第三节 Oxidative phosphorylation(5-9-3)

当存在足够高的跨膜质子化学梯度时，强大的质子 流通过 F1-F0-ATPase进入基质时，释放的自由能
推动ATP合成。
化学渗透学说
一. 氧化磷酸化的机理
The reconstituted
vesicles containing
ATP synthase and bacteriorhodopsin,
一. 氧化磷酸化的机理 20世纪 30年代包括德国生物化学家、诺贝尔 奖获得者Meyerhof & Warburg在内的许多生化 学家对代谢过程中能量的产生和利用作了深入研 究，发现无论在糖酵解或三羧酸循环等代谢过程 中，都有伴随着ATP磷酸根的放出或 ADP得到磷
酸根的变化这类化学能量高效率的传递方式，指
The world’s smallest molecular motor: rotational catalysis.
Fluorescencetly labeled
Rotation of the subunit and the ring of c subunits in the FoF1 complex was observed by in vitro studies using fluorescence microscopy (K. Kinosita, 1997)
为什么？
为什么？
二. 氧化磷酸化的P/O比
二. 氧化磷酸化的P/O比
但是, 近年来很多实验结果都证明，以NADH作 为电子供体时，测得的P/O比值大于2。以琥珀酸作为 电子供体时，侧得的P/O比值大于1；所以P/O比值不 一定是整数。例如，-羟丁酸经过NADH途径的P/O 比值为2.4~2.6，产生的ATP数目为2.5；而琥珀酸 经过FADH2的P/O比值为1.7，产生的ATP数目为1.5 。
）可破坏线粒体内膜对质子的透性壁垒，使质子电化
学梯度消失。
另外根据测算，膜间隙的 pH 较内膜低 1.4 个单位
，并且线粒体内膜两侧原有的外正内负1-F0-ATPase复合物
二. 氧化磷酸化的P/O比
P/O( 磷氧比 ) ：在生物氧化过程中，伴随 ADP 磷酸化所消耗的无机磷酸的磷原子数与消
33, with the subunit linked to an actin filament will also rotate when ATP is added.
Model on the rotation of the c-ring in ATP synthase: two half-channels for H+ on the a subunit has been proposed. (3ATP made per 10-14 protons transported: ~3H+/ATP.)
a light-driven
proton pump, reported by Efraim
Racker and Walther
Stoeckenius in 1974
0,02
ATP
A 492
ATP H ADP + P
i +
0,00
AO
AOH+
AO
-0,02
-0,04 Gramicidin -0,06
ADP
L (loose)
App(NH)p
T (tight)
O (open)
Rod-shaped subunit.
Empty
Structure determination indicates that indeed the three subunits are inequivalent in conformation! (John Walker, 1994)
酸通过线粒体内膜的转运是由ATP-ADP载体和磷酸
转位酶催化的。已知每合成1个ATP需要3个质子通过
ATP合酶。与此同时，把一个ATP分子从线粒体基质
转运到胞液需要消耗1个质子，所以每形成1个分子的 ATP就需要4个质子的流动。因此，如果一对电子通 过NADH电子传递链可泵出10个质子，则可形成2.5 个分子ATP；如果一对电子通过FADH2电子传递链有 6个质子泵出，则可形成1.5个ATP分子。
三. ATP酶-构象偶联假说
该假说是 1964年由美国生物化学家Paul Boyer
最先提出，他认为电子传递过程中，线粒体内膜上的
蛋白质组分发生了构象变化，转变成一种高能形态。
这种高能形态通过将能量转移到ADP合成ATP后，又
得以恢复其原来的构象。随着人们对ATP合酶结构的
研究和认识不断深入，在构象偶联假说的基础上形成
这个假说是 1953 年由 Edward Slater 最先提出。 假说认为在 NADH 氧化和电子传递过程中产生了一种 活泼的高能共价中间物，通过此中间物进一步氧化产 生的能量来驱动 ATP 的合成。这一假说完全是依据底 物水平磷酸化机理提出的，例如在糖酵解中，由 3-磷 酸甘油醛脱氢酶催化的反应就产生了一种活泼且具有 高能磷酸基转移势能的酰基磷酸化合物1，3-二磷酸甘 油，随后其分子中的高能磷酸基团在磷酸甘油酸激酶 的作用下被转移到 ADP 生成 ATP。虽然在糖酵解过程 中存在这种例证，但是人们至今未能在线粒体中分离 到与之相类似的高能共价中间物。
酸化相偶联构成了氧化磷酸化。但是，NADH的氧化
和电子传递过程是如何与 ADP磷酸化生成 ATP反应偶 联起来一直不清楚。
一. 氧化磷酸化的机理
关于这一问题目前至少有三种假说
比较著名的假说有三个：
化学偶联假说
构象偶联假说
化学渗透学说
目前得到公认的是“化学渗透学说”。
化学偶联假说 Chemical coupling hypothesis
分质子化而发生构象改变，积累足够的扭矩力，推动
γε相对α3β3旋转120°，使处于T态的催化部位释放
ATP变成O态，同时L态催化部位上生成ATP变为T态 ，O态结合ADP+Pi变为L态

Boyer


The binding-change model was elegantly supported by two other experimental observations
了ATP合酶结合变化和旋转催化假说。
三. ATP酶-构象偶联假说 ATP合酶结合变化和旋转催化假说认为，ATP合 酶与底物核苷酸的作用是按照结合变化机理进行的。 构成ATP合酶头部的α3β3亚基构成3个催化部位，中 部的γε亚基在质子推动力的驱动下相对于α3β3作旋转
运动。由于3个β亚基与γε亚基的不对称接触，使其分
构象偶联假说 Conformational coupling hypothesis
这个假说是 1964 年由 P.D.Boyer 提出。该假说认 为作为电子传递体的蛋白质有两种不同的构象：低能
构象和高能构象。电子传递的结果使低能构象转变为
高能构象，后者再将能量传递给 F0-F1-ATP 合成酶，
使之也发生构象变化，从而推动 ADP 磷酸化形成 ATP
出腺苷三磷酸（ ATP）是代谢中能量产生和利用
的关键化合物。
一. 氧化磷酸化的机理
1941年Fritz Lipmann引入“高能磷酸键 (～P)”
的概念。 1949 年美国生化学家 Eugene Kennedy 和
Albert Lehninger发现线粒体含有三羧酸循环和呼吸
链所需要的全部酶系统，并且发现生物氧化与ADP磷
耗的分子氧的氧原子数之比。即每消耗 1 个氧
原子所产生的ATP的分子数。
二. 氧化磷酸化的P/O比 测定结果表明： NADH经呼吸链完全氧化时，P/O为 3，即1分子的 NADH通过呼吸链将电子最终传递给O2可产生 3 个ATP；
二. 氧化磷酸化的P/O比
FADH2经呼吸链完全氧化时， P/O为 2，即 1 分子的FADH2通过呼吸链将电子最终传递给 O2可 产生 2 个ATP。
越多的实验证据，因而成为目前解释氧化磷酸化偶 联机理最为公认的一种假说，并且 Peter Mitchell 因提出该假说而获得了1978年的诺贝尔化学奖。
Chemiosmotic hypothesis—key points 电子传递体在线粒体内膜上有着不对称分布，传氢 体和传电子体交替排列，催化是定向的；
。这种假说有一定的实验根据，在电子沿呼吸链流动
时，观察到线粒体内膜发生迅速的物理变化，但由于
测定构象比较困难，支持这个假说的实验太少。
化学渗透学说 Chemiosmotic hypothesis 英国生物化学家 Peter D Mitchell在 1961年提
出化学渗透假说，由于该假说提出后逐渐拥有越来
Asp
1. 解偶联剂
四、氧化磷酸化的抑制
解偶联剂（uncoupler）是指那些不阻断呼吸链的电 子传递，但能抑制 ADP 通过磷酸化作用转化为 ATP 的化
合物。它们也被称为氧化磷酸化解偶联剂。
最早发现的一个解偶联剂是 2, 4- 二硝基苯酚（ 2,
第三节
Oxidative phosphorylation
一. 氧化磷酸化的机理
？
What is oxidative
phosphorylation
氧化磷酸化（oxidative phosphorylation） 是指细胞内伴随有机物氧化，利用生物氧化 过程中释放的自由能，促使ADP与无机磷酸 结合生成ATP的过程。
别处于三种不同的状态，即无核苷酸结合的空臵状态
（O）、结合ADP+Pi的松散结合状态（L）和结合
ATP的紧密结合状态（T）。
Rotation of leads to sequential binding changes for each subunit.