核酸分离纯化的技术原理

核酸分离纯化的技术原理

核酸提取是核酸检测实验的第一步，也是最关键的一步。核酸提取的纯度、产量和质量是影响下游实验的关键。核酸提取主要有两个步骤，分别是裂解和纯化，其中，裂解的目的是通过各种方法裂解细胞，将核酸释放到溶液中，纯化的目的则是将核酸分子从裂解液中特异性地分离出，从而避免裂解液中原有的蛋白分子、脂类、糖类、多肽、其他有机或无机分子对后续核酸检测实验的干扰。在核酸提取过程中还应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；去除其他污染分子。

一、液相核酸分离纯化技术

（一）胍硫氰酸酚-氯仿提取法

盐类通常是核酸样本中最常见的杂质成分，因此，在将核酸样本进行下游处理和分析前，通常需要去除盐类成分。因此，通常需一或多个分离和（或）纯化步骤来使样本脱盐。核酸纯化的常规步骤包括细胞裂解，该步骤通过破坏细胞结构而形成细胞裂解液，同时灭活包括DNA酶和RNA酶在内的细胞内源性核酶，并最终从细胞碎片中获得纯净的核酸样本。有机溶剂-苯酚-氯仿提取法正是基于上述原理最常见的核酸经典提取方法之一。苯酚-氯仿-异丙醇按照一定比例混合后（即：25∶24∶1）可抵制RNA酶活性，从而克服单用苯酚无法抑制RNA酶活性的不足。蛋白、脂质、碳水化合物和细胞碎片可通过提取苯酚和氯仿有机试剂混合物的水相而去除。含有DNA样本的水相可通

过加入2∶1或1∶1比例的乙醇或异丙醇沉淀，最后，沉淀下来的DNA用70%乙醇洗涤并最后溶解于TE缓冲液或无菌去离子水中。异硫氰酸胍（guanidinium isothiocyanate）用于RNA提取的方法最早见于1977年，但是，由于该方法比较繁琐，后来逐步被称之为胍硫氰酸酚-氯仿提取法（guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）代替，该方法可一步完成RNA提取。其基本原理是：硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚-氯仿抽提，使RNA 与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。

（二）碱性提取方法

碱裂解（alkaline lysis）主要用于质粒DNA的肠杆菌DNA提取。其基本原理是：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时沉淀下来。

（三）CTAB提取法

去污剂（表面活性剂）是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去污剂等多种类型，中性去污剂在蛋白提取中应用的较多。十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在

这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生黏多糖的有机体如植物以及某些革兰阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA。

（四）溴化乙锭-氯化铯梯度离心法

大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用方法是氯化铯梯度离心法，它利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状两个性质。溴化乙锭-氯化铯梯度离心法分离质粒和染色体DNA取决于溴化乙锭与线状和闭环DNA分子的结合量有所不同。溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多溴化乙锭，直至达到饱和（每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子）。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA的首选方法。然而，该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法，其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。

二、固相核酸分离纯化技术

目前，大部分商品化的试剂盒均是固相核酸提取试剂。与上述液相核酸提取技术相比，固相核酸提取技术更为快速、高效。固相核酸提取技术通过pH值和缓冲液盐浓度来控制核酸吸附过程。核酸吸附

则主要依赖于下述原理：离液剂条件下可与亲水性基质氢键结合反应，有液条件下则通过与固相阴离子交换剂的离子交换、亲和力大小而达到分离。固相纯化通常通过离心柱完成，与传统方法相比，在离心力的作用下，离心柱纯化核酸的速度更为快捷。硅胶、玻璃粉、硅藻土和阴离子交换剂均是固相核酸提取技术中最常用的固相载体。固相提取主要包括4个关键步骤：细胞裂解、核酸吸附、洗涤、洗脱。

（一）硅胶

硅胶（silicon）可以选择性地吸附DNA是其用于核酸提取的最

基本原理。硅胶的常用类型包括如玻璃粉在内的玻璃颗粒、硅颗粒、玻璃纤维和硅藻土。硅胶纯化的基本原理是基于负电荷DNA骨架与正电荷硅颗粒之间的高亲和力。钠作为阳离子桥吸附核酸磷酸骨架中的负电荷氧。在高盐条件下（pH≤7），钠离子打断水分子氢原子和硅胶中负电荷氧原子之间的氢键，随后，DNA被紧紧地吸附到硅胶分子上，洗涤之后去除所有其他的非核酸杂质。吸附到硅胶分子上的DNA纯品可在低离子强度条件（pH≥7）使用TE缓冲液或去离子水洗脱。除硅胶之外，如尼龙基质等硝化纤维和聚酰胺膜也可结合核酸，但其特异性较低。这些材料通常用于固相核酸转移和杂交基质。此外，聚酰胺膜比硝化纤维更耐受苛刻条件，并且可以可逆地结合核酸分子，还可以在低离子强度缓冲液条件下固定核酸分子。

（二）磁珠

基于磁珠分离的核酸提取方法简便有效，因为可用非常简单的磁场方式分离磁珠。用于核酸提取的磁珠表面通常修饰有与核酸分子具有高亲和力的基团或生物聚合物。磁珠颗粒的表面积越大，其吸附核酸分子的能力越强。不同性质的磁珠的纯化原理略不一致，但是，使用磁珠法提取核酸的最大优点是可自动化。目前，最常见和高效的核酸自动提取仪主要就是基于磁珠法原理，因为，磁珠在磁场条件下可以发生聚焦或分散，从而可彻底摆脱离心等手工操作流程。