酵母双杂交
酵母双杂交基本原理
酵母双杂交基本原理
酵母双杂交是一种常见的遗传学技术，用于研究特定基因在不同基因组或条件下的表达情况。
它是一种具有通用性的分子生物学方法，也是一种被广泛应用的分子生物学技术。
它的基本原理是，将两个酵母株（A和B）分别接种在两个不同的文库中，然后将这两个文库混合在一起。
当酵母株繁殖时，它们之间的交叉种子会产生两类不同的“双杂交”细胞，即A/B和B/A细胞。
由于A/B和B/A细胞之间的遗传特征有所不同，因此可以用特定的试剂对它们进行分离，从而鉴定那些可以在不同基因组中表达的基因。
酵母双杂交
知识创造未来
酵母双杂交
酵母双杂交是一种实验技术，用于研究酵母菌的互作关系和蛋白质相互作用。
该技术基于酵母菌的能力，通过融合两个不同的酵母菌菌株，实现蛋白质的相互作用检测。
酵母双杂交的原理是利用一对可活化转录因子的融合蛋白，一个与实验蛋白A结合，另一个与实验蛋白B结合。
当A和B结合时，转录因子活化，启动报告基因的表达。
这种实验设置允许检测蛋白质A和B之间的相互作用。
通过酵母双杂交实验，可以筛查大量的蛋白质相互作用，从而揭示酵母菌细胞中复杂的信号传导网络。
这种技术被广泛应用于研究酵母菌的生物学过程、蛋白质功能以及疾病机制等方面。
它为揭示蛋白质相互作用网络提供了一种系统的方法。
1。
膜系统酵母双杂交原理
膜系统酵母双杂交原理酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。
大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。
双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。
80 年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（modula r），即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA 结合结构域（DNA binding domain，简称为DB）和转录激活结构域（activation domain ，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。
单独的DB 虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。
而不同转录激活因子的DB 和AD 形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
如酵母细胞的Gal4 蛋白的DB 与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42 融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4 结合位点并激活转录。
Fields 等人的工作标志双杂交系统的正式建立。
他们以与调控SUC2 基因有关的两个蛋白质Snf1 和Snf2 为模型，将前者与Gal4 的DB 结构域融合，另外一个与Gal4 的AD 结构域的酸性区域融合。
由DB 和AD 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“ 诱饵” （bait）和“ 猎物” 或靶蛋白（prey or target protein）。
如果在Snf1 和Snf2 之间存在相互作用，那么分别位于这两个融合蛋白上的DB 和AD 就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因的转录与表达。
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母双杂交系统原理(一)
酵母双杂交系统原理(一)酵母双杂交系统1. 什么是酵母双杂交系统？•酵母双杂交系统是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，用于测试两个蛋白质是否相互作用，并进一步研究其相互作用的特点和机制。
•这个系统基于酵母菌（酿酒酵母或拟南芥酵母）的特性，当两个蛋白质相互作用时，可以触发酵母的生长或表达特定的报告基因。
2. 酵母双杂交系统的原理•酵母双杂交系统基于两个重要的分子域：DNA结合域（DBD）和激活域（AD）。
•DBD通常来自于一个转录因子，可以与DNA结合并调节基因的转录水平。
•AD则是一个激活域，可以与其他蛋白质相互作用并激活报告基因的表达。
•在酵母双杂交系统中，将待测蛋白的DBD与一个对照蛋白的AD 融合，构建成DBD-融合蛋白，而待测蛋白的AD与一个对照蛋白的DBD融合，构建成AD-融合蛋白。
•当两个融合蛋白相互作用时，DBD和AD相互结合，激活报告基因的表达，从而观察到酵母生长或报告基因的表达。
3. 酵母双杂交系统的应用•酵母双杂交系统广泛应用于蛋白质相互作用和功能研究领域。
•可以用于筛选蛋白质相互作用的伙伴，发现新的蛋白质复合物。
•可以用于研究蛋白质的亚细胞定位和功能等特性。
•可以用于研究蛋白质结构和功能的变异。
•可以用于研究蛋白质与其他生物分子（如DNA、RNA、小分子化合物等）的相互作用。
•可以用于研究蛋白质的信号传导途径和调控机制。
4. 酵母双杂交系统的优缺点优点：•酵母双杂交系统是一种简单、快速、高通量的方法，可以同时测试多个蛋白质相互作用。
•可以研究蛋白质相互作用的强度和特异性。
•可以在活细胞环境下进行研究，更接近生物体内的情况。
缺点：•酵母双杂交系统可能存在假阳性和假阴性的问题，需要进行进一步的验证。
•酵母双杂交系统对蛋白质的折叠状态和局部结构要求较高，对于某些复杂蛋白质可能不适用。
•酵母双杂交系统无法直接观察蛋白质相互作用的动力学过程，只能得到静态的结果。
总结酵母双杂交系统是一种重要的蛋白质相互作用研究方法，基于酵母菌的特性，通过构建融合蛋白实现对蛋白质相互作用的测试。
酵母双杂交的原理及其应用
酵母双杂交的原理及其应用1. 引言酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，可以用于研究蛋白质相互作用、识别蛋白质结构域、筛选靶蛋白等。
本文将介绍酵母双杂交的原理及其在科研和药物研发领域的应用。
2. 酵母双杂交的原理酵母双杂交利用酵母细胞中的转录激活因子（TF）和DNA结合域（DBD）的相互作用来探测蛋白质的相互作用。
该技术主要包括两个重要组成部分：诱饵（bait）与猎物（prey）。
2.1 诱饵（bait）诱饵通常是感兴趣蛋白质的DNA结合域（DBD），可以通过基因工程方法将其与转录激活因子（TF）融合，并构建到酵母细胞中。
2.2 猎物（prey）猎物是待测蛋白质，可以将其与激活域融合，并构建到酵母细胞中。
2.3 相互作用检测当诱饵与猎物相互作用时，其融合蛋白质能够形成转录激活复合物。
该复合物能够通过激活报告基因（如LacZ或荧光蛋白）的表达来检测相互作用的发生。
3. 酵母双杂交的应用酵母双杂交技术在科研和药物研发领域有广泛的应用。
3.1 蛋白质相互作用的研究酵母双杂交技术可以用于筛选和验证蛋白质相互作用的目标。
通过构建不同的诱饵和猎物，可以识别和验证蛋白质相互作用的蛋白质。
3.2 靶蛋白筛选酵母双杂交技术可以用于筛选潜在的靶向蛋白质。
通过将蛋白质库（library）与诱饵进行组合，可以筛选出与诱饵相互作用的猎物，进而识别潜在的靶向蛋白质。
3.3 药物研发酵母双杂交技术可以用于药物研发的初步筛选。
通过将化合物库与诱饵进行组合，可以筛选出与诱饵相互作用的化合物，进而确定潜在的药物候选物。
3.4 蛋白质结构域识别酵母双杂交技术可以用于识别蛋白质的结构域。
通过将蛋白质的不同结构域与诱饵进行组合，可以确定某个结构域的相互作用蛋白质。
4. 结论酵母双杂交是一种有效的蛋白质相互作用研究方法，广泛应用于科研和药物研发领域。
通过酵母双杂交技术，可以识别蛋白质相互作用、筛选靶蛋白等，为蛋白质相关研究和药物研发提供了有力的工具。
《酵母双杂交系统》课件
01
明确研究目标，确定需要验证的蛋白间相互作用或筛选与特定
蛋白相互作用的候选蛋白。
挑选合适的酵母菌株
02
根据研究目的选择适合的酵母菌株，如用于筛选候选蛋白的酵
母菌株或用于验证已知相互作用蛋白的酵母菌株。
构建诱饵和猎物蛋白的表达载体
03
将目的蛋白分别克隆到酵母表达载体上，构建诱饵和猎物蛋白
的表达载体。
应用领域
蛋白质互作网络研究
利用酵母双杂交系统可以大规模地筛选蛋白质之间的 相互作用，构建蛋白质互作网络。
疾病机制研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，有助于深入了解 疾病的发生和发展机制。
药物靶点发现
发现新的药物靶点，为药物研发提供新的思路和方向 。
02
酵母双杂交系统的实验流程
准备阶段
确定研究目的
基因表达调控研究
研究转录因子与DNA的结合
利用酵母双杂交系统可以筛选与特定DNA序列结合的转录因子，进而研究其在基因表达调控中的作用 。
发现新的转录因子
通过与已知转录因子的相互作用筛选，可以发现新的转录因子，进一步揭示基因表达调控的机制。
药物发现与设计
寻找药物靶点
利用酵母双杂交系统可以筛选与药物作用靶点相互作用的蛋白质，为药物发现提供潜在 的靶点。
对生命科学领域的影响与贡献
促进基础研究
酵母双杂交系统作为一种强大的研究工具，有助于深入揭示生命 过程的奥秘，推动生命科学领域的基础研究。
疾病机制与治疗研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，为疾病机制的解析和药物研发 提供有力支持。
生物技术产业
酵母双杂交系统的应用有助于推动生物技术产业的发展，如新药发 现、生物制品开发等。
酵母双杂交实验报告
酵母双杂交实验报告一、实验目的酵母双杂交技术是一种用于研究蛋白质之间相互作用的分子生物学方法。
本次实验的目的是通过构建酵母双杂交载体，转化酵母细胞，筛选出与目标蛋白相互作用的蛋白质，从而深入了解蛋白质在细胞内的功能和调控机制。
二、实验原理酵母双杂交系统基于真核转录调控因子的结构和功能特点。
转录调控因子通常由两个结构域组成：DNA 结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。
这两个结构域单独存在时不能激活转录，但当它们在空间上足够靠近时，则能够协同作用，激活报告基因的表达。
在酵母双杂交系统中，将编码目标蛋白（“诱饵”蛋白）的基因与BD 构建融合表达载体，将待检测的蛋白（“猎物”蛋白）的基因与 AD 构建融合表达载体。
如果“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，那么 BD 和 AD 就能够在空间上靠近，从而激活报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达情况，就可以判断“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白是否存在相互作用。
三、实验材料与试剂1、菌株与载体酵母菌株：AH109载体：pGBKT7（含 BD 序列）、pGADT7（含 AD 序列）2、工具酶与试剂盒限制性内切酶：EcoRI、BamHI 等T4 DNA 连接酶质粒提取试剂盒PCR 试剂盒3、培养基YPD 培养基SD 缺失培养基（Leu、Trp、His、Ade 等）4、试剂氨苄青霉素卡那霉素XαGal3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）5、实验仪器恒温培养箱离心机PCR 仪电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、目的基因的扩增通过 PCR 技术从 cDNA 文库或基因组 DNA 中扩增出目标蛋白和待检测蛋白的编码基因。
设计合适的引物，在引物的 5'端引入限制性内切酶的酶切位点。
2、载体的构建分别用限制性内切酶对目的基因和载体进行双酶切，然后通过 T4 DNA 连接酶将目的基因连接到载体上。
将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选出阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证。
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实验基本步骤
• 将已知基因与合适的DNA结合结构域（BD DNA序列）融合，构建成诱饵载体，转入 缺乏报告基因启动子的酵母菌菌株中，选 择被转化的菌株（Y2H）。
• 将未知基因与合适的转录叶草型的菌体，并诱导下游的 报告基因表达，能够在缺陷型培养基上生长。
两种重组质粒（含有目的基因（bait）+BD DNA序列、cDNA（prey）+AD DNA序列）分 别转入不同酵母菌中的。
AD+cDNA
BD+prey
在共培养的过程中会形成BD-Bait和AD-prey蛋白， 由于bait和prey之间的相互作用，使得BD、AD 彼此靠近，并激活报告基因的表达，使得该酵 母菌在不同的营养缺陷的培养基上表现出不同 的结果。
• 挑取生长在四缺上的菌株提质粒，测序， 基因组比对，在进行后续工作。
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谢谢
此时酵母菌通过蛋白的相互作用彼此粘合在一起
• 其中报告基因中包含控制-ade、-leu、-trp、 -his、MEL1、ABA等基因，Biat和Prey的结 合会导致BD、AD在空间上的拉近，具有激 活下游报告基因表达对功效。
• 当报告基因转录后，该菌株就能在一缺、 二缺、三缺、四缺培养基上生长。 （其中biat和prey结合的紧密程度，决定了其 是否能够激活更多的报告基因的表达）
筛选阳性酵母的方法：在培养基中加入x-α-gal
X-α-Gal是一种酵母半乳糖酶 (MEL1) 的显色底物， 用于在培养基上直接检测GAL4系统的酵母双杂交作用。 通过蓝白颜色筛选，快速和简便地识别阳性的蓝色克
隆。
MEL1是GAL4酵母双杂交系统的一个报告基因
自激活现象——假阳性
一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游
活化序列（UAS）结合，但不能引起转录。
然而，将一段具有转录激活活性的基因构
建到BD载体上，若其表达产生的 BD 单独与
UAS 结合也为酵母双杂中的自激活现象
自激活原理
GAL4BD Transcription factors
X
X
r e p o r t e r g e n e
酵母双杂交
蛋白质————蛋白质
基本思想
• 酵母双杂交是1989年由Fields提出并研究酵母 菌的Gal4转录因子。 • Gal4转录因子包括两个彼此分离的结构域， DNA-BD——DNA结合域（能够识别位于Gal4效 应基因的上游活话序列UAS）；AD——转录激 活域（识别转录机构中的其他成分） • DNA-BD、AD单独作用不能激活转录反应，但 是当二者在空间上充分接近时，呈现完整的 Gal4转录因子活性，启动下游基因的表达。