Ig基因重排信号序列
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在高等真核生物
在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于 启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直 接促进或抑制RNA聚合酶与它的结合。
⑥ 真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过 核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核 生物中不存在这样严格的空间间隔。
⑦ 许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过 程，才能顺利地翻译成蛋白质。
• 在Ig重链基因重排后，轻链的可变区基因片段随之发生 重排，V与J基因片段并列在一起。
• κ轻链基因先发生重排，如果κ基因重排无效，随即发生 λ基因的重排。
重排机制
• 参与V/（D）/J基因重组过程的酶称为V/（D）/J 重组酶。
• 重组酶作用的特点是： （1）淋巴细胞特异性，这可能解释了Ig基因的重排
二、基因扩增
基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使 得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需 要，是基因活性调控的一种方式。
如非洲爪蟾的卵母细胞中原有rRNA基因（rDNA）约500 个拷贝。卵裂期和胚胎期，需要大量的rRNA，基因会大 量复制rDNA，使拷贝数达到200万，扩增约4000倍。
内含子(intron)、外显子(exon) • 非编码区较多 多于编码序列(9:1) • 含有大量重复序列
原核生物基因组结构特点:
● 基因组很小，大多只有一条染色体 ● 结构简炼 ● 存在转录单元多顺反子 ● 有重叠基因
二、真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及 DNA的空间结构方面存在以下几个方面的差异
非洲爪蟾体细胞中rDNA的基因扩增是因发育需要而出现 的基因扩增现象。
发育或系统发生中的倍性增加在植物中普遍存在
基因组拷贝数增加，即多倍性，在植物中是非常普遍的现象。 基因组拷贝数增加使可供遗传重组的物质增多，这可能构成了 加速基因进化、基因组重组和最终物种形成的一种方式。
⑥ 真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过 核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核 生物中不存在这样严格的空间间隔。
⑦ 许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过 程，才能顺利地翻译成蛋白质。
• 在Ig重链基因重排后，轻链的可变区基因片段随之发生 重排，V与J基因片段并列在一起。
• κ轻链基因先发生重排，如果κ基因重排无效，随即发生 λ基因的重排。
重排机制
• 参与V/（D）/J基因重组过程的酶称为V/（D）/J 重组酶。
• 重组酶作用的特点是： （1）淋巴细胞特异性，这可能解释了Ig基因的重排
二、基因扩增
基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使 得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需 要，是基因活性调控的一种方式。
如非洲爪蟾的卵母细胞中原有rRNA基因（rDNA）约500 个拷贝。卵裂期和胚胎期，需要大量的rRNA，基因会大 量复制rDNA，使拷贝数达到200万，扩增约4000倍。
内含子(intron)、外显子(exon) • 非编码区较多 多于编码序列(9:1) • 含有大量重复序列
原核生物基因组结构特点:
● 基因组很小，大多只有一条染色体 ● 结构简炼 ● 存在转录单元多顺反子 ● 有重叠基因
二、真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及 DNA的空间结构方面存在以下几个方面的差异
非洲爪蟾体细胞中rDNA的基因扩增是因发育需要而出现 的基因扩增现象。
发育或系统发生中的倍性增加在植物中普遍存在
基因组拷贝数增加，即多倍性，在植物中是非常普遍的现象。 基因组拷贝数增加使可供遗传重组的物质增多，这可能构成了 加速基因进化、基因组重组和最终物种形成的一种方式。
血小板源性生长因子受体基因重排的研究
氨酸激酶 Ｓｃ 酪氨酸磷 酸酶 Ｓ Ｐ ｒ、 Ｈ ２及 Ｒ ｓ Ａ （ Ｔ ａＧ Ｐ Ｇ Ｐ酶激 活蛋 白） 直接或间接激活下游激酶 ， ， 引起 转录 因子活化 ， 启动靶 基 因的转录。 Ｐ Ｇ Ｒ表达调控不仅 在转 录水 平 ， ＤＦ 在蛋 白水平 也受 到严
皮 细胞 、 平滑肌细胞 的增殖 ， 其受体 在人 巨核 细胞和 巨核细胞 系有表达 。Ｐ Ｇ Ｄ Ｆ一方 面通 过与其 受体 相互 作用刺 激细 胞 的 ｃｆｓ － 的表达 ， ０ 促进 细胞有 丝分 裂 ， 另一方面 它可作用 于骨髓微 环境 的问质细胞 ， 问质细胞产 生更多 的细胞 因子， 使 间接 促进
关键词 ： 血小板源性生长因子 ； 受体 ； 骨髓 增殖性疾病
［ 中图分类号］ ４ １ ［ Ｑ ６ 文献标志码］ ［ Ａ 文章编号］ ０ ９ ２ ３ ２ ０ ）３ １６０ １ － １ （０ ７ ０ —３ — ３ ０ ６
ｌ ＿
血小板 源性 生长 因子（ Ｄ Ｆ 是 血清 中的一种强有丝分裂 ＰＧ ） 原分子 ， 分子质量为 ２ ３ ｕ Ｄ Ｆ可刺激 成纤维细胞 、 ８～ １ｋ 。Ｐ Ｇ 内
３ 由 Ｐ Ｆ －Ｌ ＤＧ Ｒ Ｏ基因重排生成的融合蛋 白
４ １ 括疏 水半 胱 氨酸 丰 富区 Ｃ Ｉ２位 点长 约 ８０ｋ ｑ２包 ＨＣ ０ －ｂ 碱基对 的中间缺失 （ 而非 染色体 易位 ） 导致 ＦＰ Ｌ （ Ｉ １ １ 酵母 蛋 白 Ｆｐ１ ｉ． 样蛋 白） 基因 、Ｄ Ｆ — Ｐ Ｇ Ｒ 基 因断裂 ， Ｆ Ｌ 由 ｌ １的 ２ ３个氨 ２ 基酸和 Ｐ Ｇ Ｒ 的 ５ ３个氨 基酸形 成融合 基 因， 融合基 因 Ｄ Ｆ－ ２ 该 首先被发现 存在 于 急性 嗜酸 粒细 胞性 白血病 （ Ｅ ）细胞株 ＣＬ
皮 细胞 、 平滑肌细胞 的增殖 ， 其受体 在人 巨核 细胞和 巨核细胞 系有表达 。Ｐ Ｇ Ｄ Ｆ一方 面通 过与其 受体 相互 作用刺 激细 胞 的 ｃｆｓ － 的表达 ， ０ 促进 细胞有 丝分 裂 ， 另一方面 它可作用 于骨髓微 环境 的问质细胞 ， 问质细胞产 生更多 的细胞 因子， 使 间接 促进
关键词 ： 血小板源性生长因子 ； 受体 ； 骨髓 增殖性疾病
［ 中图分类号］ ４ １ ［ Ｑ ６ 文献标志码］ ［ Ａ 文章编号］ ０ ９ ２ ３ ２ ０ ）３ １６０ １ － １ （０ ７ ０ —３ — ３ ０ ６
ｌ ＿
血小板 源性 生长 因子（ Ｄ Ｆ 是 血清 中的一种强有丝分裂 ＰＧ ） 原分子 ， 分子质量为 ２ ３ ｕ Ｄ Ｆ可刺激 成纤维细胞 、 ８～ １ｋ 。Ｐ Ｇ 内
３ 由 Ｐ Ｆ －Ｌ ＤＧ Ｒ Ｏ基因重排生成的融合蛋 白
４ １ 括疏 水半 胱 氨酸 丰 富区 Ｃ Ｉ２位 点长 约 ８０ｋ ｑ２包 ＨＣ ０ －ｂ 碱基对 的中间缺失 （ 而非 染色体 易位 ） 导致 ＦＰ Ｌ （ Ｉ １ １ 酵母 蛋 白 Ｆｐ１ ｉ． 样蛋 白） 基因 、Ｄ Ｆ — Ｐ Ｇ Ｒ 基 因断裂 ， Ｆ Ｌ 由 ｌ １的 ２ ３个氨 ２ 基酸和 Ｐ Ｇ Ｒ 的 ５ ３个氨 基酸形 成融合 基 因， 融合基 因 Ｄ Ｆ－ ２ 该 首先被发现 存在 于 急性 嗜酸 粒细 胞性 白血病 （ Ｅ ）细胞株 ＣＬ
第九章 B细胞(2012)
二、抗原识别受体多样性产生的机制
1、组合造成的多样性
2、连接造成的多样性
3、体细胞高频突变造成的多样性
二、抗原识别受体多样性产生的机制
1、组合造成的多样性
理论上Ig V区基因片段的组合加上轻重链组合 后的多样性约为1.9106。
2、连接造成的多样性 ：
各基因片段连接的不精确性：插入、缺失、或核苷 酸替换等 ，增加了BCR和Ig的多样性。
主要事件： 功能性BCR的表达 自身免疫耐受的形成
一、BCR的基因结构及其重排
BCR—膜型免疫球蛋白（mIg)
免疫球蛋白肽链由两部分构成，即可变区（V） 和恒定区（C），由两个基因编码。两个基因 编码一条肽链。 重链V区基因是由三种胚系基因片段V、D、J拼 接而成。 轻链V区基因是由V、J两个基因片段拼接成。 V区基因的下游是编码C区的基因。 V基因是几个基因片段在B细胞发育过程中发生 重排。
（1）T细胞激活信号2 （2）抑制T细胞活化 CD152只表达于活化T细胞，含ITIM。
3、其它黏附分子： ICAM（CD54)、LFA－1
（四）其他表面分子
CD20 ：B细胞特异性标志，是治疗性单抗
识别的靶分子。
CD22：B细胞的抑制性受体 CD32：FcRⅡ，负反馈调节B细胞活化及 抗体的分泌
提高B细胞对Ag刺激的敏感性。
B细胞辅助受体 CD19胞浆区有9个 Tyrosine残基，可募集 信号分子。 抗原刺激诱导补体活 化，产生C3d 。C3d两 端结合抗原和CD21。 CD21与CD19交联，接 近BCR,由CD19分子增强 BCR对抗原敏感性。
CD21：EB病毒受体
（三） 协同刺激分子
BCR的胚系基因
B细胞激活及效应功能
骨髓内阶段由于不接触外来抗原，其主要过程为Ig 基因重排、膜Ig的表达和具有自身反应性受体的B 细胞的清除。
骨髓外阶段是B细胞在外周淋巴组织中接触抗原， 进一步增殖、分化成为记忆细胞和产生抗体的浆细 胞。此过程伴有V区核苷酸高频突变和Ig转类。
骨髓内成熟阶段
骨髓微环境和B细胞成熟 B细胞起源于骨髓多能干细胞，然后分化为定向
对TD抗原的识别 TD抗原的结构复杂，表位繁多且分布无规律 B细胞的BCR能直接识别游离的天然抗原，但针对
其产生免疫应答需要T细胞的辅助 应答特点：
既能引起体液免疫，也能引起细胞免疫 刺激机体产生的抗体以IgG为主 产生免疫记忆
活化、增殖和分化阶段
活化（activation）
B细胞活化也需要双信号刺激 第一信号(抗原特异性信号)：BCR与抗原决定簇结
分化（differentation）
效应阶段
抗体存在于体液中。黏膜下和腺体内浆细胞产生 的分泌型IgA主要存在于黏膜局部及分泌液中。
抗体的效应功能是在与抗原结合后激发的，不同 结构，不同部位和不同类型的抗体具有不同的效 应机制。
对胞外菌的作用 抗毒素作用 抗病毒作用 抗蠕虫作用 免疫损伤
在T、B细胞交界处活化的B细胞进入生发中心，继 续增殖，其轻链和重链V基因发生随机点突变，由 于其突变频率比正常细胞中其他基因突变频率高 106倍，故称体细胞高频突变。
转类(class switching) 血清和其他体液中可检测到五类免疫球蛋白，但
是B细胞受到抗原刺激后最先产生的总是IgM， 然后才转成产生其他类别的Ig，这种现象称为Ig 的转类。
主要为低亲和力的IgM。 参与细胞主要为未致敏的B细胞和Th2细胞。
骨髓外阶段是B细胞在外周淋巴组织中接触抗原， 进一步增殖、分化成为记忆细胞和产生抗体的浆细 胞。此过程伴有V区核苷酸高频突变和Ig转类。
骨髓内成熟阶段
骨髓微环境和B细胞成熟 B细胞起源于骨髓多能干细胞，然后分化为定向
对TD抗原的识别 TD抗原的结构复杂，表位繁多且分布无规律 B细胞的BCR能直接识别游离的天然抗原，但针对
其产生免疫应答需要T细胞的辅助 应答特点：
既能引起体液免疫，也能引起细胞免疫 刺激机体产生的抗体以IgG为主 产生免疫记忆
活化、增殖和分化阶段
活化（activation）
B细胞活化也需要双信号刺激 第一信号(抗原特异性信号)：BCR与抗原决定簇结
分化（differentation）
效应阶段
抗体存在于体液中。黏膜下和腺体内浆细胞产生 的分泌型IgA主要存在于黏膜局部及分泌液中。
抗体的效应功能是在与抗原结合后激发的，不同 结构，不同部位和不同类型的抗体具有不同的效 应机制。
对胞外菌的作用 抗毒素作用 抗病毒作用 抗蠕虫作用 免疫损伤
在T、B细胞交界处活化的B细胞进入生发中心，继 续增殖，其轻链和重链V基因发生随机点突变，由 于其突变频率比正常细胞中其他基因突变频率高 106倍，故称体细胞高频突变。
转类(class switching) 血清和其他体液中可检测到五类免疫球蛋白，但
是B细胞受到抗原刺激后最先产生的总是IgM， 然后才转成产生其他类别的Ig，这种现象称为Ig 的转类。
主要为低亲和力的IgM。 参与细胞主要为未致敏的B细胞和Th2细胞。
NK细胞表面标志无特异性表面标志1、CD562、CD16(FcRⅢ)3、
NK细胞的检测
1、CD56+、CD16+、CD3-
2、细胞毒实验
抗体分子
抗体——生物体最奇妙的分子
●无限的多样性（diversity) ●功能与结构的双重性
可变区——抗原结合 恒定区——生物学效应功能
●分泌型和膜型表达
与抗体有关的诺贝尔奖获得者
1901 1908
1972 1977 1984
1987
二、免疫球蛋白水解片段 Fab Fab
木瓜蛋白酶
木瓜蛋白酶
胃蛋白酶
胃蛋白酶
Fc
F(ab’)
pFc’
三、免疫球蛋白功能区
Ig分子的每条肽链可折叠为 几个球形的功能区，也称结构域， 每个结构域约由110个氨基酸组 成。
• 轻链有两个结构域：VL 和 CL。
• IgG、IgA和IgD均有VH 、 CH1、 CH2 、CH3四个结构域
细胞工程抗体——杂交瘤-单克隆抗体
•简介基因工程抗体
基因工程抗体
通过基因重组改良抗体性能 通过噬菌体抗体库技术研制新
的抗体
基
小分子抗体
因
工
程
改
造
的
抗
体 鼠单抗人源化
基因工程方法研制新的单抗
抗体库技术
抗体库——在原核系统功能性表 达多样性抗体基因(repertoire)
通过多种选择手段筛选出特定性 能的抗体基因
铰 链 区
F 段 CH2 CH2
C
CH3 CH3
C端
1、重链和轻链
重链可分为μ、γ、α、δ、ε链；轻链可分为κ、λ型。
2、可变区和恒定区
（1）重链和轻链N端约110个氨基酸为可变区（variable region,V区)，V区存在3个高变区（hypervariable region,HVR1~3)及4个骨架区（framework region, FR1~4).三个 高变区共同组成Ig 的抗原识别部位，形成与抗原决定基互补 的表位。高变区也称互补决定区（complementaritydetermining region, CD1~3)。
中国医科大学-生物化学-14 基因重组与基因工程
Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤
①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA
对应的链连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链
重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant)
5´ 3´
5´
3´ DNA 5´
3´
3´
5´ 连接酶 3´
5´
3´
5´
3´
5´
5´
3´
5´
3´
Holiday中间体
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´
3´ 5´
3´
3´
5´
5´
内切酶 (ruvC)
5´ 3´
5´ 3´
Hale Waihona Puke 3´5´5´ 3´
5´ 3´ 5´ 3´
5´ 3´
3´ 5´
DNA连接酶
Ⅰ类酶由三种不同的亚基组成，需要Mg2+、 S-腺苷酸甲硫氨酸(SAM)和ATP为辅助因子。这 类酶识别部位复杂，特异性差，通常在识别部位 周围400～7000bp范围内切割DNA。
Ⅲ类酶由二种亚基组成，需要Mg2+、ATP为辅 助因子，DNA切割发生在识别部位周围25～27bp 范围内。
Ⅱ类酶由一种亚基构成，切割DNA仅需要 Mg2+作为辅助因子，DNA切割就发生在特异识 别部位范围内。Ⅱ类酶切割DNA的特异性强， 被分子生物学家广泛研究，通常所指的限制性内 切酶，即指此类酶而言。
例 （一）λ噬菌体DNA的整合
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体DNA和宿主 染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转 录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病 毒 cDNA 的 长 末 端 重 复 序 列 (long terminal repeat, LTR)。
分子生物学课件：第21章 DNA重组及重组DNA技术
➢ 三转三重组的原理要点及其区分。 ➢ 掌握重组DNA技术中常用的工具酶有哪些？常用的
载体有哪些？目的基因分离获取的四种方法？基本 步骤？
DNA重组（DNA recombination）是指不 同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段 的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。
重 组 DNA 技 术 （ recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以 上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖 形成新DNA分子的过程。
3´ 5´ 拼 接
重
组
5´
5´3´ 体
3´
3´ 5´
内切酶
5´3´
(ruvC)
3´5´
3´ 5´
5´
5´ 3´
3´
DNA
片
连接酶 3´ 5´
段
5´ 3´
重
组
3´
体 5´
5´
3´
二、位点特异重组是发生在特异位点 间的DNA整合
➢ 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异 位点间发生的整合。
一、同源重组是最基本的DNA重组方式
➢ 发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组 （ general recombination ） 。 是 最 基 本 的 DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在 两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片 段的交换。
免
间插DNA
疫 球
V片段
RSS
RSS J片段
蛋
单链切开 RAG1 RAG2
白
OH
第一节
自然界DNA重组和基因转移
载体有哪些？目的基因分离获取的四种方法？基本 步骤？
DNA重组（DNA recombination）是指不 同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段 的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。
重 组 DNA 技 术 （ recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以 上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖 形成新DNA分子的过程。
3´ 5´ 拼 接
重
组
5´
5´3´ 体
3´
3´ 5´
内切酶
5´3´
(ruvC)
3´5´
3´ 5´
5´
5´ 3´
3´
DNA
片
连接酶 3´ 5´
段
5´ 3´
重
组
3´
体 5´
5´
3´
二、位点特异重组是发生在特异位点 间的DNA整合
➢ 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异 位点间发生的整合。
一、同源重组是最基本的DNA重组方式
➢ 发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组 （ general recombination ） 。 是 最 基 本 的 DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在 两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片 段的交换。
免
间插DNA
疫 球
V片段
RSS
RSS J片段
蛋
单链切开 RAG1 RAG2
白
OH
第一节
自然界DNA重组和基因转移
抗体测序精确度—抗体多样性及分子基础
抗体多样性及分子基础抗体多样性来源抗体的多样性来源主要有4个，分别是：1、VH, DH 和JH三条链重组成有功能的重链，VL 和VJ (λor κ) 两条链组成有功能的轻链，轻链要么λ型，要么是κ型，二者不会同时出现在同一个抗体上。
2、VDJ基因拼接时，接头的多样性，这个多样性的主要有4种产生方式：1）D基因可以已任一方向在三个开放阅读框中的任何一个中翻译，以产生总共六个可能的肽片段。
2）在重排过程中会形成发卡结构，导致氮核苷酸的增加或者减少，从而增加多样性。
3）VDJ连接机制，可能添加或去除氮核苷酸作为VDJ连接过程的一部分。
有时，几个氨基酸残基的编码序列可能在重组过程中丢失。
4）可以通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的活性来添加或替换氮核苷酸，特别是在构成功能性V区的CDR-H3的VDJ连接的D片段的任一侧上。
据估计，这些氮核苷酸的变化可导致CDR-H3的多样性大于107，包括CDR长度范围从仅仅几个氨基酸残基到超过25个氨基酸残基。
3、体细胞高频突变。
4、类别转换和基因转换。
人类抗体基因组成配系细胞中含有如下抗体基因1、C基因片段（constant gene segment）其编码抗体轻链和重链C区；2、轻链V基因片段（variable gene segment）和J基因片段（joining segment），二者编码轻链可变区；3、重链V、D基因片段和C基因片段（diversity segment），他们编码重链可变区。
上述基因片段位于不同染色体上，呈不连续成簇分布。
如图1所示，人抗体基因中总共有170-176个IGH(Immunoglobulin heavy chain：免疫球蛋白重链)基因，其中有76-84个是有功能的，包括38-46个IGHV基因（重链V基因片段）、23个IGHD基因（重链D基因片段）和9个IGHC基因（重链C基因片段）。
编码k轻链的基因座位于2号染色体的短壁上，k基因座一共有82个基因，由76个IGKV（k 轻链V基因片段）基因和5个IGKJ（k轻链J基因片段）基因组成，大概只有31-36个IGKV 基因参与形成有功能的V k（k型抗体的重链）。