大肠菌群最可能数MPN检索表
样品中大肠菌群的测定完美版PPT
3.分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置 36℃±1℃温箱内，培养18h~24h，然后取出，观察菌落形 态并做革兰氏染色和证实试验。
4.证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1个~2个进行革 兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃的温箱内培 养24h±2h，观察产气情况。
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在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1个~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃的温箱内培养24h±2h，观察产气
情况3。
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实验十五 样品中大肠菌群的测定
大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、 需氧盒兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该 菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染 指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否 染肠道致病菌的可能。
样品中大肠菌群系以100mL（g）检样内 大肠菌群最可能数（MPN)表示。
设备和材料： 恒温培养箱（36℃±1℃ ）、恒温水浴锅（46℃±1℃ ） 、
③另取1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液。 ④根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀 释度，每个稀释度，接种3管。
2. 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以 上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单料 乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置36℃±1℃温箱内， 培养24h±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为 大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行。
大肠菌群检测标准常见菌落形态及最大近似值MPN法检测的注意要点
大肠菌群检测标准、常见菌落形态及最大近似值MPN 法检测的注意要点一、大肠菌群概述：大肠菌群(Coliform bacteria)是指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中是否有污染肠道致病菌的可能。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界中广泛存在。
调查研究表明，大肠菌群多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方。
人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因之一，粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则大肠菌群的其他菌株较多。
二、检测方法：大肠菌群检测的关键在于方法的选用，食品中大肠菌群检测有两种表示方法，其一是以100mL(g)检样内大肠菌群最大可能数(MPN)表示，检测方法需使用GB/T 4789.3-2003《食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》；其二以每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值表示，检测方法需使用GB 4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。
GB/T 4789.3-2003《食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》虽然被后更新的方法代替，但卫生部关于规范食品中大肠菌群指标的检测工作公告(2009年第16号)明确指出，为规范食品中大肠菌群指标的检测工作公告如下：现行食品标准中规定的大肠菌群指标以“MPN/100克或MPN/100毫升”为单位的，适用《食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》(GB/T 4789.3-2003)进行检测;以“MPN/克或MPN/毫升”、“CFU/克或CFU/毫升”为单位的，适用《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》(GB/T4789.3-2008)进行检测。
后GB/T 4789.3-2008被GB 4789.3-2016替代，故检测样品前需根据产品标准认真选择方法。
例如，GB/T2717-2003酱油卫生标准中对大肠菌群的要求需使用方法一GB/T 4789.3-2003。
大肠菌群检测MPN法与平板计数法比较
大肠菌群检测MPN法与平板计数法比较！GB4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中规定了大肠菌群计数的MPN法与平板计数法，那这两种方法怎么选择以及有什么区别呢？今天小编就跟大家安利一下~二者范围不同：GB4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》范围中规定：“本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数；第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。
”这里所说的含量高低通常以100CFU为准，即含量低于100CFU采用MPN 法，含量高于100CFU采用CFU法。
概念不同：•MPN（most probable number）法：即最近似数法，也称为最可能数法，是食品检验中常用的方法。
1915年，McCrady首次发表了用MPN法 (最大可能数法) 来估算细菌浓度的方法，这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。
•平板计数法 (colony forming units）：CFU 即菌落形成单位，样品经过处理培养后我们数出平板上所生长出的菌落个数，从而计算出每毫升或每克待检样品中可以培养出多少个菌落，以CFU/ml或CFU/g报告之。
•滤膜法（membrane filter method）：将一定量水样注入已灭菌的微孔薄膜的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴于培养基上，经培养后计数和鉴定滤膜上生长的菌落，依据过滤水样计算每升或每100毫升水样中的菌落总数。
•菌落：是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
原理不同：•MPN法：利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
因为细菌在样本内的分布是随机的，所以检测细菌时，可应用概率理论计算菌数，实验结果以MPN值表示，但MPN值并不能表示实际菌落数，实际菌落数有可能落在置信区间内的任何一点，MPN值是落在这个置信区间内概率最大的一点。
mpn法测大肠菌群实验报告
mpn法测大肠菌群实验报告 MPN 法测大肠菌群实验报告一、实验目的大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一。
本次实验旨在采用MPN 法（最可能数法）准确测定样品中的大肠菌群数量，以评估样品的卫生状况，并为相关产品的质量控制提供科学依据。
二、实验原理MPN 法是基于统计学原理，利用一定数量的样品在特定条件下培养后，根据阳性管数来推算样品中大肠菌群最可能数的一种方法。
大肠菌群在特定的培养基中生长并发酵乳糖产酸产气，通过观察培养基的变化来判断是否存在大肠菌群。
三、实验材料与设备（一）实验材料1、待检样品：＿____2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤培养基3、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤培养基（二）实验设备1、恒温培养箱：能够保持温度在 36℃±1℃。
2、无菌移液管：1mL、10mL 规格。
3、无菌培养皿4、超净工作台四、实验步骤（一）样品处理1、固体样品：称取 25g 样品，加入 225mL 无菌生理盐水，充分均质。
2、液体样品：用无菌移液管吸取 25mL 样品，加入 225mL 无菌生理盐水，混匀。
（二）初发酵试验1、用 10mL 无菌移液管吸取 10mL 样品匀液，注入 3 支装有 10mL LST 肉汤培养基的试管中，另用 1mL 无菌移液管吸取 1mL 样品匀液，注入 3 支装有 10mL LST 肉汤培养基的试管中，再用 1mL 无菌移液管吸取 1:10 的样品匀液 1mL，注入 3 支装有 10mL LST 肉汤培养基的试管中。
2、将接种后的 LST 肉汤培养基放入 36℃±1℃恒温培养箱中培养24h±2h，观察产气情况。
（三）复发酵试验1、对初发酵试验中所有产气的 LST 肉汤管进行转种。
用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物一环，移种于 BGLB 肉汤管中。
2、将 BGLB 肉汤管放入 36℃±1℃恒温培养箱中培养 48h±2h，观察产气情况。
gb7101标准中大肠菌群标准
gb7101标准中大肠菌群标准1目的规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。
2范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
3术语和定义3.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
4责任质量部组织制订、化验室负责实施。
5内容5.1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
5.1.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
5.1.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
5.1.4 天平：感量0.1 g。
5.1.5 均质器。
5.1.6 振荡器。
5.1.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
5.1.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
5.1.9 无菌培养皿：直径90 mm。
5.1.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
5.1.11 菌落计数器。
5.2培养基和试剂5.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。
5.2.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。
5.2.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。
5.2.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。
5.2.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。
5.2.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。
5.2.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。
5.3大肠菌群MPN 计数法5.3.1 检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
大肠菌群MPN 计数
第一法大肠菌群MPN 计数操作步骤6.1、样品的稀释6.1.1、固体和半固体样品：称取25g 样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，或放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。
6.1.2、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3、样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。
6.1.4、用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.1.5、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1 次，换用1 支1ml无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。
6.2、初发酵试验每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST 肉汤）, 36℃±1℃ 培养24h±Zh ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。
记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。
未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。
6.3、复发酵试验用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管中，36℃±1℃ 培养48h±2h ，观察产气情况。
大肠菌群计数方法
版本:A/1 日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题： 大肠菌群计数方法文件修改记录分发号 : ______(仅适用于控制文件) (仅盖有红色印章的文件才有效)版本 修订次数 修订日期 修 订 内 容0 0 2011-02-14 A 1 2012-05-25 修订版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 2 of 12标题：大肠菌群计数方法1.0目的规定大肠杆菌计数的方法。
2.0适用范围适用于加多宝凉茶、浓缩汁或原辅材料中的大肠杆菌群的计数。
3.0术语3.1大肠菌群：一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧格兰仕隐形无芽孢杆菌。
3.2MPN最可能数（most probable number）：基于泊松分布的一种间接计数方法。
4.0职责4.1质检部：负责按此方法对加多宝来凉茶、浓缩汁或原辅材料中大肠菌群进行计数。
5.0流程图见附录A、附录B。
6.0内容及要求6.1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：6.1.1恒温培养箱：36℃±1℃6.1.2冰箱：2℃-5℃6.1.3恒温水浴箱：46℃±1℃6.1.4天平：感量0.1g6.1.5振荡器6.1.6无菌吸管：1ml（具0.01刻度）、10ml（具0.1刻度）或微量移液器及吸头。
6.1.7无菌锥形瓶：容量500ml6.1.8无菌试管：18×200ml6.1.9小导管6.1.10无菌培养皿：直径90mm6.1.11菌落计数器6.2培养基和试剂6.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤6.2.2煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 3 of 12标题：大肠菌群计数方法6.2.3乳糖胆盐发酵培养基（LBB）6.2.4乳糖蛋白胨培养基（LPB）6.2.5伊红美蓝琼脂培养基（EMB）6.2.6结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）6.2.775%乙醇溶液6.2.8无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min6.3大肠菌群MPN计数法6.3.1加多宝凉茶、浓缩汁等产品及原辅材料中大肠菌群的测定6.3.1.1样品稀释a、固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。
实验二大肠菌群的检验
质控： 此培养基呈紫色，可有细微沉淀。质 控菌株接种后，35℃培养18～24小时， 观察结果应如下表所示：
菌株
菌号
生长情况
菌落
产气肠杆菌 大肠埃希氏菌 肺炎克雷伯氏菌 奇异变形杆菌 鼠伤寒沙门氏菌 金黄色葡萄球菌
ATCC 13048 ATCC 25922 ATCC 13883 ATCC 25933 ATCC 14028 ATCC 25923
单料乳糖胆盐发酵管 稀释样品（9ml）
制EMB平板
（二）应灭菌消毒的器材
剪刀1把 不锈钢药匙1把 滴管胶头5只 称量纸适量
（三）应制备的培养基
培养基
总量 所用容器
蒸馏水
225ml
500ml三角瓶
蒸馏水 9ml/ 3支 27ml 18×180mm试管（稀释样品）
乳糖胆盐发酵管（单料）： 10ml/ 9支
加琼脂加热溶解，再调pH=7.2-7.4,再加入伊红,美蓝水溶液, 高压灭菌115℃、15分钟。
Hale Waihona Puke 蛋白胨提供细菌生长发育所需的氮源、维生素和氨基酸，乳糖提供发酵
所需的碳源，磷酸氢二钾维持缓冲体系，伊红Y和美蓝抑制绝大部分革兰 氏阳性菌的生长。琼脂是凝固剂。
大肠杆菌在EMB上发酵乳糖，形成黑色菌落，大部分有金属光泽。沙门 氏菌形成无色菌落。金黄色葡萄球菌基本上不生长。
大肠杆菌测定——革兰氏染色
基本步骤：
将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液， 染1min，水洗； 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗； 滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色 液被洗掉，不要过分脱色，水洗； 滴加番红复染液，复染1min，水洗、待 干、镜检。
结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴 性菌呈红色。
大肠菌群的测定
大肠菌群的测定一、目的要求1、学习测定水中大肠菌群检测程序、方法。
2、掌握大肠菌群检测结果的报告方式。
二、实验原理大肠菌群是评价水质好坏的一个重要卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48h内发酵乳糖并产酸产气。
食品中大肠菌群数是以每100 mL（g）检样内大肠菌群最近似数（The most probable number，简称MPN）表示。
据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均应以100 mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。
检查大肠菌群数，一方面能表明食品中有无粪便污染，另一方面还可以根据数量的多少，判定食品受污染的程度。
我国生活饮用水卫生标准中规定1L水样中总大肠菌群数不超过3个。
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一杜氏小导管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
三、实验器材培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤。
器皿：1mL吸管、10mL吸管、试管（15×150）、500mL三角瓶、酒精灯等。
四、操作方法大肠菌群MPN计数的检验程序：1、检样稀释（1）以无菌操作将水样25 mL放于装有225mL灭菌蒸馏水的三角锥瓶内，经充分振摇制成（1:10）的均匀稀释液。
（2）用1 mL灭菌吸量管吸取（1:10）稀释液1 mL，注入含有9 mL灭菌水试管内，振摇试管混匀，作成（1:100）的稀释液。
（3）另取1 mL灭菌吸量管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌吸量管。
2、初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL，36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。
大肠菌群测定—食品中大肠菌群的测定方法
培养特性： 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄 糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃， 在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。
➢ 在普通营养琼脂上有3中菌落形 态：
➢ 1）光滑型：菌落边缘整齐， 表面有光泽、湿润、
➢ 光滑、呈灰色，在生理盐水 中易分散；
计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳 糖胆盐发酵管。
•
接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml
以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠
杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。
• 置36±1℃温箱培养24±2小时，如所有发酵管 都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产 气者，则与对照的混合菌种一起按下列程序进 行。
4、 大肠菌群最可能数（MPN ）的报告
➢ 根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表（见附录
B ) ，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的 MPN 值。 ✓注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，
表内的数也应相应减少或增加。
大肠杆菌 0157显色 培养基上 的菌落
在伊红美兰乳糖琼脂（EMB）上
大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征
设备和材料
食品中大肠菌群测定
参考 GB4789．3-2010
➢主要由肠杆菌科中埃希氏菌属、肠杆菌 属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属 的Ⅲ亚属细菌组成。
3、大肠杆菌的生物学特性
基本形态
此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.50.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但 不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛， 但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体 动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微 荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良 好，革兰氏染色阴性。