实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用
荧光定量PCR原理及实验步骤精选全文
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荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时qPCR的基本原理是利用DNA模板进行PCR扩增，并通过特定荧光探针或抑制剂标记扩增产物，荧光信号的强度与目标模板数量成正比。
PCR扩增过程中，荧光信号逐渐累积，通过荧光检测系统实时监测荧光的强度变化，可以获取PCR扩增曲线，并通过比较样品的荧光信号与标准曲线建立一个浓度与荧光信号的转换关系，从而确定样品中目标物质的数量。
实时qPCR的操作过程通常包括以下几个步骤：1.准备反应体系：根据所需扩增物质选择合适的引物和探针，并根据样品数量和扩增条件计算所需反应体系的配方。
反应体系中通常包括DNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等。
2.设定PCR程序：根据不同引物的特性和样品的要求，设置PCR程序。
PCR程序通常包括一个初始变性步骤，多个循环变性/退火/延伸步骤和一个终止步骤。
循环变性/退火/延伸步骤的温度和时间通常根据引物的需求进行设定。
3.反应体系装填：将反应体系装入PCR管或耐热反应板中，确保样品和反应物均匀分布。
4.实时监测：将PCR反应体系置于实时荧光PCR仪中，根据设定的PCR程序进行扩增，并实时监测荧光信号的累积变化。
5.数据分析：根据荧光信号的变化情况，可以绘制PCR扩增曲线，并通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值）来确定样品中目标物质的相对数量。
比较不同样品的Ct值，可以进行定量分析。
实时qPCR具有广泛的应用。
1.基因表达分析：可以通过实时qPCR检测特定基因在不同组织或样品中的表达水平，从而研究基因在生理和病理过程中的作用。
2.病原体检测：实时qPCR可以用于快速、准确地检测和鉴定病原体，如细菌、病毒和寄生虫等，对于临床诊断和流行病学研究具有重要意义。
3.检测基因突变：实时qPCR可以用于检测个体中基因突变的存在与否，并进行基因型分析，从而研究与疾病相关的突变和遗传变异。
4.微生物学研究：可以通过实时qPCR检测微生物的数量和动态变化，了解其在环境中的分布和生物地理学特征，以及其在食品安全、环境保护等方面的应用。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR技术的原理及应用在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。
但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。
但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。
例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。
在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。
1.实时荧光定量PCR技术的基本原理在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。
实时荧光定量PCR的原理及应用
实时荧光定量PCR的原理及应用导读实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光集团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。
其特点有：(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。
(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。
Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。
实时荧光定量PCR技术的基本原理在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。
仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。
并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。
一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。
通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R²＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。
实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
实时荧光定量PCR技术的应用1. 基因工程研究领域①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA 水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用引言实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种细胞遗传学和分子生物学研究中常用的分子检测技术。
它能够迅速、准确地进行DNA或RNA的定量测量，并在许多领域中广泛应用，例如基因表达分析、病原微生物检测和病毒定量等。
本文将重点介绍实时荧光定量PCR技术的原理和一些典型应用。
实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是在传统PCR反应的基础上发展而来的一种PCR变体。
其原理可以简单概括为光信号的实时检测和荧光强度的定量分析。
实时荧光定量PCR技术的具体步骤如下：1.引物与探针设计在实时荧光定量PCR反应中，合适的引物和探针设计是至关重要的。
引物用于在反应中特异性地扩增目标DNA或RNA序列，而探针则用于荧光信号的检测。
引物和探针的设计需要确保其与目标序列的亲和力和特异性，以避免非特异性扩增和假阳性结果。
2.标定曲线制备为了进行定量分析，需要事先制备一条标定曲线。
标定曲线通常是通过浓度已知的目标序列的一系列稀释样品制备的。
这些稀释样品经过PCR扩增后，荧光信号的强度与初始浓度呈线性关系。
通过测量待测样品的荧光信号强度，并利用标定曲线进行外推，可以获得目标DNA或RNA的定量结果。
3.PCR反应体系组装PCR反应体系的组装需要考虑到引物和探针的最优浓度，以及反应缓冲液、酶和模板DNA或RNA的最佳配比。
此外，反应体系中还需要加入辅助成分，如酶抑制剂和荧光染料，以提高PCR反应的特异性和灵敏度。
4.实时荧光检测及数据分析在PCR反应进行过程中，荧光信号会随着目标DNA或RNA的扩增而增强。
实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的变化情况，并生成扩增曲线。
通过分析荧光信号的增长速度和荧光信号的峰值，可以确定目标DNA或RNA的起始浓度。
实时荧光定量PCR技术应用1. 基因表达分析实时荧光定量PCR技术在基因表达分析中被广泛应用。
最新实时荧光定量PCR技术的原理及应用RealtimePPT课件
1、SYBR Green 法
SYBR Green 熔解曲线分析
SYBR Green法优缺点
优点:
对DNA模板没有选择性
适用于任何DNA
使用方便--不必设计复杂探针
非常灵敏
便宜
2、TaqMan探针法
TaqMan作用机理
TaqMan法优缺点
Real-time PCR 方法应用
（如孔间、批间温度的波动）
Rn= Normalization = Reporter / Referenc
Rotor gene 6500HRM
特征：
36孔(普通透明0.2mlPCR管)或者72孔
(特殊0.1ml管)
离心式检测
可以做HRM。
MJ Opticon 2
特征：
可以素影响小
内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组
数量
相对定量：参照因子Calibrator
相对定量分析方法1 -ΔΔCt
前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏
差在 5％以内
1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test)
ΔCT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator)
2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率：
2 –ΔΔCT=表达量的比值
相对定量分析方法2：双标准曲线法
谢谢！
结束语
谢谢大家聆听！！！
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实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
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它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
实时荧光定量PCR仪原理和使用方法
实时荧光定量PCR仪原理和使用方法荧光定量PCR仪原理将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
1. 荧光阈值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold= 10*SDcycle 3-152. Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。
现将其原理简述如下：1.TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
实时荧光定量pcr的原理及应用
实时荧光定量PCR的原理及应用1. 简介实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，简称qPCR）是一种强大的分子生物学技术，能够在同一反应体系中完成DNA扩增和定量，具有高灵敏度、高特异性和高精确性的优势。
本文将介绍实时荧光定量PCR 的原理和应用。
2. 原理实时荧光定量PCR基于传统PCR技术的基础上，引入荧光染料或探针来实时监测PCR反应过程中产生的增量扩增DNA量。
其原理如下：1.DNA模板的变性：通过加热将DNA模板的双链DNA变性成两个单链。
2.引物结合：待扩增的特定DNA序列的引物（Forward primer和Reverse primer）与模板DNA的互补序列结合。
3.DNA聚合酶扩增：DNA聚合酶沿着模板DNA链酶解附近的单链DNA，并将新的DNA链合成。
4.荧光信号监测：引入特定的荧光染料（如SYBR Green）或探针（如TaqMan探针），实时监测PCR反应体系中DNA扩增量的变化。
5.数据分析：使用特定的PCR仪器记录和分析荧光信号，根据荧光信号的变化量确定目标DNA序列的起始量。
3. 应用实时荧光定量PCR技术在许多领域中有广泛的应用，主要包括以下方面：3.1 疾病诊断与检测实时荧光定量PCR可以用于快速检测和诊断各种疾病，例如：•新型冠状病毒（COVID-19）检测•癌症标志物的检测•细菌和病毒感染的检测•遗传性疾病的检测3.2 基因表达分析实时荧光定量PCR可以用于研究基因的表达水平，包括：•基因表达差异分析•基因调控网络的研究•基因表达谱的分析•转录因子的研究3.3 环境监测实时荧光定量PCR可以应用于环境监测领域，用于检测和量化环境中的微生物和污染物，例如：•水质监测中细菌和病毒的检测•土壤中污染物降解菌的鉴定和定量•空气中微生物的检测3.4 遗传学研究实时荧光定量PCR在遗传学研究中也有广泛的应用，包括：•DNA定量和质量检测•突变检测和鉴定•群体遗传学分析•基因组学研究4. 总结实时荧光定量PCR技术是一种准确、高效、灵敏的分子生物学技术，广泛应用于医学、生物学、环境科学和农业等领域。
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中添加一种或多种荧光标记的探针，它与目标序列的特定区域互补，当探针与目标序列结合时，荧光信号被激发，产生荧光发射。
随着PCR反应的进行，目标序列的数量增加，荧光信号也随之增强。
通过实时监测PCR扩增过程中的荧光信号强度的变化，可以推断出起始模板的数量。
操作上，实时荧光定量PCR主要分为两个步骤：反转录和PCR。
首先，反转录将RNA逆转录合成cDNA，得到DNA模板。
然后，在PCR反应中，将DNA模板与荧光标记的探针、引物和核酸酶混合，开始PCR扩增。
PCR反应体系中的荧光探针在PCR扩增过程中的特定温度下与目标序列结合，产生荧光信号。
荧光信号被特定的光学设备检测和记录，得出PCR产物的数量。
实时荧光定量PCR具有广泛的应用领域。
在基因表达分析方面，qPCR可以用来定量测量特定基因的转录水平，研究基因的表达模式和差异。
在病原微生物检测方面，qPCR可以快速、准确地检测和鉴定细菌、病毒和寄生虫等病原体。
在遗传疾病诊断和监测方面，qPCR可以检测一些突变、插入或缺失等遗传变异，并进行遗传病的筛查与诊断。
此外，qPCR还可以用于检测和定量分析环境样品中的微生物、植物和动物等生物种群，了解物种多样性、群落结构和生态系统功能。
实时荧光定量PCR的优点包括高灵敏度、高特异性、高准确性和高重复性。
与传统PCR方法相比，qPCR不需要进行凝胶电泳分析，减少了实验操作的时间和手动操作的误差。
另外，荧光定量PCR还可以采用多通道检测不同靶标，提高实验的高通量性。
然而，实时荧光定量PCR也有一些局限性。
首先，荧光标记的探针需要根据目标序列的特点设计，设计不当可能会导致假阳性或假阴性结果。
其次，荧光信号的准确性受到反应物质的浓度和质量的影响，需要进行严格的实验操作和数据分析。
此外，实时荧光定量PCR的设备和试剂比传统PCR更昂贵，需要专业的实验室设施和经验。
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C(t) value
一、原理概述
3.荧光定量PCR所用的荧光报告基团 3.荧光定量PCR所用的荧光报告基团
(1).非特异性荧光标记： (1).非特异性荧光标记： SYBR Green
(2).特异性荧光标记： TaqMan探针 (2).特异性荧光标记： TaqMan探针
Molecular Beacon分子信标 Beacon分子信标
Байду номын сангаас
Ct=
-log X0 + log M log(1+Ex)
(5)
Log（x0的初始模板量）与到达阈值时的循环数（Ct值）呈线 性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出 样品中所含的模板量
一、原理概述
8.荧光定量PCR的数学原理 8.荧光定量PCR的数学原理
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
一、原理概述
8.荧光定量PCR的数学原理 8.荧光定量PCR的数学原理
Sample
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确定未知样品的 C(t)值 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
一、原理概述
9.认识一下荧光定量PCR仪 9.认识一下荧光定量PCR仪
仪器本身的功能： 1、控制参数（温度） 2、控制循环数（时间） 3、记录整个循环过程中的荧光值的变化，在所有的时 间和温度条件下，仪器都会忠实的记录下荧光值的 变化。 荧光定量PCR仪就是通过对所记录的参数来计算样品的初始模板量的。 荧光定量PCR仪就是通过对所记录的参数来计算样品的初始模板量的。
SYBR Green SYBR Green
一、原理概述
4.非特异性荧光染料---SYBR Green的工作原理图解 4.非特异性荧光染料---SYBR Green的工作原理图解
Excitati on Excitati on
5’ 3’
SG
SG SG
S G S G S G S G S G
3’
SG5’
No Emission
优点： (1).对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA (1).对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA (2).使用方便-----不必设计复杂探针 (2).使用方便-----不必设计复杂探针 (3).非常灵敏 (3).非常灵敏 (4).可做熔解曲线分析 (4).可做熔解曲线分析 (5).便宜 (5).便宜 缺点： (1).对引物特异性要求较高 (1).对引物特异性要求较高 (2).与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,干扰实验的准确性, (2).与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,干扰实验的准确性,尤其 是分析表达量不高的基因时,这类情况尤其突出; 是分析表达量不高的基因时,这类情况尤其突出; 需要不断的优化反 应体系,降低非特异性扩增. 应体系,降低非特异性扩增.
一、原理概述
2.定量PCR常用的三个常用概念 2.定量PCR常用的三个常用概念
扩增曲线、荧光阈值、Ct值 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
(1).扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动 (1).扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动 录荧光强度的变化
循环数和荧光值曲线
温度和荧光值曲线
一、原理概述
RoterGene3000型36孔 荧光定量PCR仪，旋转 加热式，不需ROX校正 ABI 7300型96孔荧光定量PCR仪， 由于样品间存在光程差，需ROX校正。
二、操作及结果分析
1、样品的制备
DNA样品，主要是DNA提取，提取的DNA可TE缓冲液溶解后-20度保存；对于RNA样 DNA样品，主要是DNA提取，提取的DNA可TE缓冲液溶解后-20度保存；对于RNA样 品，抽提RNA后要迅速反转录，将RNA反转录为cDNA，TE缓冲液溶解后可-20度保 品，抽提RNA后要迅速反转录，将RNA反转录为cDNA，TE缓冲液溶解后可-20度保 存。 DNA或cDNA样品也不要长期存放，因为在存放过程中会有少量的DNA降解，从而 DNA或cDNA样品也不要长期存放，因为在存放过程中会有少量的DNA降解，从而 影响样品中目的基因的含量。 对于大量的样品最佳的检测方案是： 根据实际情况安排好每天要提取的样品数量，提取后若是RAN立即进行反转录反 根据实际情况安排好每天要提取的样品数量，提取后若是RAN立即进行反转录反 应，并且将当天反转录的样品进行定量PCR检测；千万不可先将所有的样品都提 应，并且将当天反转录的样品进行定量PCR检测；千万不可先将所有的样品都提 取RNA，提取完RNA后再统一反转录，然后在对cDNA样品进行定量检测，千万不要 RNA，提取完RNA后再统一反转录，然后在对cDNA样品进行定量检测，千万不要 这样做，因为RNA是极不稳定的，哪怕是存放于-80度冰箱，一方面RNA极其容易 这样做，因为RNA是极不稳定的，哪怕是存放于-80度冰箱，一方面RNA极其容易 降解从而影响检测的准确性，另一方面万一实验室的超低温冰箱放生故障造成停 机或停电，那所有提取的RNA将会很大程度的降解，对样品造成不可挽回的损失！ 机或停电，那所有提取的RNA将会很大程度的降解，对样品造成不可挽回的损失！ 最好的安排是：当天提取或反转录的样品，当天就进行定量PCR的检测，最大程度的 最好的安排是：当天提取或反转录的样品，当天就进行定量PCR的检测，最大程度的 减少RNA的降解，这样测定的结果才更准确。 减少RNA的降解，这样测定的结果才更准确。
在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) log(1+Ex) *Ct= -log X0 + log M (4)
一、原理概述
6. TaqMan---水解型杂交探针工作原理 TaqMan---水解型杂交探针工作原理
每扩增一 条DNA分子， 释放一个 荧光信号， 可以在循 环过程中 任一点检 测荧光
一、原理概述
7.探针法的优缺点 7.探针法的优缺点
(1).极高的特异性和准确性 (1).极高的特异性和准确性 由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探针 序列的特异性，从两个方面保证了所 扩增基因的特异 性。 (2).良好的重复性 (2).良好的重复性 (3).目前合成价格较贵. (3).目前合成价格较贵. (4).不能做熔解曲线分析. (4).不能做熔解曲线分析.
荧光基团
扩增曲线图： 扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（C ycl e）；纵坐标：荧 光强度
荧光检测元件
每个循环进行一次荧光信号的收集
一、原理概述
2.定量PCR常用的三个常用概念 2.定量PCR常用的三个常用概念
扩增曲线、荧光阈值、Ct值 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
(2).荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 (2).荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设置的原则要大于样本的荧 光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶 段，并且保证回归系数大于0.99。 段，并且保证回归系数大于0.99。 (3).CT值： (3).CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环 PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环 次数。
二、操作及结果分析
2、定量PCR引物及探针的合成 、定量PCR引物及探针的合成
定量PCR所扩增的片段长度一般都不超过300bp，这样才能确保结果更准确；染 定量PCR所扩增的片段长度一般都不超过300bp，这样才能确保结果更准确；染 料法对引物的特异性要求较高，探针法对引物的特异性要求不高，探针法所扩增 的片段长度更短，一般都在200bp以下。引物和探针都要进行Blast分析，以避免 的片段长度更短，一般都在200bp以下。引物和探针都要进行Blast分析，以避免 非特异性扩增。
实时荧光定量PCR的原理、 实时荧光定量PCR的原理、操作及其 PCR的原理 应用
------ 分子生物学实验技术 系列讲座Ⅱ 系列讲座Ⅱ
河南农业大学生命科学研究中心 张志坤 2009.12.7
大纲
一.原理概述 二.操作及结果分析
(一).样品制备 (二).引物及探针的设计与合成 (三).标准品的制备---质粒或纯化后的PCR产物 (四).通道的选择及增益的选择 (五).标准曲线的建立 (六).加样时应注意的细节 (七).阈值的选定 (八).熔解曲线分析 (九).操作流程
一、原理概述
4.非特异性荧光染料---SYBR Green 4.非特异性荧光染料---SYBR 的特性
(1).SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 能结合到双链DNA的小沟部位 (2).SYBR Green 只有和双链DNA结合受激后才发 只有和双链DNA结合受激后才发 荧光 (3).变性时，DNA双链分开，无荧光 (3).变性时，DNA双链分开，无荧光 (4).复性和延伸时，形成双链DNA,SYBR (4).复性和延伸时，形成双链DNA,SYBR Green 发 荧光，在此阶段采集荧光信号。
三.应用
(一).绝对定量分析 (二).相对定量分析及实验方案 (三).SNP检测分析
一、原理概述
1.Real1.Real-Time PCR 概论
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不 仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决 PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增 和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。 常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板 准确定量，无法对扩增反应实时检测。 实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产 物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量 分析。