 料 ．
．
Ｃ ＡＴＧ－ 。细 菌系统 发 育 学 的 研究 参 考 相关 文献 ， ３
道 感染 ， 引起 我 国 大陆 沿 海 地 区食 物 中毒 最 常 见 杭 州 天和微 生 物 制剂 有 限公 司 ， ａ ＮＡ 聚合 酶 、 是 Ｔ ｑＤ 的一种病 原菌 ｌ ］ ５ 。近 年来 ， 有许 多新 的方法 用 于 细 ｄ ＮＴＰ １ ×Ｐ Ｒ 缓 冲液 、 ｓ、０ Ｃ 菌 的分型 研 究 ， 核 糖 分 型 、 增 片段 长 度 多 态性 如 扩 ＵＮＩ －０柱 式 ＤＮＡ 胶 回收试 剂 盒 、 ０ Ｑ１ ＤＬ ２ ０ ０ ＡＦ Ｐ分 析 、 Ｌ 限制性 片段 长度 多态性 Ｒ Ｌ Ｆ Ｐ分 析 、 脉 ｍａｋ ｒ 自上海 生工 生物 工程 技术 服 务有 限公 司 。 ｒｅ 购 冲场 凝胶 电泳 Ｐ ＧＥ、 道 菌 重 复 性 基 因 间 一致 序 Ｇｏｄ ｅ ＭＤＮＡ染 料为 上海赛 百威 基 因技术有 限 Ｆ 肠 ｌＶｉ ｗＴ 列扩增 、 随机引 物 Ｐ Ｒ扩 增 Ｒ Ｄ 分 析 、Ｄ Ｃ ＡＰ ｒ ＮＡ 指 公 司产 品 。本试 验所 用 １ Ｓｒ ＮＡ 引物 和 ｔｘ ６ Ｒ ｏ Ｒ引 纹 图 、６ １ Ｓｒ ＲＮＡ 序列分 析 ｌ 。 。笔 者利 用生 化鉴 物 均 由上海 英 骏 （ｎ ｉ ｏ ｅ ） 物 技 术 有 限 公 司 合 ７］ 。等 Ｉ ｖｔ ｇ ｎ 生 ｒ
水环境中噬菌蛭弧菌的分离鉴定
水环境中噬菌蛭弧菌的分离鉴定水环境中噬菌蛭弧菌的分离鉴定 6中国兽医杂志2010年(第46卷)第11期ChineseJournalofVeterinaryMedicine水环境中噬菌蛭弧菌的分离鉴定于雪芝,章丽娇,康冬柳.,何伟勇,韩博,苏敬良(1.中国农业大学动物医学院农业部人畜共患病重点开放实验室,北京海淀100193;2.汀西省吉安市畜牧兽医局,江西吉安343000)摘要:噬菌蛭弧菌为一类杆形,弧形或螺旋形的革兰阴性菌,可以寄生并裂解其他细菌.本试验以禽源大肠杆菌,沙门菌以及环境水体中分离的1株大肠杆菌为宿主菌,采用双层琼脂培养法成功地从环境水体中分离到3株噬菌蛭弧菌,分别命名为BDD,BDE,BDH.电镜观察证明菌体大小约0.33/am×0.78/am,单个弧形,一端有一根长鞭毛.基因序列分析表明,分离株与已发表的噬菌蛭弧菌属其他菌株16SrRNA基因序列的同源范围分别为96.0,99.9.通过对不同细菌的裂解试验证明,3个分离株对大肠杆菌,沙门菌,摩根摩根氏菌,变形杆菌和阴沟肠杆菌等均具有裂解作用,但对铜绿假单胞菌,鸭疫里默氏菌和金黄色葡萄球菌不敏感.关键词:噬菌蛭弧菌;分离;鉴定中图分类号:$852.61文献标识码:A文章编号:0529—6005(2010)11—0006—03 Isolationandidentificati0nofBdellovibrio6ncfrfo1,orllfromriverwaterYUXue—zhi,ZHANGLi—jiao,KANGDong—liu,HEWei—yong,HANBo,SUJing—liang(1.KeyIaboratoryofZoonosisofMinistryofAgriculture,CollegeofVeterinar yMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China;2.AnimalHusbandryandVeter inaryBureauofJianinJiangxiProvince,Jian343000,China)Abstract:BdellovibriobacteriovorusareGramnegative,small,arc—shaped,motilebacteria.Theyin—vadetheperiplasmofotherlargergram—negativebacteria,killinganddigestingthem.ThiscapabilitymakesBdellovibrioapotentialtherapeuticagentforsomebacteriainfections .Inthisstudy,threeBdellov—ibriostrainsdesignatedasBDD,BDEandBDHwereisolatedfromriverwatersampl esusingSalmonellaandEscherichiacoliaspreycells.A1lisolatesshowedtypicalmorphologyunde relectronmicroscopewiththesizeof0.33m×0.78/*mandapolarflagellum.Genesequenceanalysisshowedthatthe16SrRNA genesoftheseisolatesshared96.0to99.9homologywithotherBdellovibriostrains publishedinGenBank.BacterialysistestdemonstratedthattheseisolatescouldlyseE.col i,Salmonellaentgritidis,Morganellamorganii,Proteusspp.andEnterobactercloacae,butnotsensitive forPseudomonasaerugi—nosa,RiemerellaanatipestiferandS,aph,OcOccusaureus.Keywords:Bdellovibriobacteriovorus;isolation;identificationCorrespondingauthor:SUJing—liang噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio(teriovorus,Bd)是一类体形较小,广泛分布于土壤,海水,污水等环境中,运动极活泼的革兰阴性菌.该菌具有"寄生"和"裂解(溶菌)"宿主菌的生物学特性,最早是由Stopl等在菜豆枯萎病假单胞菌体中发现.在显收稿日期:20100520基金项目:中国农业大学2009URP计划资助作者简介:于雪芝(1986一),女,本科牛,从事动物医学专业学习,Email:yu51422396@126.corn;章丽娇(1987),女,本科生,从事动物医学专业学习,Email:zhang62810003@126.CO1TI通讯作者:苏敬良,Email:jinglsu@yahoo.COlll注:第1作者与第2作者对本文同等贡献微镜下观察表明,噬菌蛭弧菌呈弧形,杆状或逗点状,大小为0.3,0.6/am×0.8m,1.2m.单极端生一根长而粗的鞭毛通常呈波状,由鞭毛鞘和轴心组成,与菌体运动和侵袭功能直接相关,被认为是噬菌蛭弧菌的重要特征之一.在环境中一般不利用周围的营养物质,必须依赖宿主细胞进行生长,发育和繁殖,最后使宿主菌细胞裂解_2].蛭弧菌在河口,海洋,河水,生活污水,鱼塘和灌溉用水等环境系统中分布广泛.在螃蟹腮上,江河湖泊的沉积物,土壤,水稻田和植物根围均可分离到蛭弧菌,同时在动物肠道中也能分离得到蛭弧菌l_3]. 因为噬菌蛭弧菌对革兰阴性细菌具有很强的裂解能中国兽医杂志2010年(第46卷)第1】期7力,而且试验证明,其对致病菌肠道病原菌的裂解能力明显大于非致病菌,越来越多的科研人员试图开发利用噬菌蛭弧菌作为微生态制剂用于水体及环境病原菌净化,病原菌感染的预防和治疗等一.随着养殖业的发展,养殖水体污染许多革兰阴性病原菌, 如嗜水气单胞菌等,对水产动物造成了越来越严重的危害,以噬菌蛭弧菌为基础的微生态制剂在该病的预防控制中显示了良好的应用前景.本研究通过对环境水体中噬菌蛭弧菌进行分离和鉴定,旨在获得对常见肠道病原菌具有广谱裂解作用的分离株, 以期为后续高效优质噬菌蛭弧菌的筛选和相应生物制剂的开发奠定基础.1材料与方法1.1菌株大肠杆菌YZ株(分自河水),大肠杆菌 lxq050,沙门菌lxq033,摩根摩根氏菌,鸭疫里默氏菌为本实验室分离鉴定.大肠杆菌CVCC1450,沙门菌肠炎亚种CMCC50094,铜绿假单胞菌CM— CC10104,变形杆菌CMCC49027,阴沟肠杆菌阴沟亚种CMCC45301,金黄色葡萄球菌金黄亚种CM— CC26003购自中国兽医药品监察所.1.2噬菌蛭弧菌的分离和纯化1.2.1宿主菌悬液的制备分别将大肠杆菌 lxq050,大肠杆菌YZ株和肠炎沙门菌lxq033接种于IB培养基中,37?振荡培养约10h,取培养物经 5000r/min,(4?)离心10min,取沉淀,用25mL 的HM缓冲液悬浮沉淀,重复离心1次,用1mI HM缓冲液悬浮沉淀:.1.2.2样品的处理以及稀释液制备取河水样品约250mL低速离心(500r/min离心5min),除弃大颗粒杂质后,上清液高速(27000r/rain,4?)离心20rain,再用3mIHM缓冲液悬浮沉淀,经过 1.2m孔径无菌滤膜过滤收集滤液,并用HM缓冲液作10倍系列稀释.1.2.3噬菌蛭弧菌的分离和纯化取1mL宿主菌悬液加入到含有6mI融化的HM 上层琼脂试管中快速摇晃混匀,迅速加入200I稀释的样品滤液,摇匀后迅速倒人HM下层培养基上,待上层琼脂在室温下凝固后将平板倒置,28?培养,待噬斑形成后,挑取单个噬斑至1.5mL无菌离心管中,加入 1mLHM缓冲液,然后在振荡器上振动3min,使蛭弧菌充分释放,经稀释后采用上述方法经过连续4 代噬斑筛选获得纯的噬斑培养物.1.3噬菌蛭弧菌的鉴定1.3.1革兰染色挑取培养基上的噬斑置于载玻片上,滴一滴无菌水覆盖,涂布后弃去噬斑残存琼脂,进行革兰染色.1.3.2透射电镜观察挑取培养基上的3个噬斑置于1.5mL离心管中,加60LHM缓冲液于 28?浸泡约17h,取菌液,醋酸铀负染后在透射电子显微镜(JEM1230)下观察细菌的形态. 1.3.3PCR鉴定参照文献E73合成噬菌蛭弧菌 16SrRNA基因的特异性引物842R:5r_CGW CACTGAAGGGGTCAA一3和63F:5一CAGGC— CTAACACATGCAAGTC 一3.挑取培养基上的分离菌株噬斑置于1.5mL离心管中,加入1mI无菌水后振荡3min使其充分释放.经过0.45m滤膜过滤后,取滤液于98?水浴加热10rain,冰浴3min 制备基因组DNA模板.PCR扩增热循环条件为: 94?热变性4rain;之后94?1min,54?退火 1rain,72?延伸90S,35个循环,最后72?延伸 10rain.PCR扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳观察记录结果并进行序列测定(北京三博远志科技有限公司).1.4噬菌蛭弧菌宿主范围的测定分别以1.1所列出的菌株为宿主菌,加入所分离噬菌蛭弧菌,采用 HM双层琼脂平板培养法28?培养观察2周以上, 监测和记录蛭弧菌菌株对选定宿主菌的裂解情况, 以形成肉眼可见的噬斑作为裂解阳性判定标准.1.5噬菌蛭弧菌的简单保存将分离菌株在4?HM双层琼脂平板中保存,分别放置1周,1个月,2 个月,3个月检测活性.此外,刮取双层培养基中含有噬菌蛭弧菌使其充分释放到HM缓冲液分装到 1.5mL冻存管中,于液氮中迅速冷冻,保藏于一8O?,1个月和3个月分别检测其活性. 2结果与分析2.1噬菌蛭弧菌的分离与纯化以大肠杆菌或沙门菌作为宿主菌,采用双层琼脂平板培养,28?培养 3d出现肉眼可见透明噬斑,7d后噬斑直径约2, 4mm.经过噬斑纯化传代后各分离株形成比较均一的噬斑.2.2噬菌蛭弧菌的鉴定2.2.1形态学观察样品经革兰染色后,在光学显微镜下可见两种大小的革兰阴性菌,其中大杆菌为宿主菌,小杆菌为噬菌蛭弧菌.样品经过醋酸铀负染后,在电镜下可见有大量噬菌蛭弧菌(见图1),菌体有单个弯曲,大小约为0.33mX0.78m,菌体一端有一根长鞭毛,少量噬菌蛭弧菌附着于宿主菌体上. 2.2.2PCR鉴定以及基因测序分析采用噬菌蛭弧菌16SrRNA基因特异性引物,以3个分离株的基因组DNA为模板成功地扩增出预期的基因片段,而宿主菌基因组DNA对照结果为阴性.基因序列分析结果证明BDD(GenBankAccessionNo.:HM219227),BDE(GenBankAccessionNo.:HM219228),BDH(Gent~nkAccessionNo.:HM219229).分离株与 8中国兽医杂志2010年(第46卷)第1I期图1噬菌蛭弧菌BDE负染透射电镜照片1:大肠杆菌宿主菌;2:噬菌蛭弧菌BDE分离株mCm.凸噬菌蛭弧菌属其他菌株16SrRNA基因序列的同源范围分别为96.5,99.9Yo,96.0,99.3,96.3,99.4,同源性比较见表1.其中,与噬菌蛭弧菌DSM50705株和ARL一12株同源性最高,为99.2,99.9;与标准菌株HD100的同源性达97.9,98.6;与BEP2和BEP4同源性差异最大.2.2.3噬菌蛭弧菌宿主范围的测定在28?的环境下培养2周后观察噬斑的生长情况见表2,结果发现噬菌蛭弧菌分离株对不同宿主菌的敏感性有一定的差异.BDD和BDH对各宿主菌的裂解能力相似,但BDD对沙门菌肠炎亚种CMCC50094裂解力表1BDD,BDE,BDH分离株与噬菌蛭弧菌属部分菌株16SrRNA序列的同源性比较PercentIdentity12345678910"12131啊_l9929999g6986g9.496596598698.798.6987986'BDD.seq 20.9艚l{993992g7998796096097998.097.99809e02BDEseq 3010.7粗一;99498499:396396398.498698.488688.43BDHseq404080.8}I{986996g71971g8698698.69869884BDARL_1216Sseq 514211614啊?{99096896.8100.099.8100O99898.95BDHD'00(AJ292759".seq6061307041.0{??{9729729g099098.999.088.86BDDSMSOT05(AJ278145.1).seq 7364.2382.93.32.8糖?IIoo096896g97.298796.37BDBEP2(^FI48938.1).seq 8364238293329nnIi9RR96997.29679638BDBRP4(AF1489391)seq 9142116140O10333.3}9980009g89999BDHDI27(AJ292760.1).seq10132014140210323202溷—雕99.8g989g710BDSRE7(AF2638321).seq "1421161400112.9290.0一一ll|簟l99899911BDTu?113(AY0941221).seq 12132014140210343402020.299712BDJeF1(EU884925.1)seq13142.01613011238380103010.3龋量{13BDVletnam(AY094123.1)seq12345678910"1213要弱于BDH.BDE对大肠杆菌lxq050,肠炎沙门菌lxq033的裂解力稍弱于其他两株.3株分离菌株均不能裂解铜绿假单胞菌,鸭疫里默氏菌,金黄色葡萄球菌金黄亚种.BDE不能裂解变形杆菌.表2分离菌株BDD,BDE,BDH的宿主范围"+":噬菌蛭弧菌对宿主菌有裂解作用;"+"数量:噬菌斑大小;"2.2.4噬菌蛭弧菌的简单保存经检测,噬菌蛭弧菌在HM双层琼脂平板中,4?保存2个月后仍能存活,3个月后活性明显降低,部分菌株失活.在一80?冻存至少可保藏3个月以上,但保存的噬菌蛭弧菌在初代复苏过程中,噬斑增长速度减缓.":蛭弧菌对该宿主菌不裂解,无噬斑3讨论本试验采用双层琼脂平板法从水体环境中成功地分离到3株噬菌蛭弧菌.试验过程参照Varon和Shilo等的方法引,使用低速离心去较大颗粒中国兽医杂志2010年(第46卷)第11期9J]l一甘露聚糖酶对鸡血浆中1一酸性糖蛋白的影响梁增成,刘盼琦,诸葛增玉,高浩嵩,马金磊,颜晓冬,孙艳争(中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)摘要:本论文研究了在正常养殖状况下于饲料中添加药物和p一甘露聚糖酶后对肉鸡血浆酸性糖蛋白(AGP)水平,生产性能的影响.试验选择健康肉鸡1500只,随机分为3组:一个对照组和两个试验组,每组500只.各个组都添加盐霉素(60g/t饲料)防球虫感染.第1组为对照组(CONTR),不添加杆菌肽锌和口一甘露聚糖酶,第2组添加杆菌肽锌(5Og/t饲料,ZINEB)而不添加B一甘露聚糖酶,第3组添加p一甘露聚糖酶(100g/t饲料,MANNS)而不加杆菌肽锌.整个试验期为42d.试验过程中肉鸡自由采食,自由饮水.结果表明,与对照组相比,两个试验组鸡只血浆中的AGP均明显降低,且p一甘露聚糖酶对成鸡比杆菌肽锌更有效.在肉鸡生产性能水平方面,添加杆菌肽锌和添加pI甘露聚糖酶对降低料肉比,提高饲料效率均具有明显的作用,且甘露聚糖酶更有效.关键词:甘露聚糖酶;el一酸性糖蛋白;肉鸡中图分类号:$852.2文献标识码:A文章编号:05296005(2010)11—0009,03 Effectof~-mannanaseonplasmaAGPlevelofbroilersLIANGZeng—cheng,LIUPan—qi,ZHUGEZeng—yu,GAOHao—song, MAJin—lei,YANXiao—dong.SUNYan—zheng(CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing1001 93,China)Abstract:ThisstudyW3StOinvestigatetheeffectof—mannanasesupplementationtodietonbroiler plasma1-acidglyeoprotein(AGP)levelandperformance.Onethousandandfivehundredbr oilerswere收稿日期:200909—07作者简介:梁增成(1965一),男.兽医师,博士,主要从事兽医微生物与肠道营养研究,Email:liangzch@263.eom 通讯作者:孙艳争,Email:sunyanzheng258O@ 的杂质,然后用高速离心法收集浓缩菌体并尽可能[2]秦巨生.噬菌蛭弧菌及其微生物生态制剂在水生动物养殖上除去较小的噬菌体,用孔径为1.2m的滤膜过滤[.]竿需:菌的抑制作除去宿主菌,取得了较好的效果,大大提高了目标菌用lD]. 扬州:扬州大学硕士学位论文,2()(]7.的分离率.[4]李戈强,章勇趣,徐伯亥.不同条件下蛭弧菌裂解河弧菌的研 ,, 等.电镜观竺毫噬菌弧菌5,等..噬菌蛭弧菌的分离及初步鉴定?.单弧状,端生单鞭毛,这与郑英珍等运用扫佃44b吧,4~镜水生生物学抿29, ,3319(68),:22(3).:2.65-271.oolO83lO87….,观察到的形态相似.基因序列分析证明,所分离的[6]李楠,倪学勤,潘康成.鸡源蛭弧菌的分离及其对鼠伤寒沙菌株与所报道的噬菌蛭弧菌具有高度同源性,裂解门氏菌病的治疗作用[J]_中国兽医杂志,2..,3(1):宿主范围与Pineiro等报道基本相似,只是对铜绿E7]JkevitchE.I.1ti.d.1iti..fBzz.拍.d假单胞菌的裂解性有差异,这可能与噬菌蛭弧菌菌likeorganismsEJ].cu"ProtocMicrobio1,2005,7B1—17.株及宿主菌种的不同有关.初步保存试验结果表E8]Var0l1M,shiloM?Meth.dforseparati.n.fBd.ribri.明,4~CHM双层琼脂平板法操作简便,蛭弧菌的活i三i.o.nbyffiltrai.tionrtIh]ro.gRh.m性好,适用于短期保存.O..1970,18—19:145151. 参考文献:PineirodSAh,lS.ah.aniui.kGEl,iRo.mfbBergE1,ebtal.Predafr0tionpahtEliStoplH,StarrMP.Bdellovibriobacterioworusgen.etsp.n.,GreatSaltLake ,Utah[J].CurrMicrobio1,2004,48(2):apredatory,ectoparasiticandbacteriolyticmicroorganism[J].1I3-I17.。
弧菌
弧菌科种类
弧菌属 气单胞菌属 邻单胞菌属
2013-7-29
3
三个菌属的鉴别
试验
肌醇 粘丝试验 鸟氨酸 精氨酸
150 μgO/129
弧菌属
－ ＋/(－) ＋/－ ＋/－ S ＋ ＋/－
气单胞菌属 邻单胞菌属
－ － － ＋/－ R － － ＋ － ＋ ＋ S － －
4
TCBS生长 耐盐（7％）
16
霍乱流行病学特点（2）
霍乱发病季节在夏秋季，本市主要在5-10月份， 7-9月为发病高峰 人群普遍易感，在同源感染因素下易造成爆发和 流行
2013-7-29
17
霍乱预后及危害
霍乱能引起机体剧烈吐泻、失水、电介质紊乱以 致死亡
病死率高低与病情轻重以及医疗条件、抢救的时 效性有关。病情重、医疗条件差、抢救不及时病 死率可高达20%-50%
霍乱流行病学特点（1）
霍乱（O139与O1群霍乱），具有传染性强、传播 迅速、易出现暴发和流行特征；世界卫生组织将 其纳入霍乱范畴，我国将它列入法定报告的甲类 烈性传染病 霍乱弧菌主要通过水、食物、日常生活接触和苍 蝇传播，以食物传播为主，常可借助食用被霍乱 弧菌污染的食物而致病
2013-7-29
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全国霍乱O139流行情况（1）
1992年在印度、孟加拉首次发现霍乱O139后， 短期内在这两个国家造成流行，发病人数高 达10多万例，并在几年间已传入亚洲、欧洲、 美洲等20多个国家 1993年传入我国后，即在新疆南部柯坪县发 生霍乱O139引起的暴发，报告病例数202例， 死亡4例
2013-7-29
弧菌科及检验
弧菌科共同特征
革兰阴性菌，短小弯曲弧状,无芽胞， 多数有鞭毛、有菌毛。 需氧兼性厌氧 具有一端单一鞭毛、运动迅速 氧化酶＋ 发酵葡萄糖产酸不产气,许多菌株生长 需要2%~3%氯化钠 弧菌科细菌广泛分布于自然界，以水中 最为多见。其中有一些种对人类致病。
62株病原性弧菌的鉴定与耐药性检测分析
视 。正 确 处 理 这 部 分 菌 株 有 重 要 的 临 床 意 义 。 实 际应 用 自动
化 仪 器 时 ， 须 挑 取 纯 培 养 菌 落 ， 提 高 鉴 定 率 ， 确 认 为 纯 必 可 对 培养而无法鉴定者 ， 可通 过 传 统 分 类 法 ， 照 双歧 检 索 表 能成 参
ａｎ ， ｒｉ）取 上 清 液 比浊 并 调 节 到 所 需 的浓 度 后 得 以 鉴 定 。余 下
［ 稿 日期 ］ ２ ０ 收 ０ ７—０ —１ ４ ８
６ ２株病 原 性 弧 菌 的鉴定 与 耐 药性 检 测分 析
陈 雪辉 梅 亚 宁 ，
（ ．江 苏省 南 京市 中 医院 ， 苏 南京 ２ ０ ０ ； ．江苏省人 民 医院 ， 苏 南京 ２ ０ ０ ） １ 江 １０ １２ 江 １０ １
［ 关键 词
［ 图分 类 号 ］ Ｒ ４ ． 中 ４ ６５ ［ 献标 识码 ］ Ｂ 文 ［ 章 编 号 ］ １ ０ ８４ （０ ７３ —５ ６ ０ 文 ０ ８ ８ ９ ２ ０ ）４ １７ ２ 其 他 嗜盐 菌 低 ， 偶 在 无 盐 肉 汤 中 生 长 ＿ 。０ １９敏 感 试 验 故 ３ 】 ／２
菌 、 氏不 动 杆 菌 、 糖 产 碱 氧 化 杆 菌 等 ） 能 从 双 歧 检 索 表 琼 木 虽
获 得 结 果 ， 与 常 规 鉴 定 法 结 果 不 相 符 ， 出 现 矛 盾 的 生 化 结 但 或
果 ， 增 加 试 验 项 目 ， 常规 鉴定 方法 及 ＡＰ 系统 报告 结果 。 需 按 Ｉ
致病 性弧 菌 是 引 起 夏 秋 季 节 肠 胃道 疾 病 的 病 原 菌 之 一 ， 为 了 解 该 菌 引起 肠 胃道 疾 病 的 情 况 ， 者 对 急 性 腹 泻 患 者 的 笔 粪 便 分类 进行 病 原 性 弧 菌 的分 离 鉴 定 ， 进 行 了 药 敏 检 测 ， 并 现
弧菌的观察实验报告
弧菌的观察实验报告实验目的本实验旨在通过观察和研究弧菌的生长过程，了解其形态特征、生长条件以及对人体的影响，为进一步研究弧菌的生态学和病原学提供参考。
实验原理弧菌（Vibrio）是一类革兰氏阴性菌，常见于水环境中，其中某些种类是人类和动物肠道感染的致病菌。
实验中我们将通过培养观察的方法，研究弧菌的生长过程及其形态变化。
实验材料和方法实验材料：- 弧菌培养基- 无菌平皿- 实验手套- 滤纸实验方法：1. 取一块无菌滤纸，用无菌夹子夹住，浸入弧菌培养基中，确保滤纸完全湿润。
2. 用无菌酒精灯烧热实验夹子，将夹子对准培养皿的中心，将浸有弧菌培养基的滤纸夹起。
3. 将夹有滤纸的实验夹子，快速平行放置在无菌平皿上，等待培养基凝固。
4. 取一支无菌的钢针，蘸取已有弧菌培养基的菌落，均匀涂抹在培养基上。
5. 在标准实验室温度（28-30）下，将培养皿放置于恒温箱中，观察培养基上弧菌的生长情况。
6. 每隔一段时间，使用显微镜对培养皿中的弧菌进行观察和记录。
实验结果通过实验观察，我们得到了以下结果：1. 弧菌在培养基上生长迅速，一般在2-8小时内就可以观察到明显的生长现象。
2. 初始阶段，菌液呈透明或微浑浊状态，菌落大小较小。
3. 随着时间的推移，菌液呈现出浑浊状态，菌落逐渐增大并形成不规则形状。
4. 培养皿表面出现较多的菌落，呈黄绿色或蓝绿色。
实验讨论通过观察实验结果，我们可以得出以下结论：1. 弧菌对温度和湿度要求较高，适宜的生长温度为28-30，适宜的湿度为60-70%。
2. 弧菌在富含有机物质、微量元素和适宜酸碱度的培养基中生长得更好。
3. 弧菌的生长周期较短，可能与其较高的代谢活性有关。
4. 弧菌的生长过程中可能会产生一些代谢产物，如海藻酸等，对人体可能具有一定的致病作用。
实验结论通过本次实验，我们对弧菌的形态特征、生长条件以及对人体的影响有了初步了解。
我们发现，弧菌对温度和湿度要求较高，适宜的生长温度为28-30，适宜的湿度为60-70%。
细菌的分离、培养和鉴定
② 加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质 （如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对 营养要求高的微生物（2216E）
③ 选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性 不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生 长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物 的目的。（中国科学院海洋研究所专利：一种定量检测鳗弧 菌的选择性培养基及其制备）【利用鳗弧菌对氨苄青霉素的抗性 】
④ 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养
基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，
能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；
从而达到区分不同的微生物.。（TCBS）
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ❖ 病料在接种培养基后，经过一段时间，应检查其 生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有， 则需进一步检查菌落是否纯一。形态特征包括： 大小、形状、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、 波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白 色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度 （不透明、半透明、透明等）和粘度等
水可直接涂布平板
• 平板置于28℃ 恒温培养箱培养24h，观察细菌生
长状况
（注意：操作台在使用前后都需要用酒精棉球擦拭
台面，保持操作台的整洁）
.
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二、细菌的培养
培养基：培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物 培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。
培养基的种类
① 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物 质；可作为一些特殊培养基的基础成分（普通营养琼脂）
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生化鉴定管
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养 基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用
海水及海产品中溶藻弧菌的分离与鉴定
Ｋｅ ｗｏ ｄ Ｖ ｂｉ ｌ ｉ ｏｙ ｉｕ ；ｓ ａ ａｅ ；ｓ ａ ｆ ｏ ｓ ｓ ｌｔ ｎ ａ ｄ ｉ ｅ ｔ ｃ ｔ ｎ ｙ ｒｓ ｉｒ ａｇ ｎ ｌｔ ｓ ｅ ｗ ｔｒ ｅ ｏ ｄ ；ｉｏａｉ ｎ ｄ ｎ ｉ ａｉ ｏ ｃ ｏ ｉ ｆ ｏ
溶 藻 弧菌 （ ／ ｏａｇｎ ｌ ｉ ｓ 是腹 泻 病 原 菌 Ｖｂ ｌｉ ｙ ｃ ） ｄ ｏ ｔｕ
我 国国标 中对溶 藻 弧菌 的检测 方 法 还没 有具 体 规
中的一 员 ， 为专 性 嗜 盐性 弧 菌 。与 其 他 致 病 弧 菌 定 ， 讨海 水及 海 产 品 中溶 藻 弧 菌 的 分 离 鉴 定 方 探
一
样， 广泛分 布 于海洋 和 江河 人海 口的水 域 中 ， 并 法 ， 其进行 安 全 控 制 及 以 后 建海 上 上 ２ １０ ） ０ ３ ６
摘
要
从 上 海 东海 海 域 随 机 采 集 海 水 样 品 ５ 及 各 市 场 购 买海 产 品 ９ Ｏ份 ５份 ， 照 国 标 中副 溶 血 性 弧 茵 的 检 参
验方法 ， 对采 集样 品进行 了分 离与鉴定。样品增茵后选用 Ｔ Ｂ Ｃ Ｓ及科玛嘉弧茵显 色培养对其进行初 步分 离， 挑
取 可疑 单 茵 落进 行 生 理 生 化 验 证 和 分 子 生物 学方 法鉴 定 ， 中从 ９份 海 水 、４份 海 产 最 中分 离 出溶 藻 弧 茵 菌 其 ２
株 ， 离率 分别 为 ｌ． ％ 与 ２ ． ％ 。 分 ８Ｏ ５３ 关键词 溶 藻 弧 茵 ； 水 ； 产 品 ； 离鉴 定 海 海 分 Ｑ ３ ． ９８８ 文献标识码 Ａ 文章编号 １０ ７ ２ （０ １ ０ ０ ５— ０ １ ２ １ ）３—０２ — ４ ０ １ ０
１ 材 料 与方 法
微生物学--弧菌
分离培养与鉴定
分离培养 粪便或肛拭标本：直接接种改良Campy-BAP
选择平板 血、脑脊液标本：布氏肉汤增菌后转种分离培
养基 微氧环境培养 不同细菌培养温度不同
Key Points
革兰阴性逗点状或S形的菌,运动活泼 微需氧：最佳生长环境为含5%O2、10% CO2、
85%N2 最适生长温度因菌种而异 营养要求高 氧化酶、触酶阳性，不能利用、不发酵各种糖类，
（3）快速诊断：O1和O139抗体做玻片凝集
（4）霍乱毒素的测定
二 分离培养和鉴定
初次分离用pH8.5碱性蛋白胨水，经4～6小时 液体表面大量繁殖，形成菌膜。
二 分离培养和鉴定
TCBS（硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板）
霍乱弧菌在TCBS琼脂平板上形成 发酵蔗糖的较大的黄色菌落
含亚碲酸钾的培养基：4号琼脂 庆大霉素琼脂
临床意义 (致病因素)
1.侵袭力
进入小肠，鞭毛、菌毛、分泌黏液，O139群有荚膜
穿过小肠黏膜表面黏液层
黏附于小肠黏膜上皮细胞刷 状缘的微绒毛上大量繁殖
临床意义 (致Βιβλιοθήκη 因素)2.霍乱肠毒素 MW：80000-90000 A1:活性亚单位 21812 A2:连接亚单位 5000 B：结合亚单位
霍乱弧菌肠毒素（CE, cholera enterotoxin）
鉴
定
定
生物学特性（培养特征）
需氧或兼性厌氧 营养要求不高，嗜盐（无盐不生长,最适盐浓度
3%） TCBS上形成绿色菌落
副溶血弧菌在TCBS 上菌落
鉴定特征
革兰阴性弧菌或杆菌，动力（＋） 氧化酶（＋），临床分离株脲酶常（＋） TCBS上绿色菌落、氯化钠生长试验 神奈川现象(+) 各种生化试验 TDH和TRH的检测：毒素和基因检测
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各种生化反应培养基，由桓台县卫生防疫检验所提供。霍乱弧菌诊断分型血清由兰州生物制品研究所提供。
三、分离鉴定程序 以无菌棉签取腹泻便分别置l％NaCl胨水和碱性胨水中，经37℃ 8—10h增菌，取表面培养物分别接种在4号琼脂甲
板和TCBS平板，经37℃18—24h培养后，挑取可疑菌落接种在KIA上。用霍乱弧菌多价诊断血清做玻片凝集试验。暗视野观察动力。做一
[4]李蓉，徐迪诚．微生物分类和鉴定技术进展．哈尔滨：光明日报出版社，1989： [5]李素波，毕平安，腹泻患者粪便弧菌属及气单胞菌属分离鉴定结果分析．佳木斯医学院学报，1995，18
表：
二、药敏试验结果 73株弧菌属细菌对10种抗菌药物中最敏感的是氯霉素(96.9％)，依次为复方新诺明(94.8％)，庆大霉素(87.4％)， 阿米卡星(66.8％)，妥布霉素(64.9％)，多粘菌素(59.5％)，四环素(56.6％)，环丙沙星(51.7％)。主要弧菌的耐药情况：副溶血弧菌的耐药 率是氨苄西林(94.8％)，青霉素G盐(91.8％)；致伤弧菌是氨苄西林(89.3％)，青霉素G盐(92.8％)；河弧菌是氨苄西林(85.7％)，青霉素G盐 (100.0％)；0—1群霍乱弧菌对氨苄西林耐药62.7％，对青霉素G盐和多粘菌素耐药率均为75．0％。
【文章编号】2095-1752（2014）21-0187-02
弧菌属(Vibrio)细菌是一群短小，弯曲呈弧状的的革兰氏阴性菌，是引起人类急性腹泻的主要病原菌之一。广泛分布于自然界，以水中
多见，本菌属大多菌种为非病原菌，对人致病的主要有霍乱弧菌和副溶血弧菌，分别引起霍乱和食物中毒。近年来，由于水质污染和海产
讨论 与人类感染有关的弧菌属有12个种，感染后可引起不同程度的腹泻和食物中毒[3]。近年由弧菌属引起的感染性腹泻引起人们的关注。 微生物实验室也从监测沙门、志贺菌属为主，向弧菌属转移。为加强霍乱弧菌的监测，2007-2011年我们对来院就诊的腹泻病人全部进行了 弧菌属的培养鉴定。同期检出弧菌属细菌73例，分离率为11.1％，而检出的沙门、志贺菌属只有21例，分离仅为3.1％，说明弧菌属细菌已 成为桓台地区感染性腹泻的主要病原菌。 弧菌属增菌液以1％NaCl胨水和碱性胨水为好，方便，适用，且效果满意，选择培养基则以TCES为佳[4]。本文分离出的4株o—1群霍 乱弧菌经血清学鉴定均为小川型。患者呈散在发病。由于隔离治疗及时，经住院后均痊愈，末造成流行，因而微生物实验室在夏秋二季加 强对霍乱弧菌的监测工作是防止霍乱流行的重要措施[5]。 必须贯彻预防为主的方针，加强检疫，及时检出病人，严格隔离治疗，必要时实行疫区封锁，以免疫情扩大蔓延。接种霍乱死菌苗， 能增加人群的免疫力，保护率为55%-90%,免疫力维持的时间较短，一般为3-6个月。口服减毒活菌苗和注射类毒素可自动免疫，特别是自 然筛选或通过基因重组技术获得只产生B亚单位的活菌苗，可诱导产生有效的抗毒性和抗菌性免疫。同时，及时和适当补充液体和电解质是 治愈霍乱的关键所在。常用的抗菌药物有四环素，强力毒素。近年来用氟哌酸，氟嗪酸撩闲亦佳。 参考文献 [1]庞敏，山东省淄博市桓台县结核病防治所检验科 [2]毕平安，李素波．浙江嘉兴地区感染性腹泻患者病原菌调查。中华流行病学杂志，1994，15(6A)；117 [3]娄永新，王金良．实用临床细菌学检验与进展．天津：天津科技翻译出版公司，1993：145
系列生化反应，氧化酶、硝酸盐还原试验阳性菌落用弧菌科细菌编码和微量生化反应管进行细菌生化鉴定，最后参考有关文献确定菌种
[2]。
四、药敏试验 药敏纸细菌的分类 从657例急性腹泻病人粪便中分离出弧菌属细菌率为11.1％。经生化反应鉴定可归属于10个种，结果见附
【摘要】从657例泻便标本分离出弧菌属细菌73株，分离率为11.1％，以致伤弧菌(24株32.8%)、副溶血弧菌(19株26%)和河弧菌(9株
9.6%)为主。0-1群霍乱弧菌9株(5.5%)经血清学鉴定均为小川型，患者呈散在发病。
【关键词】弧菌属 霍乱弧菌 急性腹泻
【中图分类号】R931.5
【文献标识码】A
73株弧菌的分离与鉴定
发表时间：2014-10-14T16:58:41.967Z 来源：《医药前沿》2014年7月第21期供稿 作者： 庞敏 王波 田春梅 [导读] 弧菌属(Vibrio)细菌是一群短小，弯曲呈弧状的的革兰氏阴性菌，是引起人类急性腹泻的主要病原菌之一。
庞敏 王波 田春梅
(桓台县结核病防治所 256400)
品的大量食用，由弧菌属细菌引起的腹泻明显增加。我们在2007-2011年夏秋二季在监测霍乱弧菌的工作中，从657例急性腹泻便标本中分
离出73株弧菌属细菌。
材料和方法
一、标本来源 2007-2011年夏秋二季来我院就诊的急性腹泻病人粪便标本657份。
二、培养基 霍乱、副溶血弧菌增菌液，硫代硫酸盐枸橼酸盐胆盐蔗糖琼脂(TCBS)，霍乱弧菌专用4号琼脂，克氏双糖铁琼脂(KIA)和